Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4D lên mẫu cây lá Kim Ngân (Lonicera japonica Thunb)

Nam trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nóiriêng thì việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy môcông nghiệp để có thể nâng cao năng

1.1 Đặt vấn đề

Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân

(Caprifolianceae) là cây dược liệu chứa tanin và một saponin Hoa chứa mộtflavonoid là scolymosid lonicerin và một số carotenoid ( caroten, cryptoxanthin,auroxanthin) Quả mọng giàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin Lá chứamột glucosid gọi là loganin và khoảng 8% tanin

Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc

Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim NgânHoa có tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt vàlàm tăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinhcường độ bằng 1/6 của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dịch vịvà mật

Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch

tán và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tácdụng kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cậnthương hàn, liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả Tác dụng yếu hơn đối vớicác trực khuẩn bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng Nước sắc lá KimNgân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chếtrực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn(Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam)

Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trị ung thư trongĐông và Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáptrạng, trực tràng,

Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ứng dụng trong mỹ phẩm, cho cảnh đẹp,hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thunhiệt của ánh nắng mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành

tre, mành nhựa và mái tôn chống nóng Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO2), nhảdưỡng khí (O2) làm sạch môi trường, tạo bầu không khí trong lành

Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạngvới số lượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vậtvà là thị trường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xuthế mỹ phẩm dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đãchiếm 90% tổng số mỹ phẩm được sản xuất

Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dượcliệu, nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bấtcập

Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếusản xuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thếmạnh của Việt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưuhành trên thị trường cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyênliệu dược liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thị trường làhàng nhập lậu

Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu hiện nay vẫn chưa đượckiểm soát (trên 50% mẫu kiểm tra không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ nàyvới các loại thuốc từ dược liệu là 10%

Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự quy hoạch tập trung,thiếu sự hỗ trợ căn cơ từ nhà nước khiến thị trường dược liệu không ổn định, câydược liệu vì thế cũng không phát triển

Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách khâu kỹ thuật sản xuấtdẫn đến tình trạng các cây dược liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng– giá cả ổn định để cạnh tranh được với dược liệu nhập khẩu Như vậy với giá trị to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt

Nam trong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nóiriêng thì việc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy môcông nghiệp để có thể nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gianngắn nhất đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ cho thị trường Việt Nam và trên thế giớilà điều hết sức cần thiết.

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro.

Đồng thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trịdược lý trong cây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệpdược

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấylá của cây Kim Ngân

2.1 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1 Khái niệm

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức

nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ởđiều kiện vô trùng Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muốikhoáng, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002)

2.1.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối vớinghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp chothực tiễn sản xuất và đời sống

2.1.2.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chấtcủa sự sống

Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tínhcủa cơ thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luậtvề mối tương quan giữa các bộ phận trong cây

Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồitừ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thểkích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi định hướng

ở mức độ tế bào (trước khi cho ra cây hoàn chỉnh)

Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể vàchính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể Bằng phương pháp nuôi cấy mô,chúng ta có thể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phátsinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt Từ đó có thể tìm ra các mấu chốtthúc đầy sự phát triển của cây trồng theo chiều hướng mong muốn

Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiếnhành nghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ Từ đó, người ta

tìm ra được những cơ chế miễn dịch thực vật Khi con người hoàn toàn làm chủđược cơ chế này thì các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việcchống bệnh sẽ trở nên đỡ tốn kém hơn rất nhiều.

2.1.2.2 Về mặt thực tiễn sản xuất

Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy môcòn có những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống

Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuậtsản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng Những lợiích trong việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệpđược tóm tắt như sau:

 Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy môhay nuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễmbệnh hay mang mầm bệnh

 Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen củagiống đem vào sản xuất

 Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thuhoạch

 Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩmcuối Sự đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thuhoạch Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồngnhất, tạo điều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến

Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớntrong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cáchmạng xanh trong ngành trồng trọt

2.1.3 Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro

Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975,

Anonymous, 1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kooij, 1984):

Kunneman- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.

 Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn

do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được

cây sạch bệnh vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vàonuôi cấy, đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầmbệnh trước khi đưa vào môi trường nuôi cấy Các cây sạch bệnh này có thểđược trao đổi dễ dàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ vàkhông trồng trong đất

 Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho

nên có thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng

 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn

dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanhnăm

 Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân

giống kế tiếp

 Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy

 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân

Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có

những bất lợi sau:

 Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy

 Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thựchiện

 Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với mộtsố cây

 Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấncông bởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng

Vì vậy, cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận

 Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo vàhuyền phù tế bào được lặp lại nhiều lần

 Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thựchiện

 Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá

thành của cây tăng lên

2.1.4 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnhvực như:

 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp(nuôi cấy tế bào trần)

 Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tếbào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid,glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệpthực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trongnông nghiệp

 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành câycon thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn).

 Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn)

 Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại

 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp

 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử

 Nuôi cấy quang tự dưỡng

2.1.5 Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 2.1 Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Nguồn gốc mẫu cấy Kích thước Mẫu được tách

Đỉnh sinh trưởng 0,5 – 1 mm Tế bào đỉnh sinh trưởng

Chồi đỉnh 0,5 – 1 cm Chốp đỉnh có chứa mộtphần thân

Chồi bên 0,5 – 1 cm Chồi bên có chứa mộtphần thân, lá và chồi

náchMẫu lá 0,2 – 0,3 cm Mẫu lá được cắt nhỏ,phân nửa được cấy chìm

vào môi trườngPhiến lá 0,2 – 1 cm Phiến lá non được đặttrên môi trường, mặt dưới

đặt trên mặt thạchRễ 0,5 – 1 cm Mẫu rễ được đặt trên mặt

thạchDạng củ hành 1 – 2 cm Mẫu được đặt trên mặthay được cấy chìm phân

nữa vào môi trường

Hạt phấn 0,1 – 0,5 mm Hạt phấn trong túi phấn

2.1.6 Các bước nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau:

2.1.6.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống Cây mẹ phảisạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăngtrưởng

Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thờiđiểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ

Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấyvô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồmrửa mẫu và khử trùng mẫu cấy

+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửamẫu bằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy

+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khửcác nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy Dung dịch thường được sử dụng đểkhử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium,oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân Khi thêm Tween 20(polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tănghiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật nhưvậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn

+ Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùngtrong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, nhữngphần bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kíchthước thích hợp

+ Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cáchbổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫubằng các chất này trước khi khử trùng

+ Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từkhi bắt đầu nuôi cấy Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu

ngày mẫu sẽ chết Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa mộtlượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol Các mô non thường ít bị hóanâu hơn mô trưởng thành hay mô già Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạtđộng của enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase vàtryosinase), nó được tổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốtquá trình cắt và khử trùng mẫu.

Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâulà dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra Lượngthường dùng 0,5 – 5 g/l Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinylpyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 –ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol

Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt độngmạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảmđược hiện tượng hóa nâu

Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượnghóa nâu của mẫu cấy nên:

 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non Gây vết thương trên mẫu với kíchthước nhỏ nhất

 Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vàomôi trường

 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánhsáng trong 1 – 2 tuần đầu

 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấpsang môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao

 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắtđầu nuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ

2.1.6.2 Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo

thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.

Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của

cây trồng Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống,người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo

Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 vàcác chất hữu cơ khác

2.1.6.3 Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phươngpháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống.Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống vớimôi trường tạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợpvới quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình

tăng sinh được nhanh Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được

duy trì trong thời gian vô hạn

2.1.6.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bịchuyển ra vườn ươm cây Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi

ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vàođó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy tương tự với điềukiện tự nhiên bên ngoài, một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều

kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ

C/N, ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu, kiểu di truyền Người ta thường bổ sung auxin

để kích thích quá trình ra rễ in vitro.

2.1.6.5 Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ

ẩm… Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinhdưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễdàng bị stress, dễ mất nước và mau héo.

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sángthấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,… cây con thường được cấy trong luốngươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầucần phải được phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7-10 ngày kểtừ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mớixuất hiện, cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâmhay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ

2.1.7 Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro

Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫucấy mà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:

 Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và nhữngmối tương quan mới được hình thành

 Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:

 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóatế bào)

 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành

cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra

 Sự hình thành cơ quan

 Sự phát triển cơ quan

 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:

 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy

 Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoàithiên nhiên

 Vị trí của mẫu cấy trên cây

 Thời gian thu mẫu trong năm

 Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh

 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phầndưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, cácyếu tố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,… sự bổ sungmột số cơ chất khác vào trong môi trường,…

Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuôi cấy môrất phức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cầnlưu ý đến một số vấn đề sau:

 Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khácnhau (môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinhtrưởng,…)

 Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loàikhác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau

 Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loàikhác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai tròquyết định do đó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng khôngnhiều

 Sự hình thành rễ bất định thường đối lập với sự hình thành chồi bất định.Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mangnhiều thiếu sót Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạochồi bất định trước sau đó cảm ứng tạo rễ

2.1.7.1 Sự hình thành chồi bất định

Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhângiống vô tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn

Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như:

Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…

Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định:

 Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụngcác bộ phận của cây con (Anonymous, 1984)

 Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi vàrễ)

 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định

không có cytokinin và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọnglượng tươi lớn hơn là được nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa Tuy nhiên, trên môitrường có BA thì khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra sốlượng chồi và trọng lượng tươi của chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên môitrường không có cytokinin

 Nhiệt độ

Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại

lệ như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).

 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp:

 Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin

để tạo chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus

(Appelgren và Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966)

 Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạochồi, trong khi auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953;Paulet, 1965; Nitsch, 1968).

 Có một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trườnghợp Lili (van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975)

 Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan

trọng trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia

(Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965) và cây bông cải (Margara, 1969).Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự táisinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin Tỉ lệ của haichất điều hòa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog vàTsui, 1948; Miller và Skoog, 1953) Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúcđẩy tạo chồi ở nhiều loài thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuấthiện nhiều biến dị (chồi biến dạng)

Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽtăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969) Một sốtrường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi:

Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948)

Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức

chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành

chồi như ở cây Ipomoea batatas.

2.1.7.2 Sự hình thành rễ bất định

Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô củachúng còn giữ khả năng phân sinh

Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót

của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyềncủa loài, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vếtthương, số lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinhtrưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH,…

2.1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi

cấy in vitro

2.1.8.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển in vitro:

 Kiểu di truyền

Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thôngthường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó táisinh (trừ khi chúng còn non) Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae,Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ táisinh nhất

Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh

trưởng có trong môi trường nuôi cấy

 Tuổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thườngdùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh củachúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trongtrường hợp cây bụi

Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những

đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi khi

qua nhiều lần cấy chuyển, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khảnăng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối

tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica.

 Tuổi của mô và cơ quan

Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưngcũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốthơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năngtái sinh và phân chia tế bào giảm Khả năng tái sinh của những loài khác nhautăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái

sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica ( Coumans và cộng sự, 1979).

 Tình trạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào

in vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh

hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạnsinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các

chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro

hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khichúng bắt đầu phát triển)

 Vị trí của mẫu cấy trên cây

Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và

phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy

những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi

trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Sự hình

thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc

của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily(Robb, 1957) Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy cónguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng

in vitro giống nhau.

 Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng đểtăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏicây tự nó cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thướccàng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất

dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro

hơn những cơ quan ít chất dự trữ Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bịtổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Ảnh hưởng của vết thương lênsự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh

Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinhmẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng vàcác chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn Ngoài ra, có thể tăngcường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương

 Phương pháp cấy

Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: cócực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phầnngọn xuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu đượccấy không cực (Pierik và Steegmans, 1975) Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấpđầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốccủa mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vàotrong agar do nó không tiếp xúc với môi trường Như ở trường hợp tất cả các cây

thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phầngốc của vảy hành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thânhành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực.

2.1.8.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinhhình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường.Thành phần này thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy

Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phầnmôi trường cũng thay đổi Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóacủa mẫu cấy Tuy nhiên, tất cả các môi trường đều bao gồm năm thành phần:khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời khôngkhác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượngcần phải cung cấp là N, P, K¸Ca, Mg và Fe

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro là lĩnh vực còn ít nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra

đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trườngnuôi cấy Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng đểpha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cungcấp phần nào cho môi trường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấpcho tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo

Carbon và nguồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp

mô và tế bào thực vật tổng hợp nên các hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinhkhối không phải từ quá trình quang hợp mà chính từ nguồn carbon bổ sung vào

môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose vàsucrose Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm nhưlactose, galactose, rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate nàycó hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose Sucrose là một nguồn carbonquan trọng đối với mô và tế bào nuôi cấy.

Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăngtrưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình

biến dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài

vitamin trở thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitaminthường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acidnicotinic, pyridoxine (B6) và myo-inositol

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng caochúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng nhưcác chất diệt cỏ dại

Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tếbào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh Trái lại các chất điềuhòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụngtrong thực tế

Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin,cytokinin, gibberellin, abscisic acid và etylen:

Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N Auxingồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxintổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, )

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vàonồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự giatăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tếbào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằngmột sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làmgiảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợpRNA ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hìnhthành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển củachồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng.Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở cácquả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràngđược nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong quá trình vậnchuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase,điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng.Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (VõThị Bạch Mai, 2004)

Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2iP) được phát hiện sau auxin vàgibberellin Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokininsẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi Cytokininlà các hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đếnlà zeatin và IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiềunhất trong nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP

Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện củaauxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phéptách rời nhiễm sắc thể.

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽsự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chốnglại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa Các chồi náchđược xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bàovà định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi

cấy in vitro.

 Gibberellin

Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng.Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3 Đây là các chất có cấu trúc nộisinh

Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhaubởi chất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân

Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây Tác động nàycũng có thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốthơn hoặc những phát hoa phát triển hơn (trên các loài nho có chùm nhiều trái,chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn)

GA3 được sử dụng trong môi trường dinh dưỡng kích thích vươn thân, đặc biệttrong trường hợp có hàm lượng cytokinin cao dẫn đến việc hình thành các cụmchồi có cấu trúc chặt (Economou, 1982)

Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng,

nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên cácmắt cây

Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt,chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác.

Gia tăng quá trình rụng lá và trái; với mục đích này, nó được sử dụng để chophép thu hoạch cơ giới trái (thí dụ trái olive, cerise…)

Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa

Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ

Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, quan trọng nhấtlà trái cây, kém hơn là hoa và ở các cơ quan thực vật bị chấn thương

Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích

hợp, nó có thể bị ức chế hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago).

Áp dụng trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng

thuận lợi (như cây Epinard, Lolium temulentum).

Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại câyvà phần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rấtkhác nhau và giải thích một cách khó khăn

Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự

cân bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai tròtạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin Theo Skoog:

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chứcnăng sinh tạo rễ.

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phíachức năng sinh tạo thân

- Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạomô sẹo

2.1.9 Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô

Khi tiến hành nuôi cấy mô khó khăn lớn nhất là phải tạo được thể nhân giống

in vitro vô trùng Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình

nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khítrong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy

Mẫu cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bềmặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi Đối với một sốloài thực vật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càngkhó khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật Ngoài ra, những câyđã bị nhiễm ngay trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phươngpháp khử trùng thông thường để loại bỏ vi sinh vật được

Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng Nhằmtăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng đểloại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dungdịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt Sau khi khử trùng phải rửa sạchmẫu cấy bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần

Một số chất khử trùng thường sử dụng như:

 Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùngvới lượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cần cẩnthận khi tiếp xúc

 Sodium hypochlorite NaOCl: Có trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20%(v/v) Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vôtrùng 3 – 5 lần Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăngtrưởng của mô về sau.

 Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý môcấy từ 5 – 30 phút

 Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vậtliệu nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặcsau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút

 Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ởnồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sửdụng Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mô thực vật, do đó phảirửa thật sạch

 Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô

 Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mô thựcvật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chấtnày

 Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: Những kháng sinh này cótác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy Dung dịch khángsinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy.Như vậy, việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn nhất và nồng độ khử trùng thấpmà vẫn thu được mẫu cấy vô trùng là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùngcó thể phá hủy mô của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002)

2.2 Giới thiệu chung về Kim Ngân Hoa

2.2.1 Vị trí phân loại

 Ngành: Tracheobionta

(Lonicera japonica Thunb)

chèvrefeuille du Japon (Pháp)

o Nhẫn đông hoa (Tân Tu Bản Thảo)

o Ngân hoa (Ôn Bệnh Điều Biện)

o Kim Ngân Hoa, Kim Ngân Hoa Lộ, Mật Ngân Hoa, Ngân Hoa Thán, TếNgân Hoa, Thổ Ngân Hoa, Tỉnh Ngân Hoa (Đông Dược Học Thiết Yếu)

o Song Hoa (Trung Dược Tài Thủ Sách)

o Song Bào Hoa (Triết Giang Dân Gian Thảo Dược)

o Nhị Hoa (Thiểm Tây Trung Dược Chí)

o Nhị Bảo Hoa (Giang Tô Nghiệm Phương Thảo Dược Tuyển Biên)

o Kim Đằng Hoa (Hà Bắc Dược Tài)

2.2.2 Đặc điểm quan trọng của cây Kim Ngân Hoa

Kim Ngân Hoa có tên khoa học là Lonicera japonica Thunb, là loại dược liệu

quan trọng thuộc họ Kim Ngân (Caprifoliaceae) Họ này gồm khoảng 800 lồi tậptrung phổ biến ở khu vực ôn đới Bắc bán cầu, với trung tâm đa dạng nằm ở miềnđông Bắc Mỹ và miền đông châu Á, trong khi không có mặt tại khu vực châu Phinhiệt đới và miền nam của châu lục này

Trong phân loại của hệ thống APG II năm 2003

 Leycesteria: 6 loài

 Symphoricarpos: 17 loài

Tại Việt Nam, chi Lonicera L có khoảng 10 loài, tất cả đều được dùng làm

thuốc Kim Ngân Hoa là cây bụi hay dây leo, ít thấy cây thân thảo có các đặcđiểm hình thái sau:

 Thân có thể dài đến 9-10m, rỗng, có nhiều cành, lúc non màu xanh, khigià màu đỏ nâu, trên thân có những vạch chạy dọc

 Lá mọc đối nhau, hình trứng dài Phiến lá rộng 1,5 - 5cm, dài 38cm Lácây quanh năm xanh tươi, mùa rét không rụng

 Hoa khi mới nở có màu trắng, nở ra lâu chuyển thành màu vàng Hoamọc ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 2 hoa mọc trên 1 cuống chung Lá bắc giống như lácây nhưng nhỏ hơn Tràng hoa cánh hợp, dài từ 2,5 – 3,5 cm, chia làm 2 môikhông đều Môi rộng lại chia thành 4 thùy nhỏ, 5 nhụy đính ở họng tràng, mọcthò dài ra ngoài hoa

 Quả hình cầu, màu đen Mùa quả: tháng 6 – 8

 Nụ hoa hình gậy, hơi cong queo, dài 25cm, đường kính đạt đến 5mm.Mặt ngoài màu vàng đến vàng nâu, phủ đầy lông ngắn Mùi thơm nhẹ vịđắng Mùa hoa: tháng 3 – 5

Theo Tài nguyên Cây Thuốc Việt Nam, ngoài Kim Ngân nói trên người ta còndùng một số loại Kim Ngân sau:

 Kim Ngân Dại (Lonicera dasystyla Rehd): Lá hình trứng nhọn dài 28 cm,

rộng 14 cm; Mép lá trên nguyên, lá gốc chia thùy; Phiến lá mỏng, mặt trênnhẵn, mặt dưới phủ lông mịn; Hoa ống tràng, thẳng hoặc hơi cong, dài 1,8 –2,2 cm; Bầu nhẵn

 Kim Ngân Lông (Lonicera cambodiana Pierre): Lá hình thuôn hơi dài, dài

khoảng 5 – 12 cm, rộng 36 cm; Mép lá nguyên cuộn xuống dưới mặt lá; Phiếnlá khá dày, mặt trên nhẵn, trừ cuối gân giữa, mặt dưới lông xù xì, nhất là ởgân lá; Hoa ống tràng, thẳng hoặc hơi cong, dài 56 cm; Bầu có nhiều lông

 Lonicera confusa D C: Lá hình thuôn dài, dài 46 cm, rộng 1,5 – 3 cm; Mép

lá nguyên; Phiến lá hơi dày, mặt trên nhẵn, mặt dưới có nhiều lông ngắn mịn;Hoa ống tràng thẳng hoặc hơi cong, dài 3 cm; Bầu có lông

Trong cây Kim Ngân Hoa có chứa các thành phần hóa học như sau

 Luteolin, Inositol, Tannin, saponin (Trung Dược Học)

 Hoa chứa Scolymozid (Lonicerin), 1 số Carotenoid ( caroten,cryptoxanthin, auroxantin) Lá chứa Loganin (Tài Nguyên Cây Thuốc ViệtNam)

 Chlorogenic acid, Isochlorogenic acid (Lý Bá Đình, 1986)

Ginnol, b-Sitosterol, Stigmasterol, b-Sitosterol-D-Glucoside,

Stimasteryl-D-Glucoside (Sim và cộng sự, 1981)

Bộ phận dùng làm thuốc thường là hoa mới chớm nở, lá và thân thì ít dùnghơn Khi hoa sắp chớm nở thì thu hái; nên hái vào khoảng 9-10 giờ sáng (lúc nàysương đã ráo), nhặt bỏ tạp chất, đem tãi mỏng phơi trong râm mát hoặc sấy nhẹ

đến khô Dây lá có thể thu hái quanh năm, thái nhỏ, phơi khô, bảo quản nơi khôráo, tránh ẩm Có tác dụng dược lý như sau:

 Tác dụng kháng khuẩn: nước sắc hoa Kim Ngân có tác dụng ức chếmạnh đối với tụ cầu khuẩn, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shiga Nướcsắc có tác dụng mạnh hơn các dạng bào chế khác (Tài Nguyên Cây ThuốcViệt Nam)

Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch

tán và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tácdụng kháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cậnthương hàn, liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả Tác dụng yếu hơn đối với

các trực khuẩn bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng Nước sắc lá Kim

Ngân với nồng độ 201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chếtrực khuẩn cận thương hàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn(Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam)

 Tác dụng trên đường huyết: Nước sắc hoa Kim Ngân cho uống cótác dụng ngăn chặn choáng phản vệ ở chuột lang Ở chuột lang uống KimNgân, số lượng và tính chất các dưỡng bào ở mạc treo ruột ít thay đổi LượngHistamin ở phổi chuột lang bị choáng phản vệ cao gấp rưỡi so với chuột langbình thường và chuột lang uống Kim Ngân trước khi gây choáng (Tài NguyênCây Thuốc Việt Nam)

 Tác dụng kháng viêm: Làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làmtăng tác dụng thực bào của bạch cầu (Trung Dược Học)

 Tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh: Cường độ bằng 1/6 của càphê (Trung Dược Học)

 Tác dụng chống lao: Nước sắc Kim Ngân Hoa in vitro có tác dụng chống Mycobacterium tuberculosis Cho chuột uống nước sắc Kim Ngân hoa

rồi cho chích vi khuẩn lao cho thấy ít thay đổi ở phổi hơn lô đối chứng (TrungDược Học).

 Kháng Virus: Nước sắc Kim Ngân Hoa có thể làm giảm sức hoạtđộng của PR8 ở virus cúm nhưng không có tác dụng ở phôi gà con đã tiêmchủng (Trung Dược Học)

 Tác dụng chuyển hóa Lipid: Cho chuột béo phì dùng lượng lớnCholesterol vỗ béo cho chuột đồng thời cho uống nước sắc Kim Ngân Hoa,mức Cholesterol trong máu của chúng thấp hơn so với nhóm đối chứng (TrungDược Học)

 Trong nhãn khoa: Nước sắc Kim Ngân Hoa có hiệu quả trong điềutrị cho những trường hợp bị kết mạc viêm mạn, giác mạc loét (Trung DượcHọc)

 Làm hạ Cholesterol trong máu (Trung Dược Học)

 Tăng bài tiết dịch vị và mật (Trung Dược Học)

 Tăng tác dụng thu liễm do có chất Tanin (Sổ Tay Lâm Sàng TrungDược)

 Có tác dụng lợi tiểu (Sổ Tay Lâm Sàng Trung Dược)

2.2.4 Điều kiện trồng trọt

Kim Ngân có nguồn gốc ở vùng Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản vàTriều Tiên Ở Việt Nam, Kim Ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và trung

du phía bắc, như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây,…

Kim Ngân thích nghi với nhiều loại đất và khí hậu khác nhau Cây ưa sáng,thường mọc ở rừng thứ sinh, đồi cây bụi và rừng thưa núi đá vôi

Giống

Cây Kim Ngân có 2 cách nhân giống: Nhân giống hữu tính và nhân giống vôtính

 Nhân giống hữu tính:

Dùng hạt để gieo, đầu tháng 11 thu hoạch quả chín, trong mỗi quả có 4-7 hạt.Đem hạt phơi khô, cất giữ đến cuối tháng 3 năm sau đem gieo Bỏ hạt vào nướcấm 300C ngâm 21 giờ, vớt ra trộn với cát ẩm để thúc đẩy sự nảy mầm, khi hạt đãnứt vỏ trên 30% thì đem gieo

 Nhân giống vô tính truyền thống

Cho tới nay các nơi trồng Kim Ngân phần lớn dùng cách nhân giống vô tínhtruyền thống gồm hai cách: trồng bằng cắm hom và trồng bằng đánh tỉa chồi

+ Cách nhân giống bằng đánh tỉa chồi: Đánh tỉa chồi thường phải chọn lúc

trên chồi có nụ hoa đang nở Vì thế nếu đánh chồi đi trồng thì sang năm cây mẹsẽ không ra hoa và ảnh hưởng tới sản lượng Do đó cách này thường ít khi được sửdụng

+ Cách trồng bằng hom: Cách trồng bằng hom là cắt lấy đoạn thân cây chưa

ra hoa để mang đi trồng Cách làm này đơn giản, cây ra hoa sớm nên bà con nôngdân thích dùng cách nhân giống này Lúc cắm hom tốt nhất là chọn ngày râm mátsau khi mưa, vì đất ẩm, độ ẩm không khí cao, cắm xong tỷ lệ cây sống cao Hom cần phải chọn ở cây khoẻ mạnh, cây đã một, hai tuổi, tỷ lệ sống cao nhất,sinh trưởng cũng nhanh Trước khi cắm phải cuốc hốc rồi đặt hom vào hốc; ở dốcnúi và đất bờ ruộng khoảng cách giữa các cây 1,3 – 1.7m chỗ đất đai khác nóichung hàng cây cách nhau là 1,7m, hốc sâu

Chăm sóc

 Vun xới đất: Vun xới đất có thể làm cho đất tơi xốp giữ cho gốc câyđược vững chắc, làm cho rễ mọc nhiều, cây mọc nhiều cành Hàng nămvào tiết trước kinh trập (khoảng ngày 5 tháng 3 hàng năm), tiến hành vunxới đất một lần và vào trước lúc bước vào mùa đông lạnh giá cuối thu vungốc cây lần thứ hai

 Làm cỏ: Mỗi năm có thể làm cỏ 3 - 5 lần Khi làm cỏ nên chú ýtrước hết bắt đầu từ ngoài vào gốc, về sau làm dần vào, lần trước xới đấtsâu, các lần sau xới nông dần để tránh rễ bị tổn thương.

 Bón phân: Mỗi năm bón phân thúc một lần, bón vào lúc trước khibước vào mùa đông hoặc trước khi cây đâm chồi nảy lộc đầu xuân Nhữnglần sau có thể bón vào sau lúc đâm chồi một lần và sau khi hái hết hoa bónmột lần

 Tưới nước: Thực tế cho thấy tưới nước có tác dụng nhất định đối vớiviệc làm tăng sản lượng Vì thế vào mùa xuân khô hạn nên tiến hành tướinước cho cây

 Tỉa bớt cành: Tỉa ở những cây cành mọc quá dày Khi tỉa phải nắmvững nguyên tắc tỉa từ trong ra ngoài, chia ra từng lớp Việc tỉa cành nàysẽ góp phần làm cho cây ra hoa nhiều hơn

Phòng trừ sâu bệnh

Kim Ngân rất ít sâu bệnh Sâu hại Kim Ngân có rệp là nghiêm trọng nhất, loàinày thường xuất hiện trước khi cây ra hoa Để phòng rệp thì cuối đông đầu xuânphát và cuốc hết cỏ dại ở xung quanh gốc cây, đào xới cho đất tơi xốp ở xungquanh gốc cây là đã tiêu diệt được môi trường lây lan của rệp Hạn chế dùng hoáchất trừ sâu bệnh vì nó sẽ làm cho hoa bị nhiễm độc không an toàn cho dược liệusau này

Thu hoạch và chế biến:

Thu hoạch: Thời vụ thu hoạch Kim Ngân là từ cuối tháng 5 đến đầu tháng 6,từ lúc cây có nụ hoa đến lúc hoa nở trong khoảng 15 ngày Thời gian hái hoa nênchọn lúc nụ hoa màu xanh trở thành màu trắng, lúc hoa bắt đầu nở là tốt nhất.Sau khi hái hoa về nên phơi và sấy khô ngay Hoa sau khi đã phơi sấy khô nênchú ý bảo quản ở nơi thoáng gió, tránh nơi ẩm ướt