Khi tiến hành nuôi cấy mô khó khăn lớn nhất là phải tạo được thể nhân giống
in vitro vô trùng. Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình nuôi cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy.
Mẫu cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số loài thực vật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngoài ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùng thông thường để loại bỏ vi sinh vật được.
Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Nhằm tăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần.
Một số chất khử trùng thường sử dụng như:
Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cần cẩn thận khi tiếp xúc.
Sodium hypochlorite NaOCl: Có trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20% (v/v). Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mô về sau.
Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý mô cấy từ 5 – 30 phút.
Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút.
Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mô thực vật, do đó phải rửa thật sạch.
Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô.
Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mô thực vật, không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất này.
Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: Những kháng sinh này có tác dụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy. Dung dịch kháng sinh 50 – 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy. Như vậy, việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn nhất và nồng độ khử trùng thấp mà vẫn thu được mẫu cấy vô trùng là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùng có thể phá hủy mô của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002).