BA kết hợp với 2,4-D lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa Bảng 4.3. Aûnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp 2,4-D lên sự
phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1 tháng nuôi cấy
Nghiệm thức Nồng độ (mg/l) Trọng lượng tươi mô sẹo (g)
1 A1 0.5335 e 2 A2 0.78006 bc 3 A3 0.68716 cd 4 A4 0.53418 e 5 A5 1.28192 a 6 A6 0.77308 bc 7 A7 0.6321 e 8 A8 1.21554 a 9 A9 0.77334 bc 10 A10 0.53132 e 11 A11 0.49182 e 12 A12 0.7692 bc 13 A13 0.35552 e 14 A14 0.68274 cd 15 A15 0.85406 b
Kết quả ghi nhận sau 1 tháng nuôi cấy cho thấy các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng chuyên biệt lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa.
Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin. Đối với Kim Ngân Hoa là cây bụi hay dây leo, ít thấy cây thân thảo thì quá trình nuôi cấy in vitro sẽ khó cảm ứng hơn các dạng cây thân thảo nên sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là điều cần thiết. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu trên tử diệp cây mầm
Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần có sự phối hợp giữa 2,4-D 3,0 mg/l, NAA 1,0 mg/l và kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Có một số công trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey, 1977 trên mô rễ cây đậu nành, ghi nhận có sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu môi trường chỉ có auxin, thì hàm lượng DNA được ghi nhận là không thay đổi.
100% mẫu lá phát sinh mô sẹo khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA và 2,4-D. Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Mô sẹo hình thành ở hầu hết các bộ phận của cây (thân, lá, rễ), khi nơi đó có vết cắt (Street, 1969). Tuy nhiên, khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Chỉ có cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành là dễ cho mô sẹo dưới tác động của auxin mạnh được áp dụng riêng lẽ hay kết hợp với cytokinin, còn những mảnh cơ quan trưởng thành thường không có khả năng này. Ưùng với mỗi loại mô hay cơ quan, thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó (Ochatt và Caso, 1986)
Đối với Kim Ngân Hoa thì lá là cơ quan cho phát sinh mô sẹo tốt nhất bởi độ đồng đều của các tế bào lá cao hơn do các tế bào lá phân chia đều khắp bề mặt
(Bùi Trang Việt, 2000), cũng là cơ quan cho phát sinh chồi nhiều nhất. Nếu tính theo số lượng tế bào biểu bì, dưới biểu bì (chồi bất định thường phát sinh từ những tế bào này, theo Joy IV và Thorpe, 1999; Bùi Trang Việt, 2000) thì mẫu lá có số lượng lớn hơn thân và rễ. Do đó, chồi phát sinh cơ bản là nhiều hơn.
Điều này đã được chứng minh bởi nghiên cứu của D. Georges (1993) và cộng sự trên cây Kim Ngân Hoa. Bề mặt tiếp xúc của mẫu lá với môi trường lớn hơn, bề dày mẫu cấy nhỏ hơn nên chênh lệch gradient của các chất cảm ứng cũng ít hơn. Theo Joy IV và Thorpe (1999), sự tương tác giữa gradient các chất cảm ứng là một yếu tố quan trọng trong quá trình phát sinh cơ quan. Mẫu cấy càng đồng đều về gradient sẽ cho phản ứng càng thống nhất và hiệu quả.
Điều quan trọng được nhận thấy ở đặc tính của mô sẹo là mô sẹo phát triển không theo quy luật nhưng có khả năng biệt hóa thành rễ, chồi và phôi để có thể hình thành cây hoàn chỉnh.
Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có quan hệ với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra 3 giai đoạn : phát sinh mô sẹo, phân chia tế bào và biệt hóa.
(1) Trong phase phát sinh mô sẹo, sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
(2) Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối.
(3) Tế bào đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Aitchison, 1997). Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin. Sự biệt hóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo nhu mô các loại, các tế bào rây... hơn nữa hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ.
Khi đặt mẫu lá trong môi trường MS cơ bản, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật thì mẫu lá phồng lên, xanh nhưng sau 1 thời gian thì mẫu lá bắt đầu hóa nâu và chết, điều này có thể là do lượng hormon nội sinh trong mẫu cấy ít, không đủ để cảm ứng quá trình phát sinh hình thái. Điều này cũng được ghi nhận bởi Klimaszewska và Keller (1985) khi nuôi cấy các TLC của cây Brassica napus trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng.
Khi mẫu lá được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung các loại chất điều hòa sinh trưởng khác nhau cho thấy các kết quả có sự khác biệt rõ ràng.
Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo (Ahloowalia, 1991 ; Komamin và cộng sự, 1992 ; Liu và cộng sự, 1993 ; Zimmerman, 1993). 2,4-D đã được chứng minh có vai trò quyết định đến sự phát sinh mô sẹo có khả năng phát sinh phôi ở cây cà rốt (Borkid và cộng sự, 1986) và sự phát sinh phôi sinh dưỡng ở hầu hết các loài thực vật (Halperin và Whetherell, 1964 ; Ammirato, 1983). Kết quả ghi nhận cho thấy 2,4-D với nồng độ 0,1 mg/l kết hợp với BA cho khả năng phát sinh mô sẹo tốt nhất, mô sẹo hình thành xung quanh vết cắt và trên khắp bề mặt của lá, tạo thành bông trắng, và nâu, nốt xanh trên bề mặt lá, mẫu lá sẽ uốn cong thành dạng V với gân chính là điểm mấu chốt do sự tăng sinh tế bào, mẫu lá chắc, mặc dù trọng lượng tươi của mô sẹo ở nồng độ này là 0.6321 g/mẫu thấp hơn so với các nồng độ còn lại. Khi nồng độ 2,4-D càng cao (0,5 – 1 mg/l) thì mô sẹo trở nên trắng đục, nhão không có khả năng tái sinh, nhưng trọng lượng tươi của mô sẹo lại tăng lên đáng kể, những loại mô sẹo dạng như vậy tăng sinh rất nhanh và cần phải được loại bỏ. Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959 ; De Garcia và Martnez, 1995 ; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo sự tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992).
Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi (Mehra và Jaidka, 1985 ; Pal và cộng sự, 1985 ; Shrikhande và cộng sự, 1993). Kết quả cho thấy nồng độ BA 1 mg/l cho khả năng tái sinh tốt hơn các nồng độ còn lại.
Như vậy, nồng độ 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp với 1 mg/l BA là nồng độ thích hợp cho sự phát sinh mô sẹo ở mẫu lá Kim Ngân Hoa. Đây là tiền đề cho các thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy tế bào đơn và nuôi cấy phôi soma, sản xuất các hợp chất sinh học thứ cấp ở cây Kim Ngân Hoa.