Số liệu thu thập được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình thống kê Statgraphic 7.0. Đọc kết quả dựa vào bảng ANOVA, bảng trung bình và bảng so sánh khác biệt giữa các nghiệm thức (Bằng phương pháp LSD).
4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel (NaOCl) 7%
Mẫu lá Kim Ngân sau khi được khử trùng sơ bộ bên ngoài tủ cấy dưới vòi nước chảy và nước rửa chén pha loãng sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm, giúp cho sự khử trùng được dễ dàng hơn, sau đó được đưa vào tủ cấy để tiến hành khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 7% có bổ sung vài giọt Tween 20 với các khoảng thời gian khác nhau.
Mẫu lá sau khi khử trùng sẽ được cắt bỏ viền xung quanh lá bị trắng, nâu do tác dụng của chất khử trùng, cắt đôi lá theo đường gân chính thu được mẫu có kích thước 1 – 2 cm và cấy trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l NAA. Tỉ lệ mẫu bị nhiễm được ghi nhận sau 1 tuần và tiếp tục đánh giá tỉ lệ mẫu tái sinh sau 4 tuần nuôi cấy.
Trong 1 tuần nuôi cấy đầu tiên cho kết quả khử trùng như bảng 4
Bảng 4.1. Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa
Nghiệm thức Thời gian (phút) Tỉ lệ mẫu nhiễm(%) Tỉ lệ mẫu chết (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) 1 3 20a (*) 0b 80b 2 4 8ab 0b 92ab 3 5 0b 0b 100a 4 6 0b 4ab 96a 5 7 0b 8ab 92ab 6 8 0b 12a 88ab
(*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê với mức xác suất P = 0,05
Khi tiến hành nuôi cấy mô thực vật thì vấn đề lớn nhất là phải tạo được nguồn mẫu nuôi cấy đảm bảo vô trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các các thí nghiệm sau. Môi trường nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng và vitamin thì rất thích hợp
cho các loài nấm, vi khuẩn phát triển do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật.
Nếu do nấm, chúng ta thấy sự phát triển của khuẩn ty có cấu trúc sợi, thường màu trắng hoặc hơi xám. Nếu sợi khuẩn ty màu xanh, chắc chắn là do nấm penicillium. Nếu sợi thể hiện các hạt đen nhỏ (dạng quả), có thể là do nấm rhizopus nigricans, nấm này sẽ sinh sôi rất nhanh.
Nếu do khuẩn, thì chúng ta sẽ thấy một màng có dạng sữa, phát triển bên trong môi trường và ở bề mặt. Màng này đôi lúc có màu (như hồng, vàng,…). Vài loài vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas….
Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mô và môi trường cấy thì đây là nhiễm do mô. Nếu sự nhiễm khởi đi từ một điểm bất kỳ nào đó trong môi trường thì nguồn nhiễm có thể do không khí hoặc sự khử trùng môi trường không tốt hoặc do nhiễm từ không khí xung quanh. (Dương Công Kiên, 2002)
Do đó, các mẫu cấy cần phải được khử trùng bằng các tác nhân khử trùng hóa học. Các chất khử trùng phải ức chế hoặc phá hủy sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hiệu lực của các chất khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy và có độc tính thấp đối với mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì ta có thể thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật, như vậy, bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006)
Từ bảng 4.1 cho thấy, khi thời gian khử trùng 3 – 4 phút thì chưa đủ để tạo ra được mẫu cấy vô trùng, tỉ lệ mẫu bị nhiễm nấm và vi khuẩn khá cao. Trong khi đó, thời gian khảo sát 5 phút cho thấy kết quả khả quan, đủ để tiêu diệt vi khuẩn
và các bào tử nấm mà không làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mẫu cấy, tạo được khối lượng lớn các mẫu lá vô trùng.
Cơ chế tác động của chất khử trùng là: phá hủy lớp màng phospholipid, phân hủy lipid và acid béo, hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật; gây oxy hóa ức chế không thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hô hấp của tế bào vi sinh vật.
Khi hypoclorit hoà tan trong nước, chúng sinh ra acid hypoclorơ (HOCl), chất này sẽ tồn tại trong dung dịch ở 2 dạng OCl- và H+. Hai dạng này sẽ chuyển hoá qua lại, tùy theo độ pH của dung dịch.
Acid hypoclorơ tồn tại trong dung dịch, sẽ tác động đến các chất hữu cơ như là một chất hoà tan, hình thành clorua là một chất oxy hoá mạnh sẽ thay thế nhóm hydro (H) trong nhóm amino (NH) của protein hình thành chloramine dẫn đến sự phá huỷ amino acid, làm biến tính protein. Tính nguyên vẹn của màng nguyên sinh chất bị thay đổi, phospholipid hoặc các acid béo không no của màng tế bào vi sinh vật bị phân huỷ do quá trình xà phòng hoá (Estrela và cộng sự, 2002).
Kết quả cũng cho thấy, khi tăng thời gian khử trùng mẫu cấy 6 – 8 phút thì mẫu không bị nhiễm nhưng tỉ lệ mẫu sống thấp. Mẫu bị chết do Javel ngấm sâu vào mô tế bào làm cho mô tế bào bị phá hủy.
Như vậy, thời gian khử trùng thích hợp nhất đối với mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa là 5 phút với tỉ lệ mẫu có khả năng sống sót và tái sinh là 100%. (Bảng 4.1)
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của cách đặt mẫu cấy lên sự phát sinh hình thái sau 1 tháng
nuôi cấy
Cách đặt mẫu lá trên môi trường Trọng lượng tươi mô sẹo (g)
Úp 0.103017b
Ngửa 0.229317a
Mục đích thí nghiệm đặt ra là nhằm xác định được cách đặt mẫu cấy lên bề mặt môi trường để thu được kết quả cho phát sinh mô sẹo tốt nhất trong thời gian ngắn nhất.
Sau 1 tháng nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 1 BA – 1 NAA, kết quả cho thấy khi đặt mặt dưới của lá tiếp xúc với môi trường (đặt ngửa) thì mẫu cấy phát sinh mô sẹo từ vết cắt, gân lá và trên bề mặt của lá. Các mẫu cấy khác khi đặt mặt trên của lá tiếp xúc với môi trường (đặt úp) thì trong 1 tháng nuôi cấy đầu tiên mô sẹo chỉ phát sinh từ vết cắt, mặt trên của lá lại rất ít và chậm hơn rất nhiều, đôi khi không có sự phát sinh mô sẹo so với khi đặt mặt dưới của lá lên môi trường.
Ở cây Cydonia oblong, Morini và cộng sự (2001) đã nghiên cứu sự phát sinh mô sẹo từ mẫu cấy lá, kết quả cho thấy mô sẹo chỉ hình thành trên bề mặt của lá
Cydonia oblong. Tương tự như nghiên cứu của Rita and Floh (1995) với mẫu cấy lá Cuphea ericoides. Như vậy, sự hình thành mô sẹo trong 1 vài trường hợp thì bị ảnh hưởng bởi sự định hướng của mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy (Warren, 1991).
Sự khác biệt giữa 2 cách đặt mẫu lá trên môi trường có thể giải thích dựa vào cấu trúc của lá. Mặt dưới lá thường có lớp cutin mỏng hơn và nhiều khí khổng hơn (Bùi Trang Việt, 2002; Nguyễn Đình Giậu, 2000). Do đó, khi đặt trong môi trường nuôi cấy, mẫu lá đặt ngửa sẽ hấp thu nhiều chất dinh dưỡng cũng như các thành phần khác của môi trường hơn. Tác dụng của điều kiện nuôi cấy dễ dàng phát huy hơn. Trên lá, chủ yếu phần gân cuối lá bị tổn thương do sự cắt ra khỏi
cuống. Khi đặt mẫu lá ngửa, phần gân này được tiếp xúc nhiều với môi trường và hấp thu các chất nhanh hơn những vị trí khác của lá. Và lúc này, chúng trở thành các "bể" thu hút chất dinh dưỡng cũng như những chất khác từ các nơi đổ về.
Đồng thời khi quan sát lá trong thời gian đầu nuôi cấy nhận thấy có sự cong đặc trưng của phiến lá. Lá có xu hướng cong lên khi đặt ngửa và cong xuống khi đặt úp. Từ đó có thể kết luận các tế bào lá ở mặt trên nhạy cảm và phản ứng tốt hơn.
Pierik và Zwart chứng minh rằng sự tạo chồi bất định của mẫu cấy lá tăng nhiều khi để cho lớp biểu bì dưới của phiến lá Kalanchoe farinacea tiếp xúc trực tiếp với môi trường nuôi cấy (đặt ngửa).
Từ bảng 4.2 cũng cho thấy trọng lượng tươi của mô sẹo đạt được trong 1 tháng cũng có sự chênh lệnh đáng kể. Đối với mẫu cấy đặt ngửa thì trọng lượng tươi của mô sẹo tăng lên là 0.229317 g/mẫu trong khi đặt úp thì chỉ có 0.103017 g/mẫu. Điều này chứng tỏ rằng, sự định hướng của mẫu cấy ảnh hưởng rất lớn đối với sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa.
Như vậy, đối với mẫu lá Kim Ngân Hoa thì khi đặt ngửa thì khả năng mẫu phát sinh mô sẹo từ vết cắt, gân lá và trên cả bề mặt của lá tốt hơn và khối lượng mô sẹo tăng sinh nhanh so với khi đặt úp.
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của chất kích thích tăng trưởngBA kết hợp với 2,4-D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim BA kết hợp với 2,4-D và NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa