BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa
Bảng 4.4. Aûnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp NAA lên sự
phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1 tháng nuôi cấy
Nghiệm thức Nồng độ (mg/l) Trọng lượng tươi mô
sẹo (g) 1 B1 0.192228 e 2 B2 0.94526 cd 3 B3 1.0575 b 4 B4 0.5967 e 5 B5 0.84984 e 6 B6 0.98806 bc 7 B7 0.817 e 8 B8 0.8757 e 9 B9 1.5339 a 10 B10 0.73264 e 11 B11 0.8935 e 12 B12 0.97728 bc 13 B13 0.62436 e 14 B14 0.754506 e 15 B15 0.89754 e
Từ bảng 4.4 cho thấy sự kết hợp giữa BA và NAA cho phát sinh mô sẹo tốt hơn rất nhiều so với khi BA kết hợp với 2,4-D và trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên đáng kể. 100% mô sẹo cũng được phát sinh từ sự kết hợp này. Điều này chứng tỏ, ở cây Kim Ngân Hoa thì lá là cơ quan rất dễ cảm ứng tạo mô sẹo. Một tiến trình phản biện hóa phát sinh dẫn đến kết quả hình thành mô sẹo có tính cạnh tranh dọc theo bìa vết cắt. Tất cả mô sẹo thu được đều rắn chắc, mô sẹo nâu, trắng, vàng, và có nhiều nốt xanh trên bề mặt của lá. Không có sự tái sinh chồi trong suốt quá trình khởi đầu của mô sẹo nhưng rễ xuất hiện thường xuyên trên môi trường cơ bản chứa NAA. Điều này có thể được giải thích vì hàm lượng auxin nội sinh của cây khá cao, đồng thời NAA là một auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh nên khi bổ sung 1 hàm lượng rất nhỏ của NAA cũng đã có khả năng cảm ứng mô sẹo phát sinh rễ.
Ở nồng độ 0,5 mg/l NAA thì cho sự phát sinh rễ từ khối mô sẹo nâu và sự phát sinh rễ càng nhiều trên môi trường chứa (0,5 mg/l BA + 1 mg/l NAA) có trọng lượng tươi là 1.0575 g/mẫu hoặc (0.7 mg/l BA + 1 mg/l NAA) có trọng lượng tươi của mô sẹo là 0.98806 g/mẫu, tỉ lệ A/C cao thì kích thích tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000). Điều này cũng được bắt gặp khi nuôi cấy mẫu lá Crassula argentea đáp ứng với vết thương bằng cách tạo mô sẹo, sau đó sẽ tạo rễ và tiếp theo là tạo chồi (Paterson và Rost, 1981)
Sự hình thành rễ bất định chia làm 3 giai đoạn:
a) Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hoá mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ.
b) Giai đoạn tiếp theo là sự xuất hiện mầm rễ.
c) Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ chui qua vỏ ngoài tạo nên rễ bất định.
Các giai đoạn này khác nhau về yêu cầu đối với auxin. Giai đoạn đầu đòi hỏi hàm lượng auxin cao để khởi xướng sự phản phân hoá tế bào mạnh mẽ. Giai đoạn hai cần hàm lượng auxin thấp hơn cho sự xuất hiện rễ. Giai đoạn ba sự sinh trưởng của mầm rễ để hình thành rễ đòi hỏi hàm lượng auxin rất thấp, thậm chí auxin có thể gây ức chế sự sinh trưởng của rễ.
Đối với cây Kim Ngân Hoa, sự phát sinh rễ còn chịu tác động rất lớn bởi nhiệt độ cao (> 300C) và trong điều kiện tối thì rễ sẽ phát sinh nhiều và tốt hơn trong điều kiện ngược lại (D. Georges và cộng sự, 1993). Điều này được giải thích là do khi duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng có thể làm tăng hiệu quả của auxin. Tương tự như trường hợp đối với mẫu cấy lá Begonia khi Heide (1965) quan sát thấy rằng mức độ hoạt động của cytokinin sẽ giảm xuống khi mẫu cấy được nuôi trong điều kiện 270C so với khi được nuôi ở nhiệt độ 150C.
Khi tăng nồng độ BA lên 1 mg/l kết hợp với 1 mg/l NAA thì mẫu lá phát sinh mô sẹo tốt nhất với trọng lượng tươi của mô sẹo cao nhất là 1.5339 g/mẫu so với các nồng độ còn lại. Mô sẹo hình thành nhanh và nhiều khắp bề mặt và xung quanh vết cắt của lá, mô sẹo xanh, vàng nhạt, nâu nhạt, khối lượng mô sẹo tăng sinh nổi bật, mô sẹo xốp chắc thành khối, mẫu lá cứng và không có sự phát sinh rễ từ nồng độ này. Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần một đơn vị sẽ thu được sinh tạo mô sẹo.
Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau 1 thời gian nuôi cấy thì nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hoàng Anh, 2000).
sau đó hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C sẽ xác định sự tạo cơ quan : tỷ lệ cao : tạo chồi, tỉ lệ thấp : tạo rễ. (Skoog và Tsui, 1948 ; Miller và Skoog, 1953 ; Paulet, 1965 ; Gautheret, 1959).
Trong nuôi cấy mô, cytokinin cần thiết cho sự phân chia của tế bào mẫu cấy. Khi không có cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì metaphase của chu trình tế bào sẽ bị kéo dài vì vậy cytokinin cần thiết trong sự điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trưởng và phát triển của tế bào.
Khi tăng nồng độ của BA lên 1,5 mg/l kết hợp với 0,5 mg/l NAA thì không thấy sự phát sinh rễ, và với nồng độ 1 mg/l NAA thì sự phát sinh rễ ít, mô sẹo nâu hình thành nhanh và nhiều xung quanh vết cắt, các nốt xanh hình thành trên bề mặt của lá, khối bông trắng xuất hiện từ vết cắt, mẫu lá cứng, xanh, chắc, phát sinh tốt. Khi gia tăng hàm lượng cytokinin trong mô thì hiện tượng ưu tính ngọn bị phá vỡ sự bật chồi được kích thích bởi cytokinin; trái ngược với tác động của auxin (Bùi Trang Việt, 2000).
Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật, tuy nhiên khi sử dụng BA với nồng độ cao thì sẽ tạo ra những chồi khơng bình thường. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái.
Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cộng sự, 2003). Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati
Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003).
Trong sự khởi đầu và điều hoà sự tăng trưởng của cơ quan chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò quan trọng. Khi nuôi cấy trên môi trường có cytokinin và auxin thì sự phát triển chồi được kích thích. Cần có một sự cân bằng về nồng độ của từng loại hormone trong từng loại mô, ở từng vị trí chuyên biệt. Nhiều loại thực vật như cây thuốc lá đòi hỏi auxin và cytokinin ngoại sinh với tỷ lệ hợp lý để tạo chồi.
Sau 1 tháng nuôi cấy, mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường chứa BA có nồng độ cao hơn, cho thấy mô sẹo cảm ứng tốt, nhưng vẫn chưa thấy sự phát sinh chồi trong suốt thời gian nuôi cấy, tuy nhiên đây là tiền đề cho việc nghiên cứu sự tạo chồi và tái sinh cây hoàn chỉnh cho cây Kim Ngân Hoa sau này.
Kim Ngân Hoa là dạng cây dây leo, thân gỗ nên khả năng cảm ứng chồi từ mô sẹo khó hơn các loài cây thân thảo khác và phải cần rất nhiều thời gian. Theo nghiên cứu bởi D. Georges (1993) và cộng sự cho thấy sau 6 tháng trên môi trường nuôi cấy mô sẹo thì mô sẹo từ lá mới hình thành chồi và cho tỉ lệ hình thành chồi cao hơn so với mô sẹo từ rễ, thân và thời gian hình thành chồi ít nhất (75 ngày).
Với những bước tiến về vi nhân giống và kỹ thuật di truyền, đã có hàng trăm loài thực vật đã được nuôi cấy thành công in vitro trên nhiều loại mô khác nhau và phát sinh cơ quan có cấu trúc (Bajaj, 1986). Tuy nhiên, có nhiều loài thực vật khó nuôi cấy, không hình thành rễ, chồi hay phôi trong nhiều điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Điều quan trọng là cần nghiên cứu khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh nếu khả năng phát triển kỹ thuật di truyền mang tính khả thi. Đã có nhiều báo cáo với những phương pháp nghiên cứu tái sinh các loài thực vật đặc biệt, những phương pháp này cần nhiều thời gian để phát triển vì chúng ta không có một nền tảng kiến thức cơ bản để có thể hiểu rõ tiến trình tái sinh phát sinh hình thái. Hơn nữa, kiến thức chúng ta thu nhận được qua việc vận dụng thành công một loài thực vật
hay một giống cây trồng trọt thì thường không thể nào áp dụng cho các loài thực vật hay các giống cây trồng khác mặc dù thực vật gần nhau về mặt di truyền.
Việc phát triển các mô hình nuôi cấy tái sinh thành công in vitro ở những loài thực vật khó tái sinh sẽ hữu ích trong việc nâng cao tầm hiểu biết của chúng ta về những cơ chế cơ bản điều khiển phát sinh hình thái.
5.1. Kết luận
Qua quá trình tiến hành thí nghiệm đối với mẫu lá Kim Ngân Hoa, chúng tôi rút ra được một số kết luận sau :
Vấn đề khó khăn nhất khi bắt đầu tiến hành nuôi cấy in vitro đối với mẫu lá Kim Ngân Hoa là phải tạo được nguồn mẫu cấy vô trùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng. Thời gian 5 phút trong dung dịch khử trùng Javel 7% cho thấy kết quả khả quan, đủ để tiêu diệt vi khuẩn và các bào tử nấm mà không làm ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của mẫu cấy, tạo được khối lượng lớn các mẫu lá vô trùng với tỉ lệ mẫu sống sót có khả năng tái sinh là 100%.
Đối với mẫu cấy từ lá, cách đặt mẫu lá trên môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến khả năng phát sinh hình thái của cây. Quá trình thí nghiệm cho thấy khi đặt ngửa thì khả năng mẫu phát sinh mô sẹo từ vết cắt, gân lá và trên cả bề mặt của lá tốt hơn và trọng lượng tươi của mô sẹo tăng sinh nhanh so với khi đặt úp.
Quá trình phát sinh hình thái của mẫu lá còn chịu ảnh hưởng đáng kể của chất kích thích tăng trưởng thực vật khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy. 100% mẫu lá phát sinh mô sẹo trên môi trường bổ sung BA kết hợp với NAA và 2,4-D. Nồng độ 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp với 1 mg/l BA là nồng độ thích hợp cho sự phát sinh mô sẹo ở mẫu lá Kim Ngân Hoa. Đây là tiền đề cho các thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy tế bào đơn và nuôi cấy phôi soma, sản xuất các hợp chất sinh học thứ cấp ở cây Kim Ngân Hoa.
Sự kết hợp giữa BA và NAA cho phát sinh mô sẹo tốt hơn so với khi BA kết hợp với 2,4-D và trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên đáng kể. Nồng độ 1mg/l BA - 1 NAA thì mẫu lá phát sinh mô sẹo tốt nhất với trọng lượng tươi của mô sẹo cao nhất ; 0,5 mg/l BA – 1 mg/l NAA mô sẹo phát sinh rễ ; mô sẹo trong nồng độ BA cao chưa khẳng định được khả năng phát sinh chồi trong nghiên cứu này.
5.2. Đề nghị
Do thời gian tiến hành thí nghiệm chỉ trong 3 tháng và thiết bị sử dụng có hạn nên các thí nghiệm đã tiến hành là tiền đề cho các nghiên cứu sau này về cây Kim Ngân Hoa. Chúng tôi xin đưa ra một số đề nghị để nghiên cứu này được hoàn thiện hơn.
Khảo sát thêm các yếu tố liên quan trong quá trình khử trùng mẫu như : tuổi mô cấy, thời điểm thu mẫu khử trùng nhằm nâng cao hiệu quả khử trùng. Nghiên cứu thêm về các loại hóa chất khử trùng khác khi đưa mẫu từ bên ngoài vào.
Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hòa sinh trưởng khác lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy lá và khả năng phát sinh chồi của mẫu lá. Khảo sát khả năng phát sinh chồi từ các bộ phận khác của cây để tìm được nguồn mẫu cấy có khả năng tái sinh chồi tốt nhất, trong thời gian nhanh nhất.
Kim Ngân Hoa là cây dược liệu chứa nhiều hợp chất sinh học như saponin và flavonoid, nghiên cứu này là tiền đề cho các thí nghiệm nghiên cứu nuôi cấy tế bào đơn và nuôi cấy phôi soma, sản xuất các hợp chất sinh học thứ cấp ở cây Kim Ngân Hoa.
Xây dựng hoàn chỉnh qui trình nhân giống in vitro và đưa ra vườn ươm cây Kim Ngân Hoa.
Tiến hành giải phẩu hình thái đối với mẫu cấy để nghiên cứu những thay đổi về mô học bên trong mẫu cấy theo thời gian, từ đó ta có thể hiểu rõ hơn về tác động của chất kích thích tăng trưởng thực vật lên sự phát triển của mô trong quá trình nuôi cấy.