Thực trạng, một số yếu tố liên quan, thành phần loài nấm malassezia spp gây bệnh lang ben ở học sinh 11 15 tuổi và hiệu quả can thiệp tại hải phòng (2016 2017

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Học sinh trung học cơ sở lứa tuổi 11 - 15

- Nấm lang ben Malassezia spp phân lập từ học sinh đƣợc xác định nhiễm nấm

2.1.2.1 Nghiên cứu cắt ngang mô tả có phân tích

- Nghiên cứu đƣợc tiến hành tại 2 khu vực trên địa bàn thành phố Hải Phòng:

+ Khu vực nội thành: trường THCS Vĩnh Niệm, phường Vĩnh Niệm, quận Lê Chân và trường THCS Lạc Viên, phường Máy Chai, quận Ngô Quyền

+ Khu vực ngoại thành: trường THCS Quang Hưng, xã Quang Hưng, huyện An Lão và trường THCS Đoàn Xá, xã Đoàn Xá, huyện Kiến Thụy

2.1.2.2 Địa điểm tiến hành các kỹ thuật xét nghiệm

- Kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp và kỹ thuật cấy nấm đƣợc thực hiện tại 4 trường THCS trong nghiên cứu

- Các mẫu nấm được ủ trong tủ ấm, theo dõi và lưu mẫu tại phòng xét nghiệm của Bộ môn Ký sinh trùng - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng

- Các mẫu nấm sau khi lưu được bảo quản ở nhiệt độ - 80 o C tại Bộ môn Sốt rét - Ký sinh trùng và Côn trùng - Học viện Quân y

- Kỹ thuật PCR - RFLP đƣợc thực hiện tại labo sinh học phân tử của Bộ môn Sốt rét - Ký sinh trùng và Côn trùng - Học viện Quân y

- Kỹ thuật giải trình tự gen đƣợc thực hiện tại công ty First BASE Laboratories Sdn Bhd (Malaysia), địa chỉ: số 7-1 đến 7-3, Jalan SP 2/7,

Luận án tiến sĩ Y học

Taman Serdang Perdana, Seksyen 2, 43300 Seri Kembangan, Selangor, Malaysia

- Can thiệp điều trị được tiến hành tại 2 trường: 1 trường nội thành (trường Vĩnh Niệm) và 1 trường ở ngoại thành (trường Quang Hưng)

- Can thiệp truyền thông giáo dục sức khỏe đƣợc tiến hành tại cả 4 trường THCS trong nghiên cứu

Hình 2.1 Bản đồ địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu đƣợc thực hiện trong 2 năm, từ năm 2016 đến năm 2017 theo 2 giai đoạn

Giai đoạn 1, từ tháng 08 đến tháng 10 năm 2016, chúng tôi thực hiện nghiên cứu cắt ngang mô tả có phân tích nhằm mô tả thực trạng và các yếu tố liên quan Nghiên cứu cũng tập trung vào việc xác định thành phần loài nấm gây lang ben thông qua kỹ thuật PCR - RFLP và giải trình tự gen.

Giai đoạn 2, kéo dài từ tháng 11 năm 2016 đến tháng 05 năm 2017, chúng tôi đã thực hiện các biện pháp can thiệp tại cộng đồng, bao gồm điều trị, truyền thông giáo dục sức khỏe và đánh giá hiệu quả của những biện pháp này.

Phương pháp nghiên cứu

Theo phương pháp mô tả cắt ngang có phân tích và nghiên cứu can thiệp cộng đồng không đối chứng có đánh giá trước - sau

- Phương pháp nghiên cứu thực trạng bệnh lang ben: Mô tả tỷ lệ mắc bệnh lang ben qua điều tra cắt ngang

- Phương pháp nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben:

Mô tả có phân tích qua điều tra KAP của học sinh về bệnh lang ben

- Phương pháp nghiên cứu thành phần loài nấm gây lang ben: Mô tả và thực nghiệm tại phòng xét nghiệm

- Phương pháp nghiên cứu hiệu quả điều trị và hiệu quả truyền thông giáo dục sức khỏe: Can thiệp cộng đồng không đối chứng có đánh giá trước sau

2.2.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu

2.2.2.1 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho nghiên cứu tỷ lệ mắc bệnh lang ben

Cỡ mẫu tối thiểu cho nghiên cứu cắt ngang mô tả đo lường tỷ lệ mắc bệnh lang ben đƣợc áp dụng theo công thức [6]:

+ n : cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu

Hệ số tin cậy được xác định với α = 0,05, tương ứng với độ tin cậy 95% và giá trị z = 1,96 Tỷ lệ bệnh lang ben ở học sinh được ước tính là 50%, tức là p = 0,5, do chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên đối tượng này tại Hải Phòng.

+ : sai số tương đối, chọn = 0,2

+ DE: hệ số hiệu lực mẫu, lấy DE = 2

Nhƣ vậy, cỡ mẫu tối thiểu cho mỗi khu vực nghiên cứu là 192 Tổng số mẫu tối thiểu cho 4 khu vực nghiên cứu là 192 x 4 = 768

Trong quá trình triển khai, sự ủng hộ nhiệt tình từ Ban giám hiệu các trường và mong muốn khám phát hiện bệnh của học sinh cùng phụ huynh đã giúp chúng tôi thực hiện nghiên cứu Kết quả cho thấy, khu vực nội thành có 779 học sinh tham gia (trường Vĩnh Niệm 359 học sinh, trường Lạc Viên 420 học sinh), trong khi khu vực ngoại thành cũng được khảo sát.

578 học sinh (trường Quang Hưng là 215, trường Đoàn Xá là 363) Tổng số học sinh của 2 khu vực trong nghiên cứu là 1357

+ Lập danh sách các quận nội thành, bốc thăm 2 quận: Ngô Quyền và

+ Lập danh sách các huyện ngoại thành, bốc thăm 2 huyện: An Lão và Kiến Thụy

+ Lập danh sách các trường THCS thuộc mỗi quận, huyện Bốc thăm mỗi quận huyện 1 trường THCS:

Trường THCS Lạc Viên đã áp dụng phương pháp phân tầng cho năm học hiện tại do số lượng học sinh đông Cụ thể, trường tổ chức 2 lớp cho khối 6, 3 lớp cho khối 7, 3 lớp cho khối 8 và 3 lớp cho khối 9 Tất cả học sinh trong mỗi lớp sẽ được đưa vào nghiên cứu để đảm bảo chất lượng giáo dục.

Trường THCS Vĩnh Niệm - Đoàn Xá - Quang Hưng: lấy toàn bộ học sinh đang theo học tại 3 trường này đưa vào nghiên cứu

- Tiêu chuẩn chọn đối tƣợng nghiên cứu:

+ Học sinh không dùng thuốc kháng nấm dạng bôi trước đó 7 ngày và không dùng thuốc kháng nấm dạng uống trước đó 1 tháng

+ Học sinh và phụ huynh học sinh đồng ý tham gia nghiên cứu

- Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh lang ben: theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế

Lâm sàng cho thấy sự xuất hiện của các dát màu hồng, nâu hoặc trắng trên da, kèm theo bề mặt có những vảy cám mỏng Khi cạo, có dấu hiệu "vỏ bào" tại các vị trí như mặt, cổ, lưng, ngực, bụng, tay, chân và da đầu.

Khi tiến hành xét nghiệm, kết quả cho thấy sự hiện diện của những sợi nấm ngắn và to, hoặc trong một số trường hợp, không phát hiện được sợi nấm nào Bên cạnh đó, có sự xuất hiện của những tế bào hình quả lê màu sáng, thường tập trung thành từng đám.

2.2.2.2 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho nghiên cứu một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben của học sinh Để thuận tiện cho nghiên cứu và đảm bảo nếu có ca bệnh thì có sẵn phiếu điều tra KAP phân tích yếu tố liên quan, chúng tôi sử dụng cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho nghiên cứu tỷ lệ mắc bệnh lang ben Chúng tôi đã phỏng vấn kiến thức - thái độ - thực hành của 1357 học sinh theo phiếu điều tra đã đƣợc thiết kế sẵn

2.2.2.3 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho nghiên cứu xác định loài nấm

Sau khi nuôi cấy, cần lấy 1/3 số học sinh có mẫu bệnh phẩm mọc nấm trên môi trường nuôi cấy để tiến hành kỹ thuật PCR - RFLP.

Trong một nghiên cứu, chúng tôi đã thu thập mẫu bệnh phẩm từ 293 học sinh có nấm mọc trong môi trường nuôi cấy Do hạn chế về kinh phí, chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên 100 học sinh, từ đó phân tích 113 mẫu khuẩn lạc nấm lang ben để xác định loài bằng phương pháp PCR - RFLP Kết quả cho thấy 88 học sinh nhiễm nấm lang ben tại một vị trí, với mỗi mẫu nấm có một loại khuẩn lạc riêng biệt, trong khi 11 học sinh nhiễm nấm lang ben tại hai vị trí khác nhau.

Trong nghiên cứu tiến sĩ về Y học, một học sinh đã được phát hiện nhiễm nấm lang ben tại hai vị trí khác nhau Tại vị trí đầu tiên, có một mẫu nấm với một loại khuẩn lạc, trong khi tại vị trí thứ hai, mẫu nấm cho thấy sự hiện diện của hai loại khuẩn lạc khác nhau.

+ Trường THCS Đoàn Xá: 36 mẫu nấm lang ben của 27 học sinh

+ Trường THCS Lạc Viên: 24 mẫu nấm lang ben của 23 học sinh

+ Trường THCS Quang Hưng: 15 mẫu nấm lang ben của 15 học sinh + Trường THCS Vĩnh Niệm: 38 mẫu nấm lang ben của 35 học sinh

Sau khi xác định loài nấm bằng phương pháp PCR-RFLP, chúng tôi đã chọn 3 mẫu cho mỗi loài để gửi đi giải trình tự Tổng cộng, 7 mẫu nấm đã được thực hiện giải trình tự thành công.

2.2.2.4 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho nghiên cứu can thiệp điều trị

Bốc thăm ngẫu nhiên 1 trường ở nội thành và 1 trường ở ngoại thành Toàn bộ học sinh mắc bệnh lang ben đƣợc can thiệp điều trị

- Tiêu chuẩn chọn đối tƣợng nghiên cứu:

+ Học sinh và phụ huynh học sinh đồng ý tham gia điều trị

+ Học sinh tuân thủ điều trị

+ Học sinh có tiền sử dị ứng với thuốc bôi ketoconazole

+ Học sinh có bệnh da đang điều trị bằng các thuốc khác

Trong một nỗ lực điều trị bệnh lang ben, đã có 138 học sinh được can thiệp, bao gồm 103 học sinh từ trường Vĩnh Niệm và 35 học sinh từ trường Quang Hưng.

Tất cả học sinh mắc bệnh lang ben tại trường Lạc Viên và Đoàn Xá được kê đơn và hướng dẫn điều trị

2.2.2.5 Cỡ mẫu và cách chọn mẫu cho nghiên cứu can thiệp truyền thông giáo dục sức khỏe

Tất cả học sinh từ bốn trường tham gia vào nghiên cứu đều tham gia các hoạt động truyền thông giáo dục sức khỏe Hiệu quả can thiệp đã được đánh giá trên tổng cộng 1.322 học sinh.

- Tiêu chuẩn chọn đối tƣợng nghiên cứu: học sinh tham gia đầy đủ các hoạt động truyền thông giáo dục sức khỏe

2.2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu

Can thiệp điều trị bằng thuốc bôi Etoral

- Phỏng vấn KAP về bệnh lang ben (+)

Can thiệp TTGDSK tại 4 trường

Mô tả một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben Đánh giá hiệu quả can thiệp TTGDSK Định danh loài nấm

Malassezia spp Đánh giá hiệu quả can thiệp điều trị

Có bệnh (Mô tả thực trạng bệnh lang ben)

Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu thực trạng nhiễm và một số yếu tố liên quan nhiễm nấm lang ben ở học sinh tại Hải Phòng

- Mô tả tỷ lệ bệnh lang ben, tỷ lệ bệnh lang ben theo giới và địa dƣ

- Mô tả tỷ lệ đặc điểm lâm sàng của bệnh lang ben

- Mô tả kiến thức - thái độ - thực hành của học sinh về bệnh lang ben

Nhiễm nấm lang ben thường liên quan đến một số yếu tố như cơ địa ra mồ hôi nhiều, kiến thức và thái độ của học sinh về bệnh Việc tắm ngay sau khi đi học về, sử dụng xà phòng sữa tắm, và không dùng chung quần áo với người thân là những thói quen cần thiết để phòng ngừa Ngoài ra, giặt quần áo hàng ngày cũng đóng vai trò quan trọng trong việc giảm nguy cơ lây nhiễm.

2.3.2 Nghiên cứu xác định thành phần loài nấm lang ben ở học sinh tại

- Xác định thành phần các loài nấm gây bệnh lang ben cho học sinh

- Mô tả sự phân bố loài nấm theo giới tính, địa dư, vị trí tổn thương

- So sánh trình tự gen của các loài nấm đƣợc phân lập với các trình tự trên thế giới và đăng ký trên ngân hàng gen

2.3.3 Nghiên cứu can thiệp tại cộng đồng

- Đánh giá kết quả điều trị sau 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng về tổn thương thay đổi màu sắc trên da và kết quả nuôi cấy nấm

- Đánh giá hiệu quả can thiệp giáo dục sức khỏe sau 6 tháng.

Vật liệu nghiên cứu

2.4.1 Vật liệu cho xét nghiệm nấm trực tiếp và nuôi cấy

Để thực hiện các thí nghiệm sinh học, cần chuẩn bị những dụng cụ sau: dao mổ cùn vô khuẩn, lam kính, lá kính, giá để lam kính, kính hiển vi quang học, tăm bông vô khuẩn, tủ ấm và tủ an toàn sinh học cấp 2 Những dụng cụ này đảm bảo tính chính xác và an toàn trong quá trình nghiên cứu.

- Hóa chất: bông cồn 70 0 ; dung dịch xanhmethylen; môi trường nuôi cấy CHROMagar TM Malassezia

2.4.2 Vật liệu cho nghiên cứu xác định thành phần loài nấm

- Trang thiết bị cơ bản thực hiện kỹ thuật PCR - RFLP: tủ an toàn sinh học cấp 2, máy ly tâm lạnh 5415 R (Eppendorf), máy Vortex V-1 plus, máy ủ

The doctoral thesis in medical science explores advanced laboratory equipment, including the Eppendorf Thermomixer Comfort, water bath, spin-down centrifuge, PCR mixing chamber, DNA sample loading chamber, and the Eppendorf Mastercycler PCR machine from Germany It also examines the ChemiDoc™ MP gel imaging system and PCR product electrophoresis kit from Bio-Rad, USA, as well as the NanoDrop spectrophotometer for DNA concentration measurement.

Để thực hiện các thí nghiệm chính xác, bạn cần chuẩn bị một số dụng cụ thiết yếu như cân điện tử, tủ lạnh với nhiệt độ -20°C và -80°C (Sanyo), lò vi sóng (Sanyo), bộ pipetman (Gilson) cùng với các đầu côn có dung tích 10µl, 200µl và 1000µl Ngoài ra, cần có ống eppendorf 1,5ml và các loại ống falcon 15ml, 50ml để phục vụ cho việc lưu trữ và xử lý mẫu.

- Bộ kit tách DNA tổng số QIAamp DNA extraction kit của hãng QIAGEN Inc, Mỹ và hóa chất cần thiết khác

- Các cặp mồi để khuếch đại các đoạn gen cho kỹ thuật PCR - RFLP:

- Các cặp mồi để khuếch đại các đoạn gen cho kỹ thuật giải trình tự:

+ ITS5 (5’ - GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG - 3’) + NL1 (5’ - GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG - 3’) + NL4 (5’ - GGTCCGTGTTTCAAGACGG - 3’)

- Các enzyme giới hạn: AluI, BanI, MspAI

- Các hóa chất cần thiết khác: Mastermix (promega); thang DNA chuẩn loại 50bp, 100bp (Fermentag, Norgen ); dung dịch TBE 0.5X; bột gel agarose; redsef; ethanol 70 0 ; cồn tuyệt đối; giấy parafin

2.4.3 Vật liệu cho nghiên cứu can thiệp điều trị

- Thuốc bôi tại chỗ etoral 5g (ketoconazol 0,1g), số đăng ký VD -

22762 - 15, ngày sản xuất: 07/01/2015, hạn sử dụng: 23/01/2018 Nhà sản xuất: Công ty cổ phần dƣợc Hậu Giang

2.4.4 Vật liệu cho nghiên cứu can thiệp truyền thông giáo dục sức khỏe

- Bài truyền thông trực tiếp về bệnh lang ben tại các lớp học

- Tờ rơi về bệnh lang ben (phụ lục 6)

- Bài phát thanh măng non về bệnh lang ben (phụ lục 7 và 8).

Phương pháp thu thập số liệu và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 46 1 Khám lâm sàng

- Khai thác bệnh sử, tiền sử, thời gian mắc bệnh và các triệu chứng cơ năng

- Khám lâm sàng: đối tƣợng nghiên cứu đƣợc khám phát hiện tổn thương là các dát thay đổi màu sắc trên da (vị trí, tính chất)

- Các thông tin thu đƣợc ghi theo mẫu phụ lục 3

2.5.2 Kỹ thuật xét nghiệm nấm trực tiếp

Trong trường hợp bệnh nhân có tổn thương tại nhiều vị trí, mỗi vị trí lấy một mẫu bệnh phẩm để làm xét nghiệm

+ Bộc lộ tổn thương, sát trùng bằng cồn 70 0

+ Dùng dao mổ cùn cạo lấy vảy da ở tổn thương

+ Trộn vảy da đã thu hồi đƣợc vào một giọt xanhmethylen đã đƣợc nhỏ lên lam kính Đậy lá kính

+ Để ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi soi dưới kính hiển vi

Khi xét nghiệm, nếu phát hiện tế bào nấm men có hình tròn hoặc bầu dục với đường kính từ 3 - 6 micromet, xếp thành từng đám từ 10 - 30 tế bào, cùng với một số tế bào nấm men sinh sản bằng cách mọc chồi nhỏ bên cạnh, thì kết quả được coi là dương tính Ngoài ra, có thể thấy các sợi nấm giống như miến vụn, thường được gọi là "mì ống và thịt viên".

+ Âm tính (-): khi soi ít nhất 30 vi trường mà không thấy tế bào nấm

- Môi trường nuôi cấy nấm lang ben là môi trường CHROMagar TM

Malassezia thành phần gồm: agar 15.0, peptones and extracts 38.0, chloramphenicol 0.5, chromogenic mix 2.8, glycerol và Tween 60

+ Hòa tan 56,3g bột khô trong 1 lít nước cất

+ Thêm 2 g glycerol và 10 g Tween 60 Khuấy đều

Đun hỗn hợp trong lò vi sóng, sau mỗi lần sôi, hãy lấy ra, lắc nhẹ và tiếp tục đun cho đến khi thạch tan hoàn toàn.

Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ 45°C - 50°C, sau đó đổ vào ống nghiệm và đặt trên giá nghiêng cho đến khi môi trường đông đặc lại Cuối cùng, bảo quản ống nghiệm trong tủ lạnh, tránh ánh sáng và sự mất nước.

+ Để môi trường ở nhiệt độ phòng trước khi cấy

+ Ghi tên, tuổi học sinh và ngày cấy

+ Bộc lộ tổn thương, sát trùng bằng cồn 70 0

+ Dùng dao mổ cùn cạo lấy vảy da ở tổn thương

+ Dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ướt bằng nước muối sinh lý lấy bệnh phẩm từ dao mổ cùn

+ Dùng ngón cái và ngón trỏ tay trái hé mở nút bông

+ Ria cấy dàn trên mặt thạch theo một đường zic-zac, đậy bằng nút bông

+ Để tủ ấm 32 0 C, theo dõi hàng ngày trong 3 - 5 ngày đến 2 tuần

+ Có mọc nấm: Màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường CHROMagar TM

Malassezia được đọc theo hướng dẫn của nhà sản xuất từ hồng đến tím, kích thước khuẩn lạc: nhỏ (< 1 mm), trung bình (1 - 2 mm), lớn (2 - 5 mm)

Bảng 2.1 Đặc điểm khuẩn lạc nấm Malassezia spp trên môi trường

STT Loài Kích thước Màusắc Hình thái

2 M furfur Lớn Hồng Nhăn nheo

4 M dermatis Lớn Hồng đến đỏ tía Nhẵn

7 M obtusa Trung bình Hồng Xù xì

8 M globosa Nhỏ Đỏ tía Nhẵn

+ Không mọc nấm: không thấy có khuẩn lạc mọc trên môi trường nuôi cấy sau 14 ngày

- Lưu mẫu: các khuẩn lạc nấm được lưu trong nước muối sinh lý để thực hiện kỹ thuật PCR - RFLP và lưu trong glycerol 50% bảo quản ở - 80 0 C

2.5.4 Kỹ thuật thực hiện phản ứng PCR - RFLP

Kỹ thuật PCR - RFLP được áp dụng để xác định các loài nấm lang ben được phân lập từ đối tượng nghiên cứu Các loài nấm gây bệnh lang ben thuộc cùng một giống, do đó việc sử dụng phương pháp này giúp phân biệt chính xác các loài.

Malassezia có trình tự nucleotide tương tự nhau, do đó việc lựa chọn enzyme giới hạn thích hợp để cắt sản phẩm PCR với cặp mồi chung là rất quan trọng nhằm phân biệt các loại Malassezia.

Luận án tiến sĩ Y học nấm là phương pháp tối ưu giúp rút ngắn thời gian phân tích, đồng thời đảm bảo hiệu quả và tiết kiệm chi phí.

Cặp gen đích: một phần đoạn 5.8S, một phần đoạn 26S và đoạn giao gen ITS2

+ Chuẩn bị mẫu nấm: mẫu nấm được lưu trong nước muối sinh lý

+ Hỳt 250 àl mẫu nấm lưu trong nước muối sinh lý sang eppendorf mới, ghi tên mẫu

+ Ly tâm mẫu nấm 7500 vòng/10 phút

+ Hút bỏ dịch nổi, để lại phần cặn

+ Thờm 250 àl buffer sorbitol và 20 àl enzyme liticase, sau đú trộn đều

+ Votex nhanh trước khi ủ để trộn đều enzyme bằng máy votex

+ Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn

+ Thờm 200 àl dung dịch đệm CL, 20 àl protein K và 5 àl RnaseA, trộn đều + Ủ 56 0 C trong 10 - 30 phút

+ Thờm 200 àl BL buffer và trộn đều lõu bằng mỏy votex

+ Hỳt 350 - 400 àl dịch nổi cho eppendorf mới, bỏ dịch cặn đi

+ Hút hết dịch trong eppendorf đã ly tâm sang eppendorf mới có màng lọc silical

Để loại bỏ dịch lỏng trong ống Eppendorf, bạn cần nhấc phần ống chứa màng lọc ra, đổ bỏ dịch trong ống, sau đó vẩy khô và đặt lại ống Eppendorf có màng lọc vào vị trí ban đầu.

+ Loại bỏ dịch bên dưới như bước trên

+ Ly tâm khô 13000 vòng/1 phút

+ Nhấc phần eppendorf có màng lọc sang eppendorf mới

+ Thờm 50 - 100 àl CE buffer Để ở nhiệt độ phũng 1 phỳt

+ Ly tâm 13000 vòng/1 phút Bỏ eppendorf có màng lọc

+ Bảo quản DNA thu đƣợc trong tủ - 20 0 C

Bước 2: Đo nồng độ DNA

Dung dịch DNA thu đƣợc đƣợc đo nồng độ trên máy NanoDrop 1000 Các bước thực hiện như sau:

+ Khởi động máy tính kết nối với thiết bị

+ Click đúp vào biểu tƣợng phần mềm của thiết bị Nanodrop 1000 trên desktop Một cửa sổ giao diện của phần mềm hiện ra

+ Tiếp tục click vào biểu tƣợng Nucleotid, khi đó có một cửa sổ giao diện mới hiện ra

Để sử dụng thiết bị, bạn cần mở nắp mắt quang, sau đó nhỏ 1 àl nước khử ion vào mắt quang Sau khi hoàn tất, hãy đóng nắp lại và nhấn chuột vào vị trí "OK" trong cửa sổ mới trên máy tính.

Dùng khăn giấy khô lau sạch nước trên mắt thiết bị, sau đó nhỏ 1 giọt vào đó Đóng nắp mắt thiết bị và nhấn phím Blank trên giao diện phần mềm hiển thị trên máy tính.

Để thực hiện đo lường DNA, hãy đặt một khăn giấy khô lên bề mặt thiết bị và nhỏ 1 àl dung dịch DNA cần đo vào đó Sau đó, đóng nắp thiết bị và nhấp chuột vào vị trí "Measurement" Chỉ sau vài giây, kết quả đo sẽ hiển thị trên màn hình máy tính với các thông số quan trọng như nồng độ và chỉ số OD (260/280).

+ Các mẫu tiếp theo cần đo lặp lại như ở bước trên

+ Kết thúc đo, kết quả đo được ghi chép và lưu trên máy tính

Bước 3: Khuếch đại đoạn DNA bằng cặp mồi ITS3 và ITS4

+ Chuẩn bị dung dịch để mix:

STT Thành phần phản ứng Số lƣợng

+ Chuẩn bị eppendorf: chứng dương, chứng âm và bệnh nhân

+ Mix 4 phần: Nước khử ion, Master mix, mồi ITS3 và mồi ITS4 vào 1 eppendorf

+ Chia 25 àl dung dịch đó mix vào mỗi eppendorf đƣợc chuẩn bị sẵn

+ Thờm 5 àl nước khử ion vào eppendorf chứng õm

+ Thờm 5 àl DNA chứng dương vào eppendorf chứng dương

+ Thờm 5 àl DNA mẫu DNA bệnh nhõn vào eppendorf bệnh nhõn

+ Xếp vào máy chạy PCR

STT Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

+ Sản phẩm phản ứng PCR đƣợc bảo quản ở 4 0 C

Bước 4: Điện di sản phẩm PCR

+ Chuẩn bị thạch agarose 2%: 2 g thạch, 130 ml dung dịch TBE 0,5X và 7 àl redsef

Để làm tan agarose, hãy lắc đều và đậy kín bằng giấy bạc trước khi cho vào lò vi sóng Khi agarose sôi, hãy lấy ra lắc nhẹ và tiếp tục đun sôi cho đến khi thạch hoàn toàn tan chảy.

+ Để nguội khoảng 20 phút thì đổ vào khay đã cài sẵn lƣợc Khi thạch đông thì đặt khay thạch vào bể điện di

+ Hỳt 8 àl sản phẩm PCR trộn đều với 1 giọt dung dịch Loading Dye Purple rồi nhỏ vào giếng điện di

+ Hỳt 8 àl marker 100bp nhỏ vào giếng điện di

+ Đặt thời gian điện di: Điện thế: 105 V; Cường độ: 200 mA; Thời gian: 1h30 + Đọc kết quả dựa trên thang ADN chuẩn (100bp) của hãng Invitrogen

Bước 5: Cắt và điện di sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn

- Cắt và điện di sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Alu I

+ Chuẩn bị dung dịch để mix:

+ Chuẩn bị thạch 2,5%: 2,5 g thạch, 130 ml dung dịch TBE 0,5X và 7 àl redsef

+ Cách nấu thạch và đổ thạch điện di tương tự bước 4

+ Điện di: hỳt 10 àl sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme AluI trộn với dung dịch Loading Duye Purple nhỏ vào giếng điện di

+ Đặt chế độ điện di: Điện thế: 105 V; Cường độ: 200 mA; Thời gian: 2h30 + Đọc kết quả dựa trên thang DNA chuẩn (100bp) của hãng Invitrogen

- Cắt và điện di sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Ban I

+ Chuẩn bị dung dịch mix:

+ Chuẩn bị thạch và điện di giống nhƣ với enzyme AluI

- Cắt và điện di sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn MspA I

+ Chuẩn bị dung dịch mix:

+ Chuẩn bị thạch và điện di giống nhƣ với enzyme AluI

Nhận định kết quả: Kích thước sản phẩm khuếch đại với mồi ITS3, ITS4 và các đoạn giới hạn sau khi phân cắt bằng enzyme giới hạn AluI, BanI,

MspAI đƣợc đánh giá theo nghiên cứu của Rudramurthy SM (bảng 2)

Bảng 2.2 Kích thước sản phẩm khuếch đại và các đoạn giới hạn sau khi phân cắt bằng enzyme giới hạn [104]

PCR (bp) Alu I (bp) Ban I (bp) MspA I (bp)

Sản phẩm PCR đƣợc gửi giải trình tự tại công ty First BASE Laboratories Sdn Bhd (Malaysia)

Gen đích: vùng D1/D2 của gen 26S

Cặp mồi ITS5 và NL4 là công cụ quan trọng trong việc khuếch đại sản phẩm PCR Sản phẩm này đã được tinh sạch và giải trình tự bằng mồi NL1 và NL4 Sau khi giải trình tự, các mẫu nấm được phân tích kỹ lưỡng.

Luận án tiến sĩ Y học sử dụng phương pháp trình tự gen để so sánh và xác định các mẫu gen Quá trình này cho phép định danh và đăng ký thông tin gen trên ngân hàng gen, cụ thể là GenBank, một cơ sở dữ liệu quan trọng thuộc NCBI Việc này không chỉ hỗ trợ trong nghiên cứu y học mà còn nâng cao khả năng truy cập và chia sẻ thông tin gen trong cộng đồng khoa học.

Cây phả hệ được xây dựng dựa trên đoạn gen 26S bằng chương trình MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor-Joining) với hệ số tin cậy bootstrap đạt 1000.

Hình 2.4 Sơ đồ cặp mồi ITS3 và ITS4, NL1 và NL4

2.5.6 Kỹ thuật phỏng vấn cộng đồng

Chúng tôi đã tiến hành phỏng vấn đối tượng nghiên cứu tại các trường học nhằm thu thập dữ liệu về tuổi, giới tính, kiến thức, thái độ và thực hành liên quan đến bệnh lang ben và biện pháp phòng chống Bộ câu hỏi được thiết kế sẵn đã được sử dụng trước và sau can thiệp truyền thông giáo dục sức khỏe Để đảm bảo độ chính xác trong quá trình phỏng vấn, các điều tra viên, bao gồm giáo viên chủ nhiệm và cán bộ của Bộ môn Ký sinh trùng - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng, đã được tập huấn kỹ lưỡng.

2.5.7 Can thiệp tại cộng đồng

Các biến số và chỉ số nghiên cứu

- Địa dƣ: nội thành, ngoại thành

2.6.2 Đặc điểm bệnh lang ben

- Vị trí: mặt, cổ, lƣng, ngực, bụng, tay, vai

- Ngứa: ngứa thường xuyên, ngứa khi ra mồ hôi, không ngứa

Màu sắc dát là thương tổn phẳng trên da, có hình dạng tròn, bầu dục hoặc đa cung Đánh giá màu sắc của dát được thực hiện dựa trên các tiêu chí cụ thể.

+ Dát trắng: có màu nhạt hơn sắc tố da bình thường

+ Dát hồng: dát có màu hồng so với da bình thường

+ Rải rác: các dát tổn thương nằm rải rác tại các vị trí tổn thương

Các dát tổn thương thường tập trung tại những vị trí cụ thể, tạo thành các mảng liên kết với nhau.

- Thời gian mắc bệnh: tính từ thời điểm đầu tiên xuất hiện triệu chứng đến thời điểm khám

2.6.3 Kiến thức - thái độ - thực hành của học sinh về bệnh lang ben

- Biết bệnh lang ben: học sinh có biết tên bệnh lang ben

- Biết đúng tác nhân gây lang ben: học sinh biết tác nhân gây bệnh lang ben là nấm

- Biết đúng khả năng lây: học sinh biết bệnh lang ben có lây nhƣng khó lây

- Biết biểu hiện của bệnh lang ben: học sinh kể đƣợc biểu hiện của bệnh lang ben (ngứa, có thay đổi màu sắc da hoặc cả hai)

Để phòng bệnh lang ben hiệu quả, học sinh cần nắm vững một số biện pháp phòng ngừa như giữ vệ sinh cá nhân, không chia sẻ đồ dùng cá nhân và thường xuyên kiểm tra sức khỏe da Nếu không biết đến các biện pháp này, học sinh sẽ gặp khó khăn trong việc bảo vệ bản thân khỏi bệnh lang ben.

- Thái độ về bệnh lang ben:

+ Thái độ đúng: học sinh tâm sự với bố mẹ hoặc bạn thân

+ Thái độ chƣa đúng: học sinh cảm thấy buồn, mất tự tin hoặc không nói với ai về tình trạng bệnh

- Tiền sử bản thân: bản thân học sinh đã có biểu hiện bệnh lang ben trước đó và đã được điều trị

- Tiền sử gia đình: những người thân sống cùng với học sinh đã hoặc đang mắc bệnh lang ben

- Cơ địa ra mồ hôi nhiều: học sinh ra nhiều mồ hôi hơn bình thường đặc biệt với biểu hiện lòng bàn tay ẩm ƣớt

- Tắm ngay: học sinh tắm ngay sau khi đi học về hoặc sau các hoạt động thể lực

- Dùng xà phòng, sữa tắm: học sinh có dùng xà phòng hoặc sữa tắm hoặc cả hai khi tắm

- Mặc chung: học sinh mặc chung quần áo với người thân trong gia đình hoặc bạn bè hoặc cả hai

- Giặt hàng ngày: học sinh thay giặt quần áo hàng ngày, thay giặt quần áo mặc trong hàng ngày vào mùa đông

2.6.4 Các chỉ tiêu đánh giá

- Triệu chứng dát tổn thương thay đổi màu sắc trên da trước và sau điều trị: có, không

- Kết quả xét nghiệm nấm trước và sau điều trị

- Đánh giá tác dụng không mong muốn của thuốc: nóng rát, kích ứng da

- Tái phát: học sinh đã đƣợc điều trị khỏi sau đó mắc bệnh lại

- Chỉ số đánh giá hiệu quả can thiệp TTGDSK:

Trong đó: + PV (Preventive value): Hiệu quả can thiệp

+ p 1 : Tỷ lệ trước can thiệp

+ p 2 : Tỷ lệ sau can thiệp

Các biện pháp khống chế sai số

- Thiết kế nghiên cứu chặt chẽ, cỡ mẫu đủ lớn

- Các công cụ thu thập số liệu là các biểu mẫu đƣợc chuẩn bị đầy đủ, chi tiết

Bộ phiếu phỏng vấn được thiết kế một cách rõ ràng và dễ hiểu, đảm bảo tính thống nhất trong nhóm điều tra Các điều tra viên đã trải qua quá trình tập huấn đầy đủ về nội dung và phương pháp thu thập thông tin trước khi tiến hành khảo sát thực địa.

Các kỹ thuật xét nghiệm do cán bộ chuyên ngành ký sinh trùng thực hiện tại phòng xét nghiệm của Bộ môn Ký sinh trùng - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng và Bộ môn Sốt rét - Ký sinh trùng được tiến hành đúng quy trình.

- Côn trùng - Học viện Quân y

- Kiểm tra và làm sạch số liệu trước khi xử lý.

Phương pháp xử lý số liệu

- Số liệu đƣợc nhập và xử lý bằng phần mềm thống kê y sinh học SPPS 20.0

- Các biến định tính được mô tả dưới dạng tỷ lệ % và được trình bày dưới dạng bảng và biểu đồ

- So sánh sự khác biệt giữa các biến định tính bằng test  2 với mức ý nghĩa 5%, khoảng tin cậy 95%

Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng kiểm định  2 và tỷ lệ odds (OR) với mức ý nghĩa 5% và khoảng tin cậy 95% để đánh giá sự khác biệt trong các mối liên quan của kết quả nghiên cứu.

- Kết quả giải trình tự đƣợc đăng ký và phân tích phả hệ trên ngân hàng gen http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

- Cây phả hệ đƣợc xây dựng bằng phần mềm Mega6.06.

Đạo đức trong nghiên cứu

- Nghiên cứu đã đƣợc Hội đồng y đức của Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung Ƣơng thông qua

Học sinh sẽ được thông báo và giải thích rõ ràng về mục đích, yêu cầu và lợi ích của nghiên cứu trước khi tham gia Sự tham gia của học sinh hoàn toàn tự nguyện, và họ có quyền rút lui bất kỳ lúc nào mà không bị xử lý hay khiển trách Những học sinh không muốn hợp tác sẽ không được đưa vào nghiên cứu.

Tất cả học sinh và phụ huynh đều phải có văn bản đồng ý tham gia nghiên cứu và điều trị, đặc biệt đối với những học sinh tham gia điều trị.

Thông tin và số liệu được bảo mật và chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu Kết quả nghiên cứu và ý kiến đề xuất sẽ được sử dụng để cải thiện sức khỏe của học sinh, không phục vụ cho bất kỳ mục đích nào khác.

Xét nghiệm nấm là một quy trình đơn giản, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe và tâm lý của học sinh Tất cả học sinh, dù có nhiễm nấm hay không, đều được tham gia các hoạt động truyền thông giáo dục sức khỏe nhằm nâng cao nhận thức và thực hành phòng chống bệnh lang ben.

Dựa trên kết quả nghiên cứu, bài viết đề xuất các khuyến nghị thiết thực nhằm nâng cao hiệu quả công tác phòng chống bệnh lang ben và các bệnh nấm da khác Những khuyến nghị này sẽ góp phần quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe cộng đồng và giảm thiểu sự lây lan của các bệnh lý này.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 tại Hải Phòng năm 2016

3.1.1 Một số thông tin về đối tượng nghiên cứu

Bảng 3.1 Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo giới (n = 1357)

Ngoại thành Nội thành Tổng

Nhận xét: Nhìn chung số học sinh nam và học sinh nữ là tương đương

Hình 3.1 Phân bố đối tƣợng nghiên cứu theo địa dƣ (n = 1357)

Nhận xét: Đối tƣợng nghiên cứu gồm 578 học sinh ở ngoại thành chiếm tỷ lệ 42,6%, 779 học sinh ở nội thành chiếm tỷ lệ 57,4%

3.1.2 Thực trạng bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15

Hình 3.2 Kết quả xét nghiệm nấm trực tiếp (n = 332)

Trong một nghiên cứu về 332 học sinh có tổn thương da dạng dát màu, có 305 học sinh cho kết quả xét nghiệm nấm trực tiếp dương tính với nấm men Malassezia spp, chiếm tỷ lệ 91,9% Ngược lại, chỉ có 27 học sinh có kết quả xét nghiệm âm tính với nấm men này, tương ứng với tỷ lệ 8,1%.

Hình 3.3 Tỷ lệ bệnh lang ben của học sinh (n = 1357)

Trong một nghiên cứu, có 305 học sinh mắc bệnh lang ben trong tổng số 1.357 học sinh được khám và xét nghiệm trực tiếp, chiếm tỷ lệ 22,5% Ngược lại, tỷ lệ học sinh không mắc bệnh lang ben là 77,5%.

Bảng 3.2 Tỷ lệ bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 theo địa dƣ (n = 1357) Địa dƣ Số mẫu

Mắc bệnh Không mắc bệnh

Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) p

Nhận xét: Tỷ lệ mắc bệnh lang ben ở học sinh ngoại thành là 22,5% bằng với tỷ lệ mắc bệnh lang ben của học sinh ở nội thành

Bảng 3.3 Tỷ lệ bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 theo giới tính (n = 1357)

Mắc bệnh Không mắc bệnh

Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) p

Nhận xét: Học sinh nam của 4 trường mắc bệnh lang ben chiếm tỷ lệ

21,9%, học sinh nữ mắc bệnh lang ben chiếm tỷ lệ 23,1% Sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05

Bảng 3.4 Tỷ lệ bệnh lang ben theo tiền sử mắc bệnh (n = 305)

Tiền sử bệnh Tiền sử bản thân Tiền sử gia đình

Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Trong nghiên cứu, có 22 học sinh mắc bệnh lang ben trước đó, chiếm tỷ lệ 7,2% Ngoài ra, 15 học sinh, tương đương 4,9%, có người thân trong gia đình cũng bị mắc bệnh lang ben.

Hình 3.4 Phân bố vị trí tổn thương lang ben (n = 305)

Hình 3.4 cho thấy phân bố vị trí tổn thương lang ben, trong đó lưng là vị trí phổ biến nhất, chiếm 41,7% Các vị trí khác như mặt, cổ và ngực có tỷ lệ thấp hơn lần lượt là 20,0%, 14,4% và 12,1% Những vị trí khác ít gặp hơn cũng có tỷ lệ thấp Đặc biệt, có 16 học sinh bị tổn thương lang ben ở hai vị trí trên cơ thể, chiếm 5,2%.

Bảng 3.5 Triệu chứng cơ năng của bệnh lang ben (n = 305)

Triệu chứng Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Ngứa khi ra mồ hôi 57 18,7

Lƣng Mặt Cổ Ngực Bụng Tay Vai Hai vị trí

Đa số học sinh mắc bệnh lang ben không có biểu hiện ngứa, chiếm tỷ lệ 74,8% Trong khi đó, 18,7% học sinh cảm thấy ngứa khi ra mồ hôi, và chỉ có 6,1% học sinh gặp tình trạng ngứa thường xuyên.

Bảng 3.6 Đặc điểm lâm sàng của bệnh lang ben (n= 305)

Triệu chứng Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Dát thay đổi màu sắc da

Tất cả học sinh mắc bệnh lang ben đều có sự thay đổi màu sắc trên da, trong đó 97% học sinh xuất hiện dát tổn thương màu trắng, trong khi chỉ có 3% học sinh có dát tổn thương màu hồng.

Đa số trường hợp tổn thương lang ben xuất hiện rải rác, chiếm tỷ lệ 83,6%, trong khi chỉ có một tỷ lệ nhỏ 3,6% có tổn thương lan rộng thành đám.

Bảng 3.7 Thời gian mắc bệnh lang ben (n= 305)

Thời gian mắc bệnh Số lƣợng Tỷ lệ (%)

Phần lớn học sinh, lên tới 80,3%, không nhớ hoặc không biết mình mắc bệnh lang ben từ khi nào Chỉ một số ít có khả năng xác định thời gian mắc bệnh.

3.1.3 Kiến thức - thái độ - thực hành của học sinh về bệnh lang ben

Bảng 3.8 Kiến thức của học sinh về bệnh lang ben

Biết đúng tác nhân gây LB

Biết đúng khả năng lây

Thay đổi màu da 123 21,3 67 8,6 190 14,0 < 0,01 Biết 2 biểu hiện 26 4,5 38 4,9 64 4,7 > 0,05 Không biết 395 68,3 619 79,5 1014 74,7 < 0,01

- Có 33,2% học sinh biết về bệnh lang ben, học sinh ở ngoại thành biết nhiều hơn học sinh ở nội thành (40,0% so với 28,2%) có ý nghĩa thống kê với p < 0,01

- Có 19,5% số học sinh biết đúng tác nhân gây bệnh lang ben là nấm trong đó học sinh ngoại thành cũng biết nhiều hơn học sinh nội thành (25,3%

Luận án tiến sĩ Y học so với 15,1%) có ý nghĩa thống kê với p < 0,01 Số học sinh còn lại biết sai hoặc không biết tác nhân gây bệnh lang ben

Chỉ có 84 học sinh, chiếm 6,2%, nhận thức đúng về khả năng lây lan của bệnh lang ben, với tỷ lệ học sinh ở ngoại thành (11,4%) cao hơn đáng kể so với học sinh nội thành (2,3%) Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p.

Theo nghiên cứu, 6,6% học sinh nhận biết triệu chứng ngứa, trong khi 14,0% học sinh hiểu biết về bệnh lang ben, một căn bệnh làm thay đổi màu sắc da Đặc biệt, học sinh ở khu vực ngoại thành có kiến thức về bệnh này cao hơn, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).

Bảng 3.9 Kiến thức của học sinh về điều trị và phòng bệnh lang ben

Theo khảo sát, 31,1% học sinh nhận thức rằng bệnh lang ben cần được điều trị, trong khi chỉ có 27,0% biết rằng bệnh này có thể được chữa khỏi Bên cạnh đó, cũng có 27,0% học sinh nắm rõ các biện pháp phòng ngừa bệnh lang ben Đặc biệt, kiến thức về điều trị và phòng bệnh lang ben của học sinh ngoại thành cao hơn so với học sinh nội thành, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).

Bảng 3.10 Thái độ của học sinh về bệnh lang ben

Tâm sự với bố mẹ 500 86,5 691 88,7 1191 87,8 > 0,05 Tâm sự với bạn thân 133 23,0 114 14,6 247 18,2 < 0,01 Buồn, mất tự tin 23 4,0 41 5,3 64 4,7 > 0,05 Không nói với ai 59 10,2 51 6,5 110 8,1 < 0,05 p < 0,05 < 0,05 < 0,05

Đa số học sinh (87,8%) có thái độ tích cực khi mắc bệnh lang ben, trong khi chỉ một số ít cảm thấy buồn và mất tự tin (4,7%) và không tâm sự với ai (8,1%).

Bảng 3.11 Thực hành của học sinh phòng chống bệnh lang ben

Dùng xà phòng, sữa tắm

Theo khảo sát, 51,1% học sinh tắm ngay khi trở về từ trường, 88,0% sử dụng xà phòng sữa tắm trong quá trình tắm, và 69,3% học sinh giặt quần áo hàng ngày, cho thấy thói quen vệ sinh cá nhân của học sinh ở cả nội thành và ngoại thành là tương đương.

- Đa số học sinh không mặc chung quần áo (95,2%), ngoại thành không mặc chung (97,4%) nhiều hơn có ý nghĩa thống kê so với học sinh ngoại thành (93,6%)

3.1.4 Một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh 11 - 15 tuổi

Bảng 3.12 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với cơ địa của học sinh

Nghiên cứu cho thấy có mối liên hệ giữa bệnh lang ben và tình trạng ra mồ hôi nhiều ở học sinh Cụ thể, học sinh có hiện tượng ra mồ hôi nhiều có nguy cơ mắc bệnh lang ben cao gấp 1,44 lần so với các học sinh khác, với ý nghĩa thống kê p < 0,01 (CI95% = 1,10 - 1,88).

Bảng 3.13 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với kiến thức về bệnh học bệnh lang ben của học sinh

Biết tác nhân gây LB

Nhận xét : Không tìm thấy mối liên quan giữa bệnh lang ben với kiến thức của học sinh về bệnh lang ben

Bảng 3.14 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với kiến thức về điều trị và phòng bệnh lang ben của học sinh

OR = 0,870; CI95% = 0,663 - 1,142; p > 0,05 Điều trị khỏi

Nhận xét : Không tìm thấy mối liên quan giữa bệnh lang ben với kiến thức của học sinh về điều trị và phòng bệnh bệnh lang ben

Bảng 3.15 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với thái độ của học sinh

Nhận xét : Không tìm thấy mối liên quan giữa bệnh lang ben với thái độ của học sinh về bệnh lang ben

Bảng 3.16 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố tắm ngay sau khi đi học về

Nhận xét : Không tìm thấy mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố tắm ngay sau khi đi học về

Bảng 3.17 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố dùng xà phòng, sữa tắm khi tắm

Dùng xà phòng, sữa tắm

Nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa việc sử dụng xà phòng và sữa tắm với nguy cơ mắc bệnh lang ben Học sinh không sử dụng xà phòng và sữa tắm khi tắm có nguy cơ mắc bệnh này cao gấp 1,5 lần so với những học sinh sử dụng sản phẩm này, với ý nghĩa thống kê p < 0,05 (CI95% = 1,020 - 2,119).

Bảng 3.18 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố giặt quần áo hàng ngày

Nhận xét : Không tìm thấy mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố giặt quần áo hàng ngày

Bảng 3.19 Mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố mặc chung quần áo

Nhận xét : Không tìm thấy mối liên quan giữa bệnh lang ben với yếu tố mặc chung quần áo với bạn bè và người thân trong gia đình

Thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben

Hình 3.5 Kết quả nuôi cấy nấm (n = 321)

Trong một nghiên cứu về nấm da, 305 học sinh đã được kiểm tra với 321 mẫu bệnh phẩm từ vảy da soi trực tiếp Kết quả cho thấy có 16 học sinh có tổn thương tại 2 vị trí khác nhau Các mẫu bệnh phẩm này đã được nuôi cấy trên môi trường CHROMagar TM Malassezia, trong đó 309 mẫu nuôi cấy của 293 học sinh cho kết quả dương tính, chiếm tỷ lệ 96,3% Ngược lại, 12 mẫu nuôi cấy từ 12 học sinh không phát hiện nấm, chiếm tỷ lệ 3,7%.

3.2.1 Kết quả định danh các loài nấm bằng kỹ thuật PCR - RFLP

Chúng tôi đã thu thập 113 mẫu nấm từ 100 học sinh, trong đó 88 học sinh có tổn thương lang ben tại một vị trí, 11 học sinh có tổn thương tại hai vị trí, và một học sinh có hai vị trí nhưng chỉ xuất hiện một loại khuẩn lạc khi nuôi cấy Tất cả các mẫu DNA đều được khuyếch đại thành công bằng cặp mồi ITS3 và ITS4 trong quá trình thực hiện kỹ thuật PCR - RFLP.

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4 của một số mẫu nấm lang ben

Nhận xét: Các mẫu nấm lang ben số 1, 2, 3, 4, 5, 7 có kích thước sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4 khoảng 548 bp Riêng mẫu nấm lang ben số

6 có kích thước sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4 khoảng > 500 bp nhưng nhỏ hơn các mẫu nấm khác

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn Alu I của một số mẫu nấm lang ben

Khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn AluI, các mẫu nấm lang ben số 1, 2, 3, 4, và 5 tạo ra hai băng với kích thước 308 bp và 240 bp Trong khi đó, mẫu nấm lang ben số 6 cho hai băng có kích thước khoảng 400 bp và lớn hơn 100 bp.

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn Ban I của một số mẫu nấm lang ben

Khi sử dụng enzyme giới hạn BanI để cắt sản phẩm PCR, mẫu nấm lang ben số 2 tạo ra 2 băng với kích thước lần lượt là 391 bp và 157 bp Trong khi đó, mẫu nấm lang ben số 3 cho 3 băng với kích thước 145 bp, 182 bp và 199 bp.

Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn MspA I của một số mẫu nấm lang ben

Khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn MspAI, mẫu nấm lang ben số 1, 3, 5, 7 cho band kích thước 527 bp, trong khi mẫu nấm lang ben số 2, 4, 6 cho band kích thước 497 bp.

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR (mồi ITS3, ITS4) và các mảnh cắt giới hạn bằng enzyme Alu I, Ban I, MspA I của nấm M furfur

(M: Marker 100 bp, 1: sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4,

2: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme AluI, 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme BanI, 4: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme MspAI)

Sản phẩm PCR sử dụng mồi ITS3 và ITS4 có kích thước 548 bp Khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn AluI, thu được 2 băng với kích thước 308 bp và 240 bp Sử dụng enzyme BanI để cắt sản phẩm PCR tạo ra 2 băng kích thước 391 bp và 157 bp.

MspAI cho 2 band có kích thước 527 bp và 21 bp Kết quả này phù hợp với

Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm PCR (mồi ITS3, ITS4) và các mảnh cắt giới hạn bằng enzyme Alu I, Ban I, MspA I của nấm M japonica

(M: Marker 100 bp, 1: sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4,

2: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme AluI, 3: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme BanI, 4: sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme MspAI)

- Sản phẩm PCR với mồi ITS3 và ITS4 có kích thước là 526 bp Khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn AluI cho 2 band có kích thước 393 bp

Luận án tiến sĩ Y học cho thấy khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn BanI, thu được 3 băng có kích thước 182 bp, 199 bp và 145 bp Đồng thời, khi sử dụng enzyme MspAI, kết quả cho 2 băng với kích thước 497 bp và 29 bp Những kết quả này phù hợp với đặc điểm của M japonica.

Bảng 3.20 Kích thước sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn bằng enzyme giới hạn

STT Số mẫu Sản phẩm

Tất cả các mẫu DNA đã được khuyếch đại thành công bằng cặp mồi ITS3 và ITS4 Trong số đó, 110 mẫu có kích thước tương ứng với Malassezia, và 3 mẫu có kích thước khoảng 300 bp.

Hình 3.12 Kết quả định danh bằng PCR - RFLP (n = 113)

Trong nghiên cứu với 113 mẫu nấm từ 100 học sinh, kết quả PCR - RFLP cho thấy 110 mẫu dương tính với Malassezia spp, chiếm tỷ lệ 97,3% Ngược lại, 3 mẫu không phải là Malassezia, chiếm tỷ lệ 2,7%.

Hình 3.13 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP (n = 110)

Nhận xét: Trong 110 mẫu có sản phẩm PCR đã định danh đƣợc 106 mẫu là M furfur chiếm tỷ lệ 96,4%, 4 mẫu là M japonica chiếm tỷ lệ 3,6%

Bảng 3.21 Đơn nhiễm và đa nhiễm các loài nấm định danh bằng PCR - RFLP

Vị trí Loài Số học sinh Số mẫu nấm n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%)

* Khác: chƣa xác định đƣợc loài nấm

Trong nghiên cứu, có 10 học sinh bị tổn thương tại hai vị trí nhưng chỉ nhiễm một loại nấm duy nhất Đặc biệt, chỉ có 2 học sinh bị nhiễm phối hợp hai loại nấm tại hai vị trí khác nhau Hầu hết các trường hợp cho thấy tổn thương chỉ liên quan đến một loại nấm.

Bảng 3.22 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP theo vị trí tổn thương Loài

Nhận xét : M furfur gặp tất cả các vị trí tổn thương lang ben, riêng M japonica chỉ gặp ở mặt, cổ và lƣng

Bảng 3.23 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP theo giới tính Loài

Nhận xét : M furfur gặp cả ở nam và nữ, M japonica có 3 mẫu ở nữ và

Bảng 3.24 Thành phần loài nấm Malassezia spp định danh bằng PCR - RFLP theo địa dƣ

Nhận xét : M furfur gặp cả ở nội thành và ngoại thành, cả 4 mẫu M japonica đều gặp ở nội thành, không gặp mẫu nào ở ngoại thành

3.2.2 Kết quả giải trình tự gen định danh các loài nấm lang ben

Sử dụng kỹ thuật PCR - RFLP, chúng tôi đã xác định hai loài nấm gây lang ben ở học sinh THCS từ 11 đến 15 tuổi tại Hải Phòng, đó là M furfur và M japonica Trong nghiên cứu, chúng tôi đã chọn 07 mẫu nấm, bao gồm 03 mẫu nấm M furfur.

04 mẫu nấm M japonica để giải trình tự, so sánh với ngân hàng gen và đăng ký trên ngân hàng gen

Bảng 3.25 Kết quả giải trình tự gen

Mã lưu mẫu Mã trên Ngân hàng gen Giải trình tự PCR - RFLP

LV8C8 - 12 - Mặt MG890325.1 M japonica M japonica

LV9D2 - 37 - Lƣng MG890324.1 M japonica M japonica

LV9D3 - 43 - Lƣng MG890326.1 M japonica M japonica

VN8B3 - 15 - Lƣng MG890327.1 M japonica M japonica

Nhận xét: Kết quả giải trình tự gen hoàn toàn phù hợp với kết quả định danh loài bằng kỹ thuật PCR - RFLP

Hình 3.14 Cây phả hệ xác định mối quan hệ về loài giữa các chủng Malassezia spp

Nhận xét: Dựa trên đoạn gen 26S, cây phả hệ đƣợc xây dựng bằng chương trình MEGA6.06, sử dụng phương pháp kết nối liền kề NJ (Neighbor

- joining) với hệ số tin cậy bootstrap là 1000 lần lặp lại đã cho thấy:

- 4 mẫu nấm MG890324.1, MG890326.1, MG890327.1, MG890325.1 có tỷ lệ tương đồng 100% với trình tự tham chiếu của M japonica

JN874504.1 (Mỹ) và KP825379.1 (Brazil)

- 3 mẫu nấm MF595845.1, MF595846.1, MF595847.1 có tỷ lệ tương đồng 100% với trình tự tham chiếu của M furfur KY108371.1 (Hà Lan) và KC415099.1 (Ba Lan)

Hiệu quả của các biện pháp can thiệp

Bảng 3.26 Thông tin về học sinh tham gia điều trị

Thông tin Số HS nhiễm nấm

Số lƣợng HS điều trị

Số lƣợng Tỷ lệ (%) Địa điểm Quang Hƣng 44 35 75,9

- Có 138 học sinh tham gia điều trị nấm lang ben trong số 154 học sinh mắc bệnh chiếm tỷ lệ 89,6%, trong đó trường Vĩnh Niệm có 103/110 (93,6%), trường Quang Hưng có 35/44 (75,9%)

- 95,1% học sinh nam, 86,0% học sinh nữ tham gia điều trị

Bảng 3.27 Kết quả nuôi cấy nấm trước và sau điều trị theo địa dƣ (n = 138)

SL (%) SL (%) SL (%) SL (%) Quang

Sau khi điều trị, tỷ lệ nuôi cấy nấm dương tính giảm đáng kể, với 12,3% sau 1 tháng, 2,2% sau 3 tháng và 5,8% sau 6 tháng, cho thấy hiệu quả điều trị rõ rệt Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.

Sau một tháng, ba tháng và sáu tháng điều trị, tỷ lệ nuôi cấy nấm dương tính đã giảm đáng kể tại hai trường THCS Quang Hưng và THCS Vĩnh Niệm Cụ thể, tại trường Quang Hưng, tỷ lệ này giảm từ 100% xuống còn 11,4%, 2,9% và 2,9% Tương tự, trường Vĩnh Niệm cũng ghi nhận sự giảm từ 100% xuống 12,6%, 1,9% và 6,8% Tuy nhiên, sự khác biệt tỷ lệ giữa hai trường không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Bảng 3.28 Kết quả nuôi cấy nấm trước và sau điều trị theo giới tính (n = 138)

SL (%) SL (%) SL (%) SL (%) Nam (+) 58 100,0 6 10,3 2 3,4 5 8,6

Sau một tháng điều trị, tỷ lệ học sinh nam còn nấm ít hơn học sinh nữ Tuy nhiên, sau ba tháng và sáu tháng, tỷ lệ học sinh nam bị nấm lại cao hơn so với học sinh nữ, mặc dù sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Bảng 3.29 So sánh tổn thương thay đổi màu sắc trên da trước và sau điều trị theo địa dư (n = 138)

SL (%) SL (%) SL (%) SL (%) Quang

Sau một tháng điều trị, 71,7% học sinh vẫn còn dấu hiệu tổn thương trên da với sự thay đổi màu sắc Tỷ lệ này giảm nhanh chóng xuống còn 23,2% sau ba tháng và chỉ còn 9,4% sau sáu tháng điều trị Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.

- Tại 2 trường THCS, tỷ lệ còn dát tổn thương thay đổi màu sắc da cũng giảm dần Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2 trường với p > 0,05

Bảng 3.30 So sánh tổn thương thay đổi màu sắc trên da trước và sau điều trị theo giới tính (n = 138)

SL (%) SL (%) SL (%) SL (%) Nam Có 58 100,0 42 72,4 15 25,9 7 12,1

Sau 1, 3 và 6 tháng điều trị, tỷ lệ tổn thương da ở học sinh nam vẫn cao hơn so với học sinh nữ, mặc dù sự khác biệt này không đạt ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

Bảng 3.31 Kết quả điều trị sau 1 tháng theo địa dƣ (n = 138) Địa điểm Kết quả điều trị

Quang Hƣng Vĩnh Niệm Tổng

Nhận xét : Sau điều trị 1 tháng, có 39 học sinh khỏi hoàn toàn cả về lâm sàng và xét nghiệm chiếm tỷ lệ 28,3%, 82 học sinh khỏi về xét nghiệm nhƣng

Luận án tiến sĩ Y học cho thấy 59,4% bệnh nhân vẫn còn các triệu chứng lâm sàng, trong khi 12,3% học sinh không khỏi Kết quả điều trị giữa hai trường không có sự khác biệt đáng kể (p > 0,05).

Bảng 3.32 Kết quả điều trị sau 1 tháng theo giới tính (n = 138) Địa điểm

Nhận xét : Sau 1 tháng điều trị, không có sự khác biệt về kết quả điều trị giữa nam và nữ (p > 0,05)

Bảng 3.33 Kết quả điều trị sau 1 tháng theo thời gian mắc bệnh (n = 138) Địa điểm

Nhận xét : Không có học sinh nào không khỏi khi thời gian mắc bệnh dưới 3 tháng

Bảng 3.34 Tỷ lệ tái phát sau điều trị theo địa dƣ (n = 138)

- Có 3 học sinh tái phát sau điều trị 3 tháng chiếm tỷ lệ 2,2% và 5 học sinh tái phát sau 6 tháng điều trị chiếm tỷ lệ 3,6%

- Tỷ lệ tái phát sau điều trị 3 tháng và 6 tháng tại trường THCS Quang Hưng và trường THCS Vĩnh Niệm là như nhau với p > 0,05

Bảng 3.35 Tỷ lệ tái phát sau điều trị theo giới (n = 138)

Sau 3 và 6 tháng, tỷ lệ tái phát ở học sinh nam lần lượt là 3,4% và 6,9%, cao hơn so với học sinh nữ với tỷ lệ 1,3% ở cả hai thời điểm Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05.

3.3.2 Hiệu quả của các biện pháp truyền thông giáo dục sức khỏe

Nhóm nghiên cứu đã triển khai các biện pháp truyền thông giáo dục sức khỏe tại các địa điểm nghiên cứu, thu hút sự tham gia tích cực của toàn bộ học sinh, bao gồm cả những em không thuộc đối tượng nghiên cứu Mỗi tuần, chương trình phát thanh măng non được thực hiện trong 5 phút, kéo dài trong 6 tháng, nhằm cung cấp thông tin về bệnh lang ben Thông tin liên quan đến bệnh cũng được dán lên bảng tin và phòng y tế của trường trong suốt thời gian này Những học sinh đồng ý tham gia điều trị bằng thuốc bôi được hướng dẫn cụ thể về các biện pháp phòng chống bệnh lang ben.

Bảng 3.36 Thông tin về các nội dung truyền thông giáo dục sức khỏe áp dụng tại các địa điểm nghiên cứu

Nội dung Trường Số lớp Số đối tượng nghiên cứu Số học sinh dự

Truyền thông tại các lớp học Đoàn Xá 11 363 381

Phát tờ rơi Đoàn Xá 11 363 382

Tƣ vấn điều trị và phòng bệnh

Số lượng học sinh tham gia các buổi truyền thông tại lớp học và số học sinh nhận tờ rơi vượt xa số đối tượng nghiên cứu.

Bảng 3.37 Kiến thức của học sinh về bệnh lang ben trước và sau can thiệp

Biết biểu hiện 343 25,3 1266 95,8 < 0,01 478,7 Cần điều trị 422 31,1 1295 98,0 < 0,01 215,1 Điều trị khỏi 366 27,0 1195 90,4 < 0,01 234,8 Biết phòng bệnh 366 27,0 1256 95,0 < 0,01 251,9

Sau 6 tháng can thiệp truyền thông giáo dục sức khỏe, kiến thức của học sinh về bệnh lang ben đã tăng lên rõ rệt, với kết quả có ý nghĩa thống kê p < 0,01.

- Hiểu biết đúng về tác nhân gây lang ben trước can thiệp là 19,5%, sau can thiệp 6 tháng tăng lên 91,0% với hiệu quả can thiệp là 336,7%

Trước khi can thiệp, hầu hết học sinh có hiểu biết sai lệch về khả năng lây lan của bệnh lang ben Sau khi can thiệp, 55,0% học sinh đã nắm được kiến thức đúng về khả năng lây lan của bệnh này, cho thấy hiệu quả can thiệp đạt 787,1%.

Trước khi can thiệp, chỉ có một số ít học sinh nhận biết được biểu hiện của bệnh lang ben Tuy nhiên, sau khi can thiệp, tỷ lệ học sinh nhận biết đã tăng lên đáng kể, đạt 95,8%, cho thấy hiệu quả can thiệp lên đến 478,7%.

- Tỷ lệ học sinh biết rằng bệnh lang ben cần đƣợc điều trị tăng từ 31,1% lên 98,0% với hiệu quả can thiệp là 215,1%

- Sau can thiệp 90,4% học sinh biết rằng bệnh lang ben có thể điều trị khỏi với hiệu quả can thiệp là 234,8%

- Số học sinh kể tên đƣợc các biện pháp phòng bệnh tăng từ 27,0% lên 95,0% với hiệu quả can thiệp là 251,9%

Bảng 3.38 Thái độ của học sinh về bệnh lang ben trước và sau can thiệp

Nhận xét: Sau can thiệp, số học sinh có thái độ chƣa đúng giảm đáng kể từ 12,5% xuống 1,9% đạt hiệu quả 84,8%.

Bảng 3.39 Thực hành của học sinh về bệnh lang ben trước và sau can thiệp

Dùng xà phòng, sữa tắm 1194 88,0 1199 90,7 < 0,01 3,0 Không mặc chung 1292 95,2 1273 96,4 > 0,05 1,2 Giặt hàng ngày 941 69,3 907 68,6 > 0,05 1,0

Nhận xét: Thực hành phòng chống bệnh lang ben của học sinh sau can thiệp đều tăng:

- Tắm ngay sau khi đi học về tăng từ 51,1% lên 67,2% có ý nghĩa thống kê với hiệu quả can thiệp là 31,5%

- Học sinh dùng xà phòng, sữa tắm khi tắm tăng từ 88,0% lên 90,7% có ý nghĩa thống kê sau can thiệp với hiệu quả can thiệp là 3,0%

Sau can thiệp, tỷ lệ học sinh không mặc chung quần áo với người thân trong gia đình và bạn bè tăng lên, nhưng hiệu quả can thiệp chỉ đạt 1,2% và không có ý nghĩa thống kê.

Trước can thiệp, có 941 học sinh giặt quần áo hàng ngày, chiếm 69,3% tổng số, nhưng sau can thiệp, con số này giảm xuống còn 907 học sinh, tương đương 68,6% Sự thay đổi này không có ý nghĩa thống kê, với hiệu quả can thiệp đạt 1,0%.

BÀN LUẬN

Thực trạng và một số yếu tố liên quan đến bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15 tại Hải Phòng năm 2016

Trong nghiên cứu này, 1357 học sinh đã được khảo sát, trong đó 578 học sinh đến từ khu vực ngoại thành (chiếm 42,6%) và 779 học sinh từ khu vực nội thành (chiếm 57,4%) Số lượng học sinh được phân bố đồng đều giữa nam và nữ, với tỷ lệ lần lượt là 50,8% và 49,2%.

Trong một cuộc khám lâm sàng, 1357 học sinh đã được kiểm tra và phát hiện tổn thương trên da Kết quả cho thấy 332 học sinh có các dát thay đổi màu sắc trên da Tất cả những học sinh này đã được thực hiện xét nghiệm trực tiếp tìm nấm bằng xanh methylen, trong đó có 305 học sinh cho kết quả dương tính, chiếm tỷ lệ 91,9%.

4.1.1 Thực trạng bệnh lang ben ở học sinh lứa tuổi 11 - 15

4.1.1.1 Tỷ lệ bệnh lang ben

Lang ben là một bệnh da ít ảnh hưởng đến sức khỏe, dẫn đến việc có rất ít nghiên cứu về sự phân bố của bệnh trong cộng đồng Các nghiên cứu chủ yếu được thực hiện tại các bệnh viện da liễu, nơi bệnh nhân thường đến khám với tình trạng bệnh ở mức độ trung bình đến nặng và thời gian mắc bệnh kéo dài.

Nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên đƣợc tiến hành ở cộng đồng trên đối tƣợng là học sinh trung học cơ sở lứa tuổi 11 - 15

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ bệnh lang ben ở học sinh trung học cơ sở từ 11 đến 15 tuổi tại Hải Phòng đạt 22,5% Tỷ lệ này cao hơn nhiều so với các nghiên cứu trước đây của Viện Da liễu Trung Ơng, cho thấy mức độ nghiêm trọng của vấn đề.

Theo nghiên cứu của Triệu Tân Phong [18] từ 8/2008 đến 7/2009, tỷ lệ mắc bệnh lang ben là 1,1% Phạm Thị Lan [12] nghiên cứu trong 3 năm từ

2009 đến 2011, tỷ lệ bệnh lang ben là 1,04% Kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Văn Hoàn ở người trưởng thành ≥ 16 tuổi có tỷ lệ bệnh lang ben là 1,54%

Sở dĩ kết quả nghiên cứu của chúng tôi cao nhƣ vậy là vì một số lý do sau:

Viện Da liễu Trung Ƣơng là cơ sở hàng đầu trong ngành Da liễu Việt Nam, chuyên tiếp nhận và điều trị nhiều loại bệnh da phức tạp Bệnh lang ben, mặc dù không nghiêm trọng và chỉ gây mất thẩm mỹ, nhưng không ảnh hưởng lớn đến sức khỏe tổng thể của người bệnh.

Bệnh lang ben là một bệnh mạn tính dễ nhận biết qua các dát màu sắc trên da Do đó, nhiều bệnh nhân thường tự ý mua thuốc bôi chống nấm hoặc áp dụng các bài thuốc dân gian, dẫn đến số lượng người đến khám và điều trị tại cơ sở y tế rất ít.

Hiện nay, sự phát triển của nhiều phòng khám da liễu tư nhân đã tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh nhân trong việc khám và điều trị kịp thời Điều này dẫn đến việc số lượng bệnh nhân đến khám tại Viện Da liễu Trung Ương có xu hướng giảm.

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là học sinh từ 11 đến 15 tuổi, lứa tuổi dậy thì, khi tuyến bã hoạt động mạnh mẽ Sự gia tăng tiết acid béo trên bề mặt da tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men ưa mỡ phát triển, gây bệnh lang ben.

Lứa tuổi 11 - 15 thường thiếu kiến thức về vệ sinh cá nhân và các biện pháp phòng ngừa bệnh lang ben, dẫn đến tỷ lệ mắc bệnh cao.

Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện vào tháng 8 và tháng 9, thời điểm mà bệnh lang ben có tỷ lệ cao nhất trong năm do thời tiết nóng ẩm và nhiệt độ cao, tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển Sự ra mồ hôi nhiều trong những tháng này khiến bệnh nhân cảm thấy ngứa ngáy khó chịu, ảnh hưởng đến lao động và sinh hoạt, do đó, số lượng bệnh nhân đến khám gia tăng trong mùa hè là điều hoàn toàn hợp lý.

Nghiên cứu của các tác giả khác tại các địa điểm khác nhau trên cả nước cũng cho kết quả thấp hơn nghiên cứu của chúng tôi

Nghiên cứu của Nguyễn Duy Hƣng năm 2009 tại tỉnh Kiên Giang cho thấy tỷ lệ bệnh lang ben trong cộng đồng chỉ đạt 0,6%, điều này được xác định nhờ vào việc nghiên cứu trên mọi lứa tuổi.

Lê Trần Anh nghiên cứu tình hình bệnh da tại một số đơn vị bộ đội năm

Từ năm 1999 đến 2000, tỷ lệ bệnh lang ben ghi nhận là 1,6% Nghiên cứu của Nguyễn Quý Thái năm 2002 trên công nhân mỏ than Làng Cẩm - Thái Nguyên cho thấy tỷ lệ bệnh lang ben là 5,28% Một nghiên cứu khác năm 2004 tại 4 mỏ than ở Thái Nguyên chỉ ra tỷ lệ bệnh lang ben dao động từ 6,5% đến 7,4%, tùy thuộc vào mùa Mặc dù điều kiện sống thiếu thốn và môi trường làm việc ẩm ướt, tỷ lệ bệnh lang ben ở nhóm công nhân này vẫn thấp hơn so với lứa tuổi dậy thì, khẳng định rằng lứa tuổi dậy thì có tỷ lệ mắc bệnh lang ben cao hơn.

So với các nghiên cứu quốc tế, tỷ lệ bệnh lang ben trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn Cụ thể, nghiên cứu của Ingordo trên thủy thủ trẻ ở Ý năm 2003 ghi nhận tỷ lệ 2,1%, trong khi tại Brazil, từ năm 1996 đến 2011, tỷ lệ này là 5,8% theo nghiên cứu của Daiane Heidrich Đặc biệt, Elham Zeinali tại viện Pasteur, Iran, đã báo cáo tỷ lệ 9,5% trong giai đoạn 2012-2013 Những kết quả này phù hợp với các điều tra ở khu vực có khí hậu ôn đới, lý giải cho tỷ lệ bệnh lang ben thấp hơn so với nghiên cứu của chúng tôi.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu khác với đối tƣợng nghiên cứu cùng độ tuổi Nghiên cứu của Nguyễn Đinh Nga năm

Năm 2005, tại Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ bệnh lang ben ở học viên trung học từ 17 đến 19 tuổi đạt 20,87% Trong khi đó, tại Ấn Độ, tỷ lệ bệnh lang ben ở trẻ em dưới 15 tuổi là 31%, chủ yếu tập trung ở độ tuổi từ 8 đến 12.

Nghiên cứu của Deepak Kumar Jena và CS cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh lang ben ở lứa tuổi dậy thì và người lớn trẻ tuổi rất cao, với 31,7% tổng số ca, trong đó nhóm tuổi 12-14 chiếm 15,1% Điều này phản ánh sự hoạt động mạnh mẽ của tuyến bã nhờn trong giai đoạn này.

4.1.1.2 Tỷ lệ bệnh lang ben theo địa dư

Thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben

Trong một nghiên cứu, 305 học sinh có kết quả xét nghiệm dương tính với nấm qua phương pháp tìm nấm trực tiếp bằng xanh methylen đã được lấy vảy da để nuôi cấy trên môi trường CHROMagar TM Malassezia Trong số này, 16 học sinh có tổn thương lang ben tại hai vị trí khác nhau trên cơ thể, do đó đã cấy hai mẫu tương ứng với các vị trí tổn thương Tổng cộng, số mẫu nấm được nuôi cấy trên môi trường CHROMagar TM Malassezia là 321 mẫu.

Trong 321 mẫu bệnh phẩm từ vảy da của bệnh nhân lang ben có 309 mẫu có nấm mọc chiếm tỷ lệ 96,3%, chỉ có 12 mẫu không mọc chiếm tỷ lệ

Trong nghiên cứu, tỷ lệ mẫu nấm nuôi cấy dương tính đạt 3,7% Cụ thể, trong số 309 mẫu, 293 học sinh cho kết quả dương tính Đặc biệt, 16 học sinh có tổn thương lang ben tại hai vị trí khác nhau trên cơ thể, dẫn đến việc cấy hai mẫu tương ứng với hai vị trí tổn thương, cả hai đều phát triển trên môi trường nuôi cấy.

Kết quả nuôi cấy của chúng tôi cho thấy tỷ lệ thành công cao hơn so với một số nghiên cứu trước đây, như Trần Cẩm Vân (90,3%), Rezvan Talaee (89,3%), Elham Zeinali (81%) và Sidbartha Dutta (58,5%) Các nghiên cứu tại Iran cũng ghi nhận tỷ lệ nuôi cấy trên môi trường Leeming - Notman đạt 86,2% và 85,7% Đặc biệt, Silvana Ramandán đạt tỷ lệ 91% trên môi trường CHROMagar TM Malassezia Việc nuôi cấy nấm Malassezia spp gặp nhiều khó khăn do yêu cầu về môi trường và nhiệt độ thích hợp Chính vì vậy, nghiên cứu trước đây về thành phần loài nấm này bị hạn chế Chúng tôi đã lựa chọn môi trường CHROMagar TM Malassezia và nuôi cấy ở 32°C, từ đó đạt được tỷ lệ nuôi cấy thành công cao.

4.2.1 Thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben định danh bằng PCR - RFLP

4.2.1.1 Tỷ lệ thành phần loài nấm Malassezia spp gây lang ben

Nuôi cấy mầm bệnh trên môi trường thích hợp và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử là phương pháp quan trọng nhưng chưa phổ biến trong việc định danh các loài nấm, đặc biệt là nấm Malassezia spp Các nghiên cứu dựa vào hình thái học và đặc điểm sinh lý, sinh hóa mặc dù dễ thực hiện nhưng tốn nhiều thời gian, trong khi kỹ thuật sinh học phân tử được coi là nhanh chóng và chính xác hơn, tuy nhiên lại yêu cầu trang thiết bị hiện đại và kinh phí đầu tư.

Nghiên cứu của Oh BH tại Hàn Quốc cho thấy cả Nested - PCR và PCR - RFLP đều có khả năng xác định chính xác thành phần loài nấm Malassezia spp Tuy nhiên, Nested - PCR cho kết quả nhanh hơn nhưng độ chính xác thấp hơn so với PCR - RFLP.

Chúng tôi đã tiến hành xác định loài bằng phương pháp PCR trên 113 mẫu khuẩn lạc được nuôi cấy từ vảy da của 100 học sinh từ 11 đến 15 tuổi mắc bệnh lang ben, sử dụng môi trường CHROMagar TM Malassezia.

Nghiên cứu cho thấy có 88 học sinh nhiễm nấm lang ben tại một vị trí, với mỗi vị trí chỉ có một mẫu nấm và mỗi mẫu nấm phát triển một loại khuẩn lạc Ngoài ra, có 11 học sinh nhiễm nấm lang ben tại hai vị trí khác nhau, mỗi vị trí cũng chỉ có một mẫu nấm và một loại khuẩn lạc Đặc biệt, có một học sinh nhiễm nấm lang ben tại hai vị trí, trong đó vị trí đầu tiên có một mẫu nấm với một loại khuẩn lạc, còn vị trí thứ hai có một mẫu nấm với hai loại khuẩn lạc khác nhau.

Kết quả từ hình 3.6 và bảng 3.20 cho thấy 110 mẫu nấm lang ben có kích thước sản phẩm PCR với mồi ITS3, ITS4 đều lớn hơn 500 bp, trong đó có 4 mẫu có kích thước nhỏ hơn một chút Theo Rudramyrthy SM [104], có đến 5 loài Malassezia có kích thước tương tự, và việc phân biệt chúng sẽ khó khăn nếu không sử dụng enzyme giới hạn Do đó, việc cắt sản phẩm PCR bằng các enzyme giới hạn đã giúp phân biệt các loài nấm Malassezia (hình 3.7 đến 3.11).

Kết quả nghiên cứu cho thấy trong 110 mẫu được phân tích bằng phương pháp PCR với mồi ITS3, ITS4 và enzyme cắt giới hạn AluI, BanI, MsppAI, Malassezia spp chiếm tỷ lệ 97,3% Cụ thể, M furfur chiếm ưu thế với 96,4%, trong khi M japonica chỉ chiếm 3,6% Điều này phản ánh sự đồng nhất về thành phần loài trong nhóm tuổi 11 - 15, đồng thời phù hợp với các nghiên cứu trước đó cho rằng M furfur thường xuất hiện ở các quốc gia có khí hậu nhiệt đới, như đã đề cập trong nghiên cứu của Peter Mayser.

M furfur sản sinh ra chất pityriacitrin, giúp bảo vệ nấm khỏi tác hại của tia UV từ ánh sáng mặt trời Do đó, loài nấm này thường xuất hiện ở các quốc gia có khí hậu nhiệt đới.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả trong và ngoài nước

Cresppo-Erchiga [38] cho thấy rằng M furfur là loài nấm chiếm ưu thế ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới, trong khi M globosa lại là loài nấm phổ biến hơn ở những vùng có khí hậu ôn đới.

Các nghiên cứu tại Ấn Độ, một quốc gia có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đã chỉ ra rằng M furfur và M globosa là hai loài nấm lang ben phổ biến nhất, chiếm 37,5% trong mẫu nghiên cứu, theo Kalyani M M obtusa đứng thứ ba với tỷ lệ 25,0% Ngoài ra, nghiên cứu của Ajanta Sharma và cộng sự cho thấy M furfur chiếm ưu thế với 77,3%, trong khi M globosa chiếm 12,4% trong thành phần loài nấm lang ben tại khu vực này.

Theo nghiên cứu của Nguyễn Đinh Nga (2004 - 2006) tại thành phố Hồ Chí Minh, đã xác định được bốn loài nấm Malassezia spp gây lang ben, trong đó M furfur chiếm tỷ lệ cao nhất với 48,64%, tiếp theo là M sympodialis (35,13%), M globosa (5,4%) và M restricta.

Tại Indonesia, Roro Inge Ade Krisanty đã nghiên cứu sự phát triển của vảy da lang ben trong môi trường Leeming - Notman vào năm 2008 Kết quả cho thấy loài M furfur chiếm ưu thế với tỉ lệ 42,9%, tiếp theo là M sympodialis với 27,5% và M globosa với 13,3%.

Một số nghiên cứu khác lại cho rằng M globosa mới là loài chiếm ƣu thế trong tổn thương lang ben

Nghiên cứu của Zhen Xie năm 2014 tại Trung Quốc, một quốc gia có khí hậu ôn đới gió mùa, đã sử dụng kỹ thuật realtime - PCR để xác định 10 loài Malassezia spp khác nhau, trong đó M globosa là loài chiếm tỷ lệ cao nhất.

Hiệu quả của các biện pháp can thiệp

Bảng 3.26 cho thấy tổng cộng có 154 học sinh mắc bệnh lang ben, trong đó 44 học sinh từ trường Quang Hưng và 110 học sinh từ trường Vĩnh Niệm Trong số đó, 138 học sinh đã đồng ý tham gia điều trị bằng thuốc bôi ketoconazole, chiếm 89,6% Cụ thể, tỷ lệ học sinh tham gia điều trị tại trường Quang Hưng là 75,9% (35 học sinh) và tại trường Vĩnh Niệm là 93,6% (103 học sinh).

4.3.1.1 Thay đổi về xét nghiệm

Dưới tác dụng của ketoconazole, tế bào nấm bị phân hủy và thoái hóa Tuy nhiên, một số trường hợp hiếm gặp cho thấy tế bào nấm vẫn tồn tại, có thể là do cơ chế tự bảo vệ hoặc do học sinh không bôi thuốc đủ thời gian.

Luận án tiến sĩ Y học chỉ ra rằng, khi không có ketoconazole, tế bào nấm vẫn có khả năng tăng sinh và phát triển trên cơ thể cảm thụ trong những điều kiện thuận lợi.

Kết quả từ bảng 3.27 và 3.28 cho thấy trong số 138 học sinh được điều trị bằng thuốc bôi ketoconazole, sau 1 tháng có 121 học sinh (87,7%) không phát hiện nấm lang ben khi nuôi cấy vảy da trên môi trường CHROMagar TM Malassezia, trong khi tỷ lệ còn nấm là 12,3% So sánh hiệu quả điều trị giữa trường Vĩnh Niệm và trường Quang Hưng cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

So với các nghiên cứu quốc tế về điều trị bằng thuốc bôi ketoconazole 2%, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn, với tỷ lệ khỏi bệnh sau điều trị đạt kết quả khả quan.

5 tuần điều trị là 47,0% là kết quả nghiên cứu của Di Fonzo tại Italya [40], sau

4 tuần điều trị của Shi và CS là 72% [111], sau điều trị 4 tuần 69,0% của Rad và CS [94]

Trong nghiên cứu của Trần Cẩm Vân, tỷ lệ còn nấm sau khi điều trị bằng phác đồ ketoconazole tắm gội thay xà phòng trong 2 tuần là 27,7%, cao hơn so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi.

Hiệu quả điều trị của chúng tôi vượt trội hơn so với các nghiên cứu trong nước sử dụng thuốc nhóm azole để điều trị lang ben Cụ thể, nghiên cứu của Hoàng Văn Minh năm 2003 tại trung tâm cai nghiện Nhị Xuân cho thấy tỷ lệ còn nấm sau khi điều trị bằng itraconazole 400mg liều duy nhất là 22,2% Nghiên cứu của Bùi Văn Đức năm 2007 tại cùng trung tâm cho thấy nhóm điều trị bằng itraconazole có tỷ lệ còn nấm là 18,2%, trong khi nhóm dùng fluconazole có tỷ lệ 17,6% Nghiên cứu của Triệu Tân Phong từ 8/2008 đến 7/2009 tại Viện Da liễu Trung Ơơng cho thấy tỷ lệ còn nấm sau 1 tháng điều trị là 25%, với nhóm dùng fluconazole 400 mg liều duy nhất là 15,6% và nhóm dùng fluconazole 150 mg mỗi tuần trong 4 tuần là 34,4%.

So sánh với các tác giả khác [9], [10], nghiên cứu này đánh giá hiệu quả điều trị bằng thuốc uống nhóm azole tại Bệnh viện Da liễu Trung Ơng Kết quả cho thấy sự khác biệt trong hiệu quả điều trị, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp cho bệnh nhân.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ sạch nấm sau một tháng điều trị theo các phác đồ khác nhau trong luận án tiến sĩ Y học cho thấy sự khác biệt rõ rệt và có ý nghĩa thống kê.

Sỡ dĩ chúng tôi có kết quả nhƣ vậy có lẽ là do:

Thứ nhất: đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi là học sinh 11 - 15 tuổi nên thời gian mắc bệnh ngắn, diện tích tổn thương nhỏ

Vào thứ hai, chúng tôi đã hướng dẫn học sinh cách sử dụng thuốc để bôi rộng ra xung quanh vùng tổn thương nhằm tiêu diệt các tế bào nấm không nhìn thấy.

Trong suốt 6 tháng theo dõi quá trình điều trị, chúng tôi đã thực hiện các biện pháp truyền thông giáo dục sức khỏe nhằm nâng cao kiến thức và phòng chống bệnh cho học sinh Các hoạt động bao gồm truyền thông trực tiếp tại lớp học, phát và dán tờ rơi tại bảng tin và phòng y tế của trường.

Vào thứ Ba, các tác giả đã lựa chọn nghiên cứu đối tượng nhiễm nấm chủ yếu ở mức độ vừa và nặng, với tổn thương lan rộng khiến việc điều trị trở nên khó khăn hơn Điều này càng phức tạp do điều kiện sống khó khăn của các học viên cai nghiện ma túy.

Việc tuân thủ điều trị có thể gặp khó khăn, như nghiên cứu của Trần Cẩm Vân chỉ ra rằng việc lưu dầu trên da từ 5 đến 10 phút và xoa tắm toàn thân không được thực hiện có thể làm giảm hiệu quả điều trị tại chỗ.

Sau 3 tháng và 6 tháng điều trị, tỷ lệ sạch nấm là 97,8% và 94,2%, số học sinh còn nấm chiếm tỷ lệ thấp 2,2% và 5,8% giảm nhiều so với sau 1 tháng Kết quả cứu của Bùi Văn Đức [7] năm 2007 tại trung tâm cai nghiện Nhị Xuân, ở 2 nhóm điều trị, tỷ lệ còn nấm sau 3 tháng điều trị là 24,2% và 23,5%; sau 6 tháng điều trị là 27,3% và 26,5% Kết quả này cao hơn nghiên cứu của chúng tôi vì những bệnh nhân còn nhiễm nấm sau 1 tháng không tiếp tục điều trị

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ sử dụng thuốc kháng nấm dạng bôi do không thể thực hiện các xét nghiệm đánh giá chức năng gan thận của học sinh Do đó, việc điều trị bằng thuốc kháng nấm đường uống không khả thi.

Tiêu đề	Thực Trạng, Một Số Yếu Tố Liên Quan, Thành Phần Loài Nấm Malassezia Spp Gây Bệnh Lang Ben Ở Học Sinh 11 - 15 Tuổi Và Hiệu Quả Can Thiệp Tại Hải Phòng
Tác giả	Võ Thị Thanh Hiền
Người hướng dẫn	PGS.TS. Nguyễn Duy Bắc, PGS.TS. Nguyễn Thị Liên Hương
Trường học	Viện Sốt Rét - Ký Sinh Trùng - Côn Trùng Trung Ương
Chuyên ngành	Ký Sinh Trùng Y Học
Thể loại	luận án tiến sỹ y học
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	190
Dung lượng	6,86 MB