Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao dược liệu từ hoa đủ đủ đực

3.3 Kết quả thí nghiệm khối lượng cao chiết thu được 39 3.4 Ma trận quy hoạch thực nghiệm với biến đã được mã hoá 40 3.7 Kết quả khảo sát cặn không tan trong nước của cao đặc hoa đu đủ đ

ĐỐI TƯỢNG VÀ MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Hoa đu đủ đực thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng

Mục tiêu nghiên cứu

- Tìm được các yếu tố phù hợp để chiết xuất cao dược liệu từ hoa đu đủ đực bằng phương pháp chưng ninh

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của cao dược liệu.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của các bộ phận của cây đu đủ

- Tham khảo các tài liệu về các phương pháp Sohxlit, các phương pháp chưng ninh, chưng trực tiếp, chưng hồi lưu phương pháp quy hoạch thực nghiệm

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Thu thập và xử lý nguyên liệu

- Phương pháp hóa lý xác định các thông số độ ẩm, hàm lượng tro, pH

- Phương pháp xử lý số liệu, phân tích hồi qui, quy hoạch thực nghiệm: quy hoạch trực giao cấp 1

- Thuật toán giải bài toán tối ưu bằng ứng dụng Matlab

- Phương pháp phân tích công cụ: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

- Phương pháp định tính các hợp chất hóa học

- Phương pháp thăm dò Hoạt tính sinh học.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình chiết xuất hoa đu đủ đực

Chọn dung môi chiết thích hợp là nước cất, chọn phương pháp chiết: chưng ninh và khảo sát các yếu tố:

- Ảnh hưởng của tỉ lệ Rắn/ Lỏng

- Ảnh hưởng của thời gian chiết

Tối ưu hóa quá trình chiết bằng dung môi nước cất

- Quy hoạch trực giao cấp 1 với 2 yếu tố: thời gian, tỉ lệ Rắn/Lỏng để tìm ra phương trình hồi quy tương thích (khối lượng cao thu được lớn nhất).

Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở

phần, hàm lượng kim loại nặng, độ pH, định tính, hoạt tính sinh học.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo tốt, có tính thời sự cao cho việc giảng dạy cho các sinh viên ngành Hóa, Y dược Góp phần bồi dưỡng năng lực nghiên cứu khoa học, kỹ năng nghiên cứu cho các giảng viên trẻ trong Khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng

- Mô hình thống kê được xây dựng trong đề tài có thể tham khảo để mở rộng quy mô chiết xuất cao dược liệu, vận dụng vào thực tế theo định hướng ứng dụng cao chiết từ hoa đu đủ đực trong dược phẩm và thực phẩm chức năng.

CẤU TRÚC LUẬN VĂN

Khóa luận gồm 55 trang trong đó có bảng và hình Phần mở đầu (3 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (4 trang) Nội dung đề tài chia làm 3 chương:

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (13 trang)

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM (16 trang) Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN (17 trang )

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT

Hoa đu đủ đực tươi được thu hái tại Quảng Nam- Đà Nẵng

Cách lấy mẫu: Lấy hoa đu đủ tươi, không bị sâu mọt, không bị dập, rửa sạch để ráo nước ở nhiệt độ phòng Phơi trong bóng râm rồi đem đi sấy ở 50-60 o C Để nguội rồi nghiền nhỏ thành bột Sau đó chia nguyên liệu thành nhiều phần, bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh để sử dụng cho các nội dung thực nghiệm (Hình 2.1)

Hình 2.1 Nguyên liệu hoa đu đủ đực phơi khô (a) và bột hoa đã xử lý (b)

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất a Dụng cụ

- Bình cầu 500mL; 1000mL; cốc thủy tinh 50mL, 100mL, 250mL; bình tam giác có nút nhám 100mL; bình định mức 50mL, 100mL; pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL, 20mL

- Cân phân tích, tủ sấy, bình hút ẩm, lò nung, máy hấp khử trùng máy điều nhiệt, máy khuấy từ, bếp điện; giá sắt; nhiệt kế; chén sứ; giấy lọc, ống sinh hàn b Thiết bị

- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Shimadzu AA 7000 tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2 ( Quatest 2) như Hình 2.2:

Hình 2.2 Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Shimadzu AA 7000

- Máy đo pH Hana Romania tại trường Đại học Sư phạm- Đại hoc Đà Nẵng. c Hóa chất

- Nước cất 2 lần , bột hoa đu đủ đực, cao hoa đu đủ đực

- Chloroform (CHCl3), dung dịch amoniac (NH4OH), ethanol (C2H5OH) 95 o , các loại thuốc thử Mayer (K2[HgI4]), Wagner (KI3), Dragendroff (K[BiI4]), Fehling

A (dd CuSO4), Fehling B (dd NaOH+KNaC4H4O6.4H2O), thuốc thử Lugol ( KI+ I2), thuốc thử Trim- Hill ( CH3COOH+ CuSO4+ HCl)

- Acid nitric (HNO3) 10% , acid clohiđric (HCl) 1%, acid sunfuric (H2SO4) đậm đặc

- Dung dịch natrihidroxit (NaOH) 10%, 1%, dung dịch sắt (III) clorua (FeCl3)

1%, tinh thể natricacbonat (Na2CO3,), n-hexane (CH3(CH2)4CH3)

- Và các hoá chất khác

Các hóa chất đều có mức độ tinh khiết để phân tích (PA)

2.2 SƠ ĐỒ THỰC NGHIỆM TỔNG THỂ

Hình 2.3 Quy trình thực nghiệm chiết xuất cao dược liệu từ hoa đu đủ đực

Hoa đu đủ đực tươi

Rửa sạch, Phơi khô, Nghiền mịn

+H 2 O Bột hoa khô và nước

Khuấy đều và đun sôi

Hỗn hợp sau khi đun

Xây dựng Tiêu chuẩn cơ sở

Cô cạn Độ ẩm,tro hoá, pH… Định tính Kim loại nặng

Khảo sát các yếu tố: thời gian, tỉ lệ Rắn/lỏng

Cao chiết điều kiện tối ưu

2.3.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận dịch chiết cao từ hoa đu đủ đực

Căn cứ các kết quả công bố tại các tài liệu tham khảo, trong điều kiện cho phép của các dụng cụ, thiết bị thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành các thực nghiệm nghiên cứu thăm dò, sàng lọc trước Chúng tôi đã nghiên cứu nhiệt độ chiết bắt đầu từ 30 o C-

100 o C và nhận thấy khi ở dưới nhiệt độ sôi của nước cất (xấp xỉ 100 o C) thì thời gian chiết rất lâu từ 4-5 ngày Mặt khác, khi theo dõi quá trình chưng ninh ở nhiệt độ bằng nhiệt độ sôi của nước cất thì màu sắc của dịch chiết hầu như không thay đổi Vì vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ chiết bằng nhiệt độ sôi của nước cất là 100 o C Tham khảo các nghiên cứu trước đây và để thuận tiện với các điều kiện về dụng cụ, thiết bị trong phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn khối lượng mẫu bột nguyên liệu cho các thí nghiệm là 5 gam Với khối lượng nguyên liệu này, tỷ lệ Rắn/Lỏng sẽ phụ thuộc vào thể tích dung môi nước cất dùng để chiết, thể tích này được thay đổi từ 50mL đến

500 mL; thời gian chưng ninh được khảo sát trong khoảng từ 1,5 giờ đến 4 giờ Cũng xuất phát từ các thí nghiệm thăm dò, thời gian trung bình được sử dụng cho những thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi đến khối lượng cao chiết được sử dụng là 3 giờ

Quy trình chuẩn bị dịch chiết hoa đu đủ đực gốc như sau: Hoa đu đủ đực tươi được rửa sạch, phơi khô, nghiền nhỏ cho vào bình cầu chứa sẵn V mL nước cất Khuấy đều rồi chưng ninh trong bếp cách thuỷ 100 o C, để nguội Hỗn hợp dịch chiết thu được đem lọc bỏ cặn tạp chất thu được dịch chiết tổng từ hoa đu đủ đực có màu nâu đậm Dịch chiết mang đi cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi, thu được khối lượng cao chiết khô Đây là hàm mục tiêu để tiến hành các thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận cao chiết từ hoa đu đủ đực a Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ khối lượng bột hoa đu đủ đực với thể tích nước cất (tỉ lệ Rắn/Lỏng)

Quá trình khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng bột hoa đu đủ đực với thể tích nước cất được thực hiện như sau:

Chuẩn bị dịch chiết hoa đu đủ đực ứng với thời gian khảo sát tối ưu Thay đổi thể tích nước cất lần lượt là 50mL, 100 mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL; cho thêm lần lượt 5 gam bột hoa đu đủ đực, các mẫu được đun trong bếp cách thủy ở

100 o C trong thời gian lựa chọn từ các thí nghiệm thăm dò là 3 giờ b Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến dịch chiết cao từ hoa đu đủ đực

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết được thực hiện như sau:

Chuẩn bị dịch chiết hoa đu đủ đực gốc như trên, thay đổi thời gian chưng ninh trên bếp cách thủy thay đổi lần lượt là 1,5 giờ cho đến 4 giờ Thể tích dung môi dùng để chiết được lựa chọn từ thực nghiệm tại mục a

2.3.2 Phương pháp hoạch định thực nghiệm

Từ kết quả nghiên cứu tại mục 2.3.1, chúng tôi lựa chọn các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận cao chiết từ hoa đu đủ đực và tiến hành quy hoạch thực nghiệm bằng phương pháp Quy hoạch trực giao cấp I [7],[18]

Chúng tôi đã lực chọn các yếu tố ảnh hưởng được kí hiệu là Zj - là các biến thật, có thứ nguyên Trong đó: Z1 là thể tích dung môi, Z2 là thời gian chiết

Mỗi yếu tố được tiến hành ở 3 mức: Mức trên; mức dưới; mức cơ bản để thí nghiệm ở tâm phương án Xây dựng hàm mục tiêu cần đạt được là khối lượng cao khô từ hoa đu đủ đực thu được nhiều nhất

Trong đó: Zj 0 là mức cơ bản (tâm phương án)

Zj max là mức trên (mức cao)

Zj min là mức dưới (mức thấp)

Vectơ vào tại mức cơ bản Zj 0 (j = 1,2) chỉ ra không gian các yếu tố của một điểm đặc biệt gọi là tâm thực nghiệm

Lập ma trận quy hoạch:

Với 2 yếu tố là thể tích dung môi và thời gian chiết (k = 2) Vậy số thí nghiệm được tiến hành là N = 2 2 = 4 thí nghiệm Để tiện cho việc tính toán, ta chuyển từ hệ trục tự nhiên Z1, Z2 có thứ nguyên sang hệ trục không thứ nguyên mã hoá Việc mã hoá được thực hiện dễ dàng nhờ chọn tâm của miền được nghiên cứu làm gốc toạ độ

Trong hệ mã hoá không thứ nguyên ta có được:

Mức cơ sở : kí hiệu 0

Biến không thứ nguyên kí hiệu là xj được xác định từ công thức đổi biến như sau: j=1;2

Trong đó là khoảng biến thiên theo trục Zj được tính theo công thức

Chọn phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình nghiên cứu có dạng: y = bo + b1x1 + b2x2 + b12x12

Tính hệ số hồi quy: Các hệ số hồi quy được xác định bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất như sau: j Sau khi tính được b0, b1, b2, b12 ta thay vào phương trình hồi quy có dạng được nêu ở trên để tiến hành kiểm định tính có ý nghĩa của các hệ số hồi quy và tính tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm

Kiểm tra tính có ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy bằng chuẩn số Student (t)

Chuẩn số Student thực nghiệm( ttn ) được tính theo công thức:

Trong đó bj là hệ số ứng với yếu tố thứ j trong phương trình hồi quy; j = 0,1,2,…

Sbj độ lệch quân phương của hệ số bj

Tra bảng giá trị chuẩn số Student tb (P,f) ứng với mức ý nghĩa P chọn trước và f; f là bậc tự do ứng với phương sai tái hiện của từng phương án mà người nghiên cứu đã chọn

So sánh tj và tb

+ Nếu tj > tb hệ số bj có ý nghĩa và được giữ lại trong phương trình hồi quy + Nếu tj < tb hệ số bj không có ý nghĩa và loại khỏi phương trình hồi quy

Kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm bằng chuẩn số Fisher (F)

- Xây dựng phương trình hồi quy với các hệ số có nghĩa ở trên

- Chuẩn số Fisher thực nghiệm (Ftn ) được tính theo công thức:

Trong đó: Stt 2 là phương sai tương thích và được tính theo công thức

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO DƯỢC LIỆU TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

3.1.1 Ảnh hưởng của tỉ lệ Rắn/lỏng đến quá trình chiết xuất cao dược liệu từ hoa đu đủ đực

Căn cứ các tài liệu tham khảo, sàng lọc trước đây, căn cứ các nghiên cứu thăm dò được nêu ở chương 2, chúng tôi lựa chọn thời gian trung bình được sử dụng cho những thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thể tích dung môi đến khối lượng cao chiết được sử dụng là 3 giờ

Cho 5g bột hoa đu đủ đực vào bình cầu có chứa dung môi là nước cất với các thể tích lần lượt thay đổi: 50mL,100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL Chưng ninh các mẫu nguyên liệu bằng dung môi nước cất trong thời gian 3 giờ thu được các dịch chiết tương ứng, được thể hiện ở Hình 3.1

Hình 3.1: Dịch chiết thu được

Hỗn hợp dịch chiết thu được đem lọc bỏ cặn tạp chất thu được dịch chiết tổng từ hoa đu đủ đực có màu nâu đậm Dịch chiết mang đi cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi, thu được khối lượng cao chiết khô Ảnh hưởng của tỉ lệ Rắn/lỏng lên khối lượng cao chiết khô được trình bày trên Bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát tỉ lệ rắn lỏng

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn kết quả lượng cao thu được khi thay đổi thể tích dung môi chiết

Thể tích dung môi (mL)Khối lượng cao thu được khi thay đổi thể tích dung môi chiết

Nhận xét: Với 5 gam bột hoa nguyên liệu ban đầu, chiết bằng phương pháp chưng ninh ở 3 giờ khi tăng thể tích dung môi nước cất thì khối lượng cao tăng dần, thí nghiệm thăm dò của nhóm nghiên cứu cho thấy quan hệ giữa các đại lượng “Khối lượng cao” và “Thể tích dung môi” trong miền khảo sát từ 50mL đến 500 mL có hình dạng quan hệ tuyến tính như mô tả trên Hình 3.2

Dùng phương pháp phân tích hồi quy tuyến tính và xử lý số liệu bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất, với sự hỗ trợ của phần mềm máy tính excel, chúng tôi đề xuất phương trình hồi quy có dạng: y = 0,0002x + 1,4962 với R 2 =0,9088 và đồ thị biểu diễn tương quan “Khối lượng cao” và “Thể tích dung môi” được trình bày trên Hình 3.3

Hình 3.3: Đồ thị đường thẳng biểu diễn tương quan khối lượng cao chiết và thể tích dung môi chiết Để làm cơ sở cho nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn các thông số thực nghiệm sau: khối lượng nguyên liệu là 5 gam bột, thể tích dung môi là 200 mL nước cất

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết xuất cao dược liệu từ hoa đu đủ đực y = 0,0002x + 1,4962 R² = 0,9088 y = 0,0002x + 1,4962

Cho 5g bột hoa đu đủ đực vào bình cầu có các thể tích 200mL Đun sôi với dung môi nước cất trong thời gian lần lượt 1,5 giờ; 2 giờ; 2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ, thu được các dịch chiết tương ứng, được thể hiện ở Hình 3.4

Hình 3.4: Dịch chiết thu được

Hỗn hợp dịch chiết thu được đem lọc bỏ cặn tạp chất thu được dịch chiết tổng từ hoa đu đủ đực có màu nâu đậm Dịch chiết mang đi cô đuổi dung môi đến khối lượng không đổi, thu được khối lượng cao chiết khô Ảnh hưởng của thời gian chiết lên khối lượng cao chiết khô được thể hiện trong Bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian

Nhận xét: Với 5 gam bột hoa nguyên liệu ban đầu, chiết bằng phương pháp chưng ninh thể tích dung môi nước cất là 200 mL thì khi tăng thời gian chưng ninh, khối lượng cao tăng dần, thí nghiệm thăm dò của nhóm nghiên cứu cho thấy quan hệ giữa các đại lượng “Khối lượng cao” và “Thời gian” trong miền khảo sát từ 1,5 giờ đến 4 giờ có hình dạng quan hệ tuyến tính như mô tả trên Hình 3.5

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn khối lượng cao thu được khi thay đổi thời gian chiết

Dùng phương pháp phân tích hồi quy tuyến tính và xử lý số liệu bằng phương pháp bình phương nhỏ nhất, với sự hỗ trợ của phần mềm máy tính excel, chúng tôi đề xuất phương trình hồi quy có dạng: y = 0,076x + 1,306 với R 2 =0,9041 và đồ thị biểu diễn tương quan “Khối lượng cao” và “Thời gian” được trình bày trên Hình 3.6

Thời gian (giờ)Khối lượng cao thu được khi thay đổi thời gian chiết

Hình 3.6: Đồ thị đường thẳng biểu diễn tương quan khối lượng cao chiết và thời gian chiết

- Từ các kết quả khảo sát tại mục 3.1 chúng tôi chọn hai yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận cao chiết từ hoa đu đủ đực là thể tích dung môi và thời gian chiết để tiến hành phương pháp quy hoạch thực nghiệm, tìm các điều kiện tối ưu áp dụng cho nghiên cứu với lượng nguyên liệu 5 gam bột hoa đu đủ trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Các mức yếu tố được chọn lọc từ các thí nghiệm khảo sát trên: Thể tích dung môi từ 100 mL đến 500 mL; thời gian chiết từ 2 giờ đến 4 giờ.

KẾT QUẢ QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU TRONG CHIẾT XUẤT CAO DƯỢC LIỆU TỪ HOA ĐU ĐỦ ĐỰC

3.2.1 Kết quả quy hoạch thực nghiệm Để tiến tới miền tối ưu, chúng tôi chọn phương án thực nghiệm Quy hoạch trực giao cấp 1 yếu tố toàn phần Hai yếu tố ảnh hưởng đến quá trình là tỉ lệ Rắn/lỏng (Z1) và thời gian chiết (Z2) Hàm mục tiêu cần đạt được là khối lượng cao thu được là nhiều nhất [17] y = 0,076x + 1,306 R² = 0,9041 y = 0,076x + 1,306

0 1 2 3 4 5 m cao Để quy hoạch thực nghiệm toàn phần, chúng tôi đã tiến hành bố trí thí nghiệm thay đổi đồng thời các yếu tố, mỗi yếu tố được tiến hành ở 2 mức: mức trên, và mức dưới; các thí nghiệm ở tâm phương án được thực hiện ở mức cơ sở a Lập ma trận quy hoạch:

Xét ảnh hưởng của các yếu tố:

- Tỉ lệ rắn/ lỏng: Z1 = 200 ÷ 500 mL/5 gam bột mịn hoa đu đủ đực

Với 2 yếu tố tỉ lệ Rắn/lỏng và thời gian chiết (k = 2), mỗi yếu tố có hai mức là mức trên và mức dưới Vậy số thí nghiệm được tiến hành là N=2 2 = 4 thí nghiệm b Mã hóa, lập ma trận thực nghiệm Đặt

Phương án tiến hành trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.3: Kết quả thí nghiệm khối lượng cao chiết thu được

Thí nghiệm Z1 Z2 Khối lượng cao (g)

Bảng 3.4: Ma trận quy hoạch thực nghiệm với biến đã được mã hoá

8 0 0 0 0 1,56 c Xây dựng mô hình thực nghiệm

Giả sử mô hình tuyến tính bậc 1 có dạng đầy đủ: y = b o + b 1 x 1 + b 2 x 2 + b 12 x 12

* Tính bj : Áp dụng công thức: b j = N 1 ∑ N i = 1 x ji y i ; j = 0,1;;;;

Với N = 2 2 = 4, ta có kết quả tính toán các hệ số bj được trình bày ở Bảng 3.5

Bảng 3.5: Giá trị các hệ số b j thu được bo b1 b2 b12

Khi đó, phương trình y = 1,5175 + 0,0325x 1 + 0,0375x 2 + 0,0025x 12 d Kiểm định mô hình thực nghiệm

Kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số b j Ở thí nghiệm này, ta thực hiện 4 thí nghiệm tại tâm thu được: y 01 = 1,57; y 02 = 1,57; y 03 = 1,56; y 04 = 1,56

Suy ra ị S bj 2 = S N th 2 = 0,0000333 4 = 0,0000083 ị S bj = 0,0029 Áp dụng công thức tính chuẩn số Student ta có: t bj = s b j bj ị tbo = 525,68; tb1 = 11,25; tb2 = 12,99; tb12 = 0,87 Chọn mức ý nghĩa α = 0,05, tra bảng giá trị chuẩn số Student với bậc tự do m = no – 1 = 4 – 1 = 3 ị tα = 3,18

Từ các giá trị t bj thu được ta thấy có 3 giá trị thỏa mãn là t bo , t b1 và t b2 ị Phương trỡnh trở thành y = 1,5175 + 0,0325x 1 + 0,0375x 2

Kiểm tra sự phù hợp của mô hình

Phương sai dư được tính theo công thức: S dư 2 = ∑ 7y i ,y 8 i 9

Trong đó L là hệ số có nghĩa trong phương trình hồi quy, L = 3 Kết quả thể hiện ở Bảng 3.6:

Bảng 3.6: Giá trị 𝑦A được tính từ phương trình hồi quy

4 1,59 1,5875 0,00000625 yA i là giá trị thu được bằng cách thay x1, x2 vào phương trình hồi quy vừa tìm được

Như vậy chuẩn số Fisher tính được: F = S S dư 2 ts 2 = 0,000033 0,000025 = 0,75 Chọn α = 0,05 với bậc tử = N – L = 4 – 3 = 1, bậc mẫu = no – 1 = 4 – 1 = 3 Tra bảng số giá trị chuẩn số Fisher với mức ý nghĩa α = 0,05 ta được giá trị chuẩn số Fα = 10,12 > Ftn = 0,75 nên mô hình đưa ra là phù hợp e Đổi về biến thật: X j = z j ∆z - z j o j ị y = 1,5175 + 0,0325B z 1 - 300 200 C + 0,0375B z 2 1 - 3 C ị y = 1,35625 + 1,625.10 -4 z1 + 0,0375.z2

Với phương trình hồi quy vừa tìm được: f = y = 1,35625 + 1,625.10 -4 z1 + 0,0375.z2

Việc tiếp theo là tối ưu hóa nhằm tìm được giá trị fmax, tương ứng với điểm mà hiệu suất thu cao dược liệu hoa đu đủ đực là lớn nhất Chúng ta sẽ sử dụng ngôn ngữ lập trình MATLAB với thuật toán được nêu ở chương 2.3

*Tiến hành mô phỏng trên MATLAB R 2017b bằng thuật toán đã viết, ta thu được kết quả như Hình 3.7:

Hình 3.7 Mô phỏng thuật toán bằng MATLAB và thu nhận kết quả

Như vậy : Khối lượng cao hoa đu đủ đực thu được là 1,5875 gam, tại đó các giá trị thông số x = z1 = tỉ lệ rắn lỏng = 500, y = z2 = thời gian tối ưu = 4 Kết quả thu được bằng phần mềm MATLAB R2017b cho giá trị gần đúng với giá trị thực nghiệm

KẾT QUẢ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO CAO DƯỢC LIỆU 43 1 Chiết xuất cao dược liệu

Từ những nghiên cứu và dựa theo Dược điển Việt Nam V (DĐVN V), chúng tôi đề xuất tiêu chuẩn cao dược liệu hoa đu đủ đực bằng dung môi nước với định hướng làm nguyên liệu thuốc gây độc tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực như sau:

3.3.1 Chiết xuất cao dược liệu

Cao đặc hoa đu đủ đực được bào chế từ hoa đu đủ đực (Carica papaya L.) theo phương pháp thích hợp với dung môi chiết xuất là nước, thu được 120 g chế phẩm cao đặc từ hoa đu đủ đực

Mô tả: Cao hoa đu đủ đực là cao đặc quánh, mềm, đồng nhất Màu nâu đen

Mùi nồng, đặc trưng của dược liệu Vị lợ, hơi đắng

3.3.2 Hàm lượng cặn không tan trong nước

Kết quả khảo sát cặn không tan trong nước của cao đặc hoa đu đủ đực thể hiện ở Bảng 3.7

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát cặn không tan trong nước của cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

Nhận xét: Cặn không tan trong nước trung bình của cao đặc hoa đu đủ đực là

0,163%, đạt yêu cầu theo quy định của DĐVN V là không quá 3%

3.3.3 Tỷ lệ mất khối lượng do làm khô

Kết quả khảo sát mất khối lượng do làm khô của cao đặc hoa đu đủ đực thể hiện ở Bảng 3.8

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát mất khối lượng do làm khô của cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

STT mmẫu (g) mmẫu sau làm khô (g) W (%)

Nhận xét: Tỷ lệ mất khối lượng do làm khô trung bình của cao đặc hoa đu đủ đực là 13,867%, đạt yêu cầu theo quy định của DĐVN V là không quá 20%

3.3.4 Hàm lượng tro toàn phần

Kết quả khảo sát hàm lượng tro toàn phần của cao đặc hoa đu đủ đực thể hiện ở Bảng 3.9

Bảng 3.9.: Kết quả khảo sát tro toàn phần của cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

STT mcốc (g) mmẫu (g) mcốc và mẫu sau tro hóa (g) T (%)

Nhận xét: Tro toàn phần trung bình của cao đặc hoa đu đủ đực là 22,867%, đạt yêu cầu theo quy định của DĐVN V là không quá 35%

3.3.5 Hàm lượng kim loại nặng

Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại nặng của cao đặc hoa đu đủ đực được đo trên máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS Shimadzu AA 7000 tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 2 ( Quatest 2) Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.10

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại nặng trong cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

Kim loại nặng Hàm lượng trong cao đặc hoa đu đủ đực (mg/kg)

Nhận xét: Hàm lượng một số kim loại nặng khảo sát trong cao đặc hoa đu đủ đực đều dưới mức cho phép theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT nên không ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Kết quả khảo sát độ pH của dung dịch cao đặc hoa đu đủ đực trong nước đo tại trường đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng được thể hiện ở Bảng 3.11

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ pH của dung dịch cao đặc hoa đu đủ đực trong nước với dung môi chiết xuất là nước

Lần đo 1 2 3 4 5 Trung bình pH 4,870 4,890 4,880 4,880 4,860 4,876

Nhận xét: Độ pH trung bình của dung dịch cao đặc hoa đu đủ đực trong nước là 4,876 Theo tiêu chuẩn dung dịch cao đặc hoa đu đủ đực 1% (kl/tt) trong nước phải có pH từ 4,0 đến 5,0 Như vậy độ pH trung bình của dung dịch cao đặc hoa đu đủ đạt yêu cầu

Kết quả định tính các nhóm hợp chất có khả năng gây độc tế bào ung thư từ cao đặc hoa đu đủ đực được thể hiện ở Bảng 3.12

Bảng 3.12: Kết quả định tính các nhóm chất trong cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

STT Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tượng Kết quả Kết luận sơ bộ

1 Saponin Phản ứng tạo bọt Tạo cột bọt bền + Có

3 Coumarin Phản ứng đóng mở vong lacton

Tạo dung dịch đục + Có

Dung dịch chuyển sang màu tím đỏ

Dung dịch chuyển sang màu vàng đậm

Dung dịch chuyển sang màu xanh đen

Kết tủa đỏ gạch ++ Có

Dung dịch chuyển sang +++ Có màu xanh thẫm

Dung dịch chuyển sang màu xanh

Dung dịch chuyển sang màu xanh lục

8 Chất béo Hơ nóng cho bay hơi hết dung môi Để lại vết mờ trên giấy lọc + Có

9 Acid hữu cơ Phản ứng với

Không hiện tượng - Không có

Dung dịch có màu xanh lá ++ Có

Ghi chú: Dấu (+) : Phản ứng dương tính

(++) : Phản ứng dương tính rõ (+++) : Phản ứng dương tính rất rõ (-) : Không có

Nhận xét: Với mục tiêu hướng tới ứng dụng cao chiết trong dược phẩm / thực phẩm hỗ trợ điều trị ung thư, chế phẩm phải thể hiện phép thử định tính của các nhóm hợp chất có khả năng gây độc tế bào ung thư từ hoa đu đủ đực Các kết quả định tính trên bảng 3.12 cho thấy sự có mặt của các lớp chất: Alcaloid, flavonoid, saponin, đường khử, polyphenol, steroid, coumarin, carotene, chất béo trong cao đặc hoa đu đủ đực

3.3.8 Hoạt tính kháng vi sinh vật

Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và kháng nấm của cao đặc hoa đu đủ đực được thể hiện ở Bảng 3.13

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

Cao đặc hoa đu đủ đực

Cyclohexa mide b 32 a Chất đối chứng cho các chủng vi khuẩn b Chất đối chứng cho nấm

Nhận xét: Kết quả Bảng 3.13 cho thấy cao đặc hoa đu đủ đực biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn Enterococcus faecalis (ATCC299212) với giá trị MIC là

128àg/mL và cú khả năng ức chế sự phỏt triển của nấm Candida albicans

(ATCC10231) với giỏ trị MIC là 128 àg/mL

3.3.9 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao đặc hoa đu đủ đực được thể hiện ở Bảng 3.14

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao đặc hoa đu đủ đực với dung môi chiết xuất là nước

Tế bào (TB) sống sót (CS %)

% TB sống Sai số % TB sống Sai số % TB sống Sai số

Cao đặc hoa đu đủ đực

Camptothecin * : Chất đối chứng dương hoạt động ổn định trong thí nghiệm

Nhận xét: Kết quả Bảng 3.14 cho thấy cao đặc hoa đu đủ đực thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên cả 3 dòng tế bào ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B, ung thư vỳ MCF-7 ở nồng độ 30 àg/mL và 100 àg/mL với cỏc mức độ khỏc nhau

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN

Trong khuôn khổ luận văn, qua quá trình nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi rút ra các kết quả chính đạt được như sau:

1 Tìm được phương trình hồi quy phù hợp với thực nghiệm là: f = 1,35625 + 1,625.10 -4 z 1 + 0,0375.z 2

2 Các điều kiện tối ưu để chiết cao dược liệu từ hoa đu đủ đực trong phòng thí nghiệm: Điều kiện chiết thích hợp để thu cao nước từ hoa đu đủ đực trong phòng thí nghiệm là tỉ lệ thể tích nước và khối lượng bột hoa đu đủ đực : 200 mL/5 gam hay tỉ lệ dung môi chiết/nguyên liệu 40/1 (v/w), thời gian chiết 3,0 giờ với hàm lượng cao nước thu được đạt 31,40% Chúng tôi đã sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp I với sự hỗ trợ của phần mềm Matlab R2017b xác định được tỉ lệ dung môi chiết/nguyên liệu tối ưu 100/1 (v/w), thời gian chiết tối ưu 4,0 giờ với hàm lượng cao nước đạt 31,75%

3 Cao nước thu được từ hoa đu đủ đực ở các điều kiện chiết tối ưu đạt yêu cầu theo quy định DĐVN V:

- Kết quả cắn không tan trong nước, mất khối lượng do làm khô, tro toàn phần đều đạt yêu cầu theo quy định DĐVN V

- Kết quả khảo sát hàm lượng một số kim loại nặng khảo sát trong cao dược liệu từ hoa đu đủ đực đều dưới mức cho phép theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT nên không ảnh hưởng đến sức khỏe con người

- Kết quả định tính của các nhóm hợp chất có khả năng gây độc tế bào ung thư từ cao dược liệu từ hoa đu đủ đực: Sơ bộ kết luận trong cao dược liệu từ hoa đu đủ đực có chứa các hoạt chất: Alcaloid, Flavonoid, saponin, đường khử, polyphenol, steroid, coumarin, carotene, chất béo

- Thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế bào trên cả 3 dòng tế bào ung thư phổi A549, ung thư gan Hep3B, ung thư vú MCF-7 với các mức độ khác nhau Những kết quả nghiên cứu của chúng tôi góp phần cung cấp thông tin bổ ích về việc khai thác và sử dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên này phục vụ cho việc định hướng tạo các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng chăm sóc và bồi bổ sức khỏe của con người

Lĩnh vực nghiên cứu sử dụng cây thuốc từ thiên nhiên có nhiều triển vọng phát triển và mở rộng nghiên cứu Đề tài kiến nghị một số nội dung cần nghiên cứu ở các giai đoạn tiếp theo như tiếp tục phân lập các hợp chất hóa học từ hoa đu đủ đực và nghiên cứu có hệ thống về hoạt tính sinh học của chúng, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng trong thực tiễn làm thuốc hỗ trợ điều trị một số bệnh hiểm nghèo trong đó có ung thư

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

[1] Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở

Việt Nam Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tập 1, pp 824-827

[2] Nguyễn Văn Đàm, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb Y học, Hà Nội

[3] Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, Nxb Y học, Hà Nội

[4] Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012), Hai cycloratane triterpene lần đầu tiên phân lập từ lá đu đủ (carica papaya L.) Tạp chí hóa học, tập 50 (4A), pp 166-

[5] Hồ Thị Hà (2014), Nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ(Carica papaya Linn) Luận án tiến sĩ Đại học Bách khoa Hà Nội

[6] PGS.TS Nguyễn Nhật Lệ (2005), Giải bài toán tối ưu hoá ứng dụng bằng Matlab -Maple, Nhà XB Khoa học và Kỹ thuật

[7] Giang Thị Kim Liên (2009), Bài giảng quy hoạch thực nghiệm (Các phương pháp thống kê xử lý số liệu thực nghiệm), ĐH Đà Nẵng