Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Lan Hương TS.Phạm Tuấn Anh Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số liệu kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Hà nội, ngày Giáo viên hướng dẫn khoa học tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thanh I LỜI CẢM ƠN Sau năm học tập nghiên cứu thực luận án Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách Khoa Hà Nội, hướng dẫn, định hướng cô thầy hướng dẫn trực tiếp suốt trình học tập, giúp đỡ tập thể thầy, cô giáo, anh, chị, em phụ trách Bộ mơn, Phịng, Ban, bạn đồng nghiệp em sinh viên trường góp phần giúp em hồn thành luận án Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn trực tiếp PGS TS Nguyễn Lan Hương, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội TS Phạm Tuấn Anh, Trưởng mơn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội Cô thầy hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực hồn thành luận án Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể thầy, cô giáo, cán thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ mơn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội đóng góp ý kiến, tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt q trình triển khai thí nghiệm thực nghiệm hồn thành nội dung luận án Đại học Bách khoa Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, tập thể thầy, Phịng Sau đại học/Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập, nghiên cứu bảo vệ luận án Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể Ban lãnh đạo, huy Học viện Hậu cần Viện Nghiên cứu KHHC quân đồng nghiệp, tập thể Phòng, Ban thuộc Học viện Hậu cần tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ động viên em q trình cơng tác, học tập nghiên cứu Đại học Bách khoa Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn đến lãnh đạo, huy Đồn 871, tập thể Phịng Quản lý học viên nước, lãnh đạo, huy Quản lý Hệ 1/Đồn 871/ Tổng cục Chính trị quan tâm, tạo điều kiện cho em suốt trình học tập nghiên cứu Đại học Bách khoa Hà Nội II Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, chia sẻ khó khăn động viên để em hoàn thành luận án Trân trọng! Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thanh III MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN .II DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT VIII DANH MỤC BẢNG X DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ XI MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết luận án Mục tiêu luận án Nội dung luận án Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án Những đóng góp luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu enzyme thủy phân fibrin 1.1.1 Cơ chế tiêu sợi huyết enzyme thủy phân fibrin 1.1.2 Ứng dụng enzyme thủy phân fibrin 1.1.3 Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin 1.2 Giới thiệu Bacillus sp 11 1.2.1 Đặc điểm Bacillus sp 11 1.2.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 11 1.2.1.2 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 12 1.2.2 Nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin sinh tổng hợp từ Bacillus sp 14 1.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin đột biến 15 1.3.1 Phương pháp gây đột biến UV 17 1.3.1.1 Cơ chế gây đột biến UV 17 1.3.1.2 Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn 18 1.3.2 Phương pháp gây đột biến hóa chất 19 1.3.2.1 Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS EtBr 19 1.3.2.2 Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS EtBr nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn 20 IV 1.3.3 Phương pháp gây đột biến kỹ thuật sinh học phân tử 22 1.3.3.1 Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp 22 1.3.3.2 Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp tăng khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng 22 1.4 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men 23 1.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 23 1.4.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men 25 1.5 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 27 1.5.1 Lên men theo mẻ 27 1.5.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng 28 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên men 29 1.6 Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại 31 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu 34 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 34 2.1.2 Hóa chất 34 2.1.3 Thành phần môi trường 36 2.1.4 Thiết bị 36 2.2 Phương pháp nghiên cứu 38 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 38 2.2.2 Phương pháp vi sinh 38 2.2.2.1 Phân lập sàng lọc chủng 38 2.2.2.2 Hoạt hóa chủng 39 2.2.2.3 Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào 39 2.2.2.4 Kiểm tra độ ổn định chủng đột biến 39 2.2.2.5 Khảo sát khả tạo bào tử chủng đột biến 40 2.2.3 Phương pháp hóa lý, hóa sinh 40 2.2.3.1 Đột biến chủng vi khuẩn 40 2.2.3.2 Xác định hoạt độ enzyme 43 2.2.3.3 Nhuộm Gram 44 V 2.2.3.4 Nhuộm bào tử 44 2.2.3.5 Xác định đường khử phương pháp DNS 44 2.2.3.6 Xác định hàm lượng protein hòa tan phương pháp Bradford 44 2.2.3.7 Xác định hàm lượng sinh khối khô 45 2.2.3.8 Đo độ nhớt dịch lên men 45 2.2.3.9 Định tính enzyme amylase 45 2.2.3.10 Định tính enzyme cellulase 45 2.2.3.11 Đặc điểm sinh hóa chủng gốc chủng đột biến 45 2.2.4 Phương pháp sinh học phân tử 47 2.2.4.1 Tách DNA tổng số vi khuẩn 47 2.2.4.2 Giải trình tự gen vi khuẩn 47 2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng Bacillus sp 48 2.2.5.1 Nghiên cứu lựa chọn mơi trường lên men thích hợp cho khả sinh enzyme thủy phân fibrin 48 2.2.5.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp 49 2.2.5.3 Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men 49 2.2.6 Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men 51 2.2.6.1 Lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng giai đoạn 52 2.2.6.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng giai đoạn 53 2.2.7 Xử lý số liệu 53 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao 54 3.1.1 Phân lập vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme protease 54 3.1.2 Khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng 56 3.2 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng lựa chọn phương pháp gây đột biến 59 3.2.1 Đột biến tia UV 59 3.2.2 Đột biến chủng HY6 hóa chất EtBr 62 3.2.3 Đột biến UV kết hợp hóa chất 63 3.2.3.1 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr 63 3.2.3.2 Đột biến chủng U5_90.5 EMS 64 VI 3.2.3.3 Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV EtBr) EMS 65 3.2.3.4 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr kết hợp với EMS 67 3.2.4 Độ ổn định chủng đột biến 68 3.2.5 Bước đầu tìm hiểu hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin chủng HY6 ban đầu chủng đột biến ES4 70 3.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 kỹ thuật lên men 75 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp để sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 75 3.3.1.1 Nguồn carbon 75 3.3.1.2 Nguồn nitrogen 77 3.3.1.3 Các ion kim loại 78 3.3.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho khả sinh enzyme chủng 81 3.3.2.1 Nhiệt độ lên men 81 3.3.2.2 pH môi trường ban đầu 82 3.3.3 Tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 83 3.3.4 Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin 90 3.3.4.1 Lên men theo mẻ 90 3.3.3.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng giai đoạn 91 3.3.3.3 Lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng giai đoạn 93 KẾT LUẬN 97 KIẾN NGHỊ 98 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 99 TÀI LIỆU THAM KHẢO 100 PHỤ LỤC 122 VII DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết bò CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl cellulose CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromide Cộng cs DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNS 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic DO Dissolved Oxygen Oxi hòa tan EDTA Etylenediaminetetraacetic acid Axit etylenediaminetetraacetic EMS Ethyl methanesulfonate Ethyl methanesulfonate EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide FE Fibrinolytic enzyme Enzyme thủy phân fibrin FU Fibrin unit Đơn vị hoạt độ enzyme thủy phân fibrin GĐ LB Giai đoạn Luria-Bertani LM Luria-Bertani Lên men mPas Milipascal Đơn vị đo độ nhớt động lực NTG N-methyl-N-nitro-Nnitrosoguanid N-methyl-N-nitro-Nnitrosoguanid OD Optical density Mật độ quang học PGA Polyglutamic Acid Axit Polyglutamic RAST Rapid Annotations using Subsystems Technology Chú thích nhanh Cơng nghệ hệ thống phụ/ Hệ thống VIII PHỤ LỤC Phụ lục Dựng đường chuẩn tyrosine Cân 0,001 g tyrosin pha 50 ml HCl 0,2 N, dung dịch gốc Từ pha lỗng nồng độ từ – 20 µg/ml Tiến hành so màu bước sóng 275nm xây dựng đường chuẩn 0.7 y = 0.01x + 0.0039 R² = 0.9997 OD (275nm) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 Nồng độ tyrosine (µg/ml) 60 70 Phụ lục Dựng đường chuẩn glucose Dung dịch chuẩn glucose: 100µg/ml (100ml) Pha loãng dung dịch glucose chuẩn theo dải nồng độ từ 0-100μg/ml Tiến hành so màu bước song 540nm xây dựng đường chuẩn Nồng độ Glucose (mg/ml) 0.12 y = 0.022x + 0.0026 R² = 0.9977 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 OD (540nm) 122 Phụ lục Dựng đường chuẩn Protein Pha lỗng nồng độ BSA chuẩn: Thể tích ống ống ống ống ống ống Nồng độ dd gốc (µg/ml) 10 20 30 40 50 V H₂O 0,9 0,8 0,7 0,6 0,8 ∑V (ml) 6 6 6 Vdd chuẩn (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 V Bradford (ml) 5 5 5 + Lắc phút + Đo độ hấp thụ bước sóng 595 nm + Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µm/ml) với mật độ quang 0.8 y = 0.0141x + 0.0148 R² = 0.9982 0.7 OD (595 nm) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 Nồng độ BSA (µg/ml) 50 60 123 Phụ lục Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc 23 chủng phân lập có hoạt tính protease cao Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc HY5 HY6 HY1 HY4 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng, Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, nhăn lồi tròn đục, tròn, nhăn lồi đục, tròn, nhăn, bờ viền HY12 HY7 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, bề mặt nhăn xám, tròn, bề mặt nhăn HY14 HY13 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng xám, trịn đều, có sữa, trịn, nhăn vân HD3 HY15 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng sữa, trịn đều, nhăn đục, trịn đều, có vân HP4 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhăn lồi, lõm NA1 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, nhăn lồi NA3 NA2 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng, sữa, tròn, bề mặt mịn tròn, viền xung quanh NA5 Khuẩn lạc màu trắng xám, không trịn, nhăn lồi HN4 Khuẩn lạc màu trắng đục, khơng trịn, nhăn viền ngồi HN8 HN9 HN11 HN5 Khuẩn lạc màu xám, Khuẩn lạc màu trắng, Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng khơng trịn, nhăn lồi trịn, vân trịn xám, khơng trịn xám, khơng trịn, nhăn 124 PT1 BN3 BN1 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, viền xám, tròn, vân tròn đục, tròn đều, nhăn cưa lồi Vòng thủy phân sữa gầy số chủng phân lập sàng lọc có hoạt tính protease đĩa thạch LB + % sữa gầy (ủ 37 oC/6 h) Phụ lục Khảo sát tỉ lệ % tế bào sống tế bào chết sau chiếu tia UV khoảng thời gian khác (từ 30 - 180 phút) 120 Tỉ lệ % sống Tỉ lệ % chết Tỉ lệ % 100 80 60 40 20 0 30 60 90 120 150 180 Thời gian chiếu tia UV (phút) 125 Một số hình ảnh sàng lọc chủng đột biến tia UV trải đĩa thạch LB + 1% sữa gầy sàng lọc hoạt tính enzyme protease 126 Bảng tổng hợp số liệu khuẩn lạc thu nhận sau đột biến UV TT Đột biên UV Tổng số khuẩn lạc Lần 94 Lần 85 Lần 91 Lần 87 Lần 83 Tổng số 440 127 Phụ lục Một số hình ảnh sàng lọc chủng đột biến hóa chất trải đĩa thạch LB + 1% sữa gầy sàng lọc hoạt tính enzyme protease 128 129 Bảng tổng hợp số liệu khuẩn lạc thu nhận sau đột biến hóa chất TT Chủng sử dụng để đột biến Hóa chất đột biến Tổng số khuẩn lạc HY6 EtBr 214 U5_90.5 EtBr 201 U5_90.5 EMS 196 E1 EMS 205 U5_90.5 EtBr +EMMS 104 130 Phụ lục So sánh đặc điểm chủng HY6 ES4 ES4 HY6 Hình ảnh khuẩn lạc chủng HY6 ES4 (trên môi trường LB + 1% sữa gầy, 37 oC/16 h) ES4/24 h HY6/24 h HY6/72h ES4/72 h 131 ES4/7 ngày Hình ảnh nhuộm bào tử chủng HY6 ES4 (nuôi môi trường DSM) Hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột cellulose chủng HY6 chủng đột biến ES4 (ủ 37 oC/6 giờ) 132 Phụ lục Xây dựng phân loài TYPE (STRAIN) GENOME SERVER cho chủng HY6 ES4 133 Phụ lục Kết phản ứng sinh hóa API 50CH, API 20E sau 18 h kết phân tích phần mềm APIWED TM chủng HY6 ES4 Kết phản ứng hóa sinh API 50CH Kết phản ứng sinh hóa API 20E sau ủ 18 h, chưa nhỏ TDA, IND VP Kết phản ứng sinh hóa API 20E sau ủ 18 h nhỏ TDA, IND VP sau 10 phút 134 Phục lục 10 Bảng tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng theo hàm số mũ lên men theo mẻ bổ sung chất dinh dưỡng giai đoạn giai đoạn Tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng (ml/h) TT Thời gian (h) Thể tích (ml) 5h 4.83 1.21 5h15 5.50 1.37 5h30 6.25 1.56 5h45 7.10 1.78 6h 8.07 2.02 5h15 9.18 2.29 5h30 10.44 2.61 5h45 11.86 2.97 7h 13.49 3.37 10 7h15 15.33 3.83 11 7h30 17.43 4.36 12 7h45 19.82 4.95 13 8h 22.53 5.63 14 8h15 25.61 6.40 15 8h30 29.11 7.28 16 8h45 33.10 8.27 17 9h 37.63 9.41 18 9h15 42.77 10.69 19 9h30 48.63 12.16 20 9h45 55.28 13.82 21 10h 62.85 15.71 22 10h15 71.45 17.86 23 10h30 81.22 20.31 135 24 10h45 92.34 23.08 25 11h 104.97 26.24 26 11h15 119.34 29.83 27 11h30 135.67 33.92 28 11h45 154.23 38.56 29 12h 175.34 43.83 30 12h15 199.33 49.83 31 12h30 226.60 56.65 32 12h45 257.61 64.40 33 13h 292.86 73.22 Hình ảnh thiết bị lên men lít 136