Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens

Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.Nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bùi Thị Thanh NGHIÊN CỨU CẢI THIỆN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME THỦY PHÂN FIBRIN TỪ VI KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Lan Hương TS.Phạm Tuấn Anh Hà Nội – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, số liệu kết nêu luận án trung thực chưa công bố cơng trình khác Hà nội, ngày Giáo viên hướng dẫn khoa học tháng năm 2023 Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thanh LỜI CẢM ƠN Sau năm học tập nghiên cứu thực luận án Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách Khoa Hà Nội, hướng dẫn, định hướng cô thầy hướng dẫn trực tiếp suốt trình học tập, giúp đỡ tập thể thầy, cô giáo, anh, chị, em phụ trách Bộ mơn, Phịng, Ban, bạn đồng nghiệp em sinh viên trường góp phần giúp em hồn thành luận án Em xin chân thành gửi lời cám ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn trực tiếp PGS TS Nguyễn Lan Hương, Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội TS Phạm Tuấn Anh, Trưởng mơn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội Cô thầy hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực hồn thành luận án Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể thầy, cô giáo, cán thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Bộ mơn Vi sinh-Hóa sinh-Sinh học phân tử, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ sinh học Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm/Đại học Bách khoa Hà Nội đóng góp ý kiến, tạo điều kiện, giúp đỡ em suốt q trình triển khai thí nghiệm thực nghiệm hồn thành nội dung luận án Đại học Bách khoa Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn đến Ban giám hiệu, tập thể thầy, Phịng Sau đại học/Đại học Bách khoa Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập, nghiên cứu bảo vệ luận án Em xin chân thành cảm ơn đến tập thể Ban lãnh đạo, huy Học viện Hậu cần Viện Nghiên cứu KHHC quân đồng nghiệp, tập thể Phòng, Ban thuộc Học viện Hậu cần tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ động viên em q trình cơng tác, học tập nghiên cứu Đại học Bách khoa Hà Nội Em xin chân thành cảm ơn đến lãnh đạo, huy Đồn 871, tập thể Phịng Quản lý học viên nước, lãnh đạo, huy Quản lý Hệ 1/Đồn 871/ Tổng cục Chính trị quan tâm, tạo điều kiện cho em suốt trình học tập nghiên cứu Đại học Bách khoa Hà Nội Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè quan tâm, chia sẻ khó khăn động viên để em hoàn thành luận án Trân trọng! Nghiên cứu sinh Bùi Thị Thanh MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG 10 DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ 11 MỞ ĐẦU 13 Tính cấp thiết luận án 13 Mục tiêu luận án 14 Nội dung luận án 14 Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án 14 Những đóng góp luận án 15 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16 1.1 Giới thiệu enzyme thủy phân fibrin 16 1.1.1 Cơ chế tiêu sợi huyết enzyme thủy phân fibrin 16 1.1.2 Ứng dụng enzyme thủy phân fibrin 18 1.1.3 Nguồn thu nhận enzyme thủy phân fibrin 19 1.2 Giới thiệu Bacillus sp 22 1.2.1 Đặc điểm Bacillus sp 22 1.2.1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis 23 1.2.1.2 Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens 24 1.2.2 Nghiên cứu thu nhận enzyme thủy phân fibrin sinh tổng hợp từ Bacillus sp 25 1.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin đột biến 27 1.3.1 Phương pháp gây đột biến UV 29 1.3.1.1 Cơ chế gây đột biến UV 29 1.3.1.2 Nghiên cứu đột biến UV nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn 29 1.3.2 Phương pháp gây đột biến hóa chất 31 1.3.2.1 Cơ chế gây đột biến hóa chất EMS EtBr 31 1.3.2.2 Nghiên cứu đột biến hóa chất EMS EtBr nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng vi khuẩn 32 1.4 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men 33 1.4.1 Khảo sát ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 34 1.4.2 Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin tối ưu môi trường lên men 35 1.5 Kỹ thuật lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 38 1.5.1 Lên men theo mẻ 38 1.5.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất 39 1.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên men 40 1.6 Sản phẩm enzyme thủy phân fibrin thương mại 42 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 44 2.1 Vật liệu 44 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 44 2.1.2 Hóa chất 44 2.1.3 Thành phần môi trường 45 2.1.4 Thiết bị 46 2.2 Phương pháp nghiên cứu 47 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 47 2.2.2 Phương pháp phân tích 48 2.2.2.1 Xác định hoạt độ enzyme 48 2.2.2.2 Nhuộm Gram 49 2.2.2.3 Nhuộm bào tử 49 2.2.2.4 Xác định đường khử phương pháp DNS 49 2.2.2.5 Xác định hàm lượng protein hòa tan phương pháp Bradford 49 2.2.2.6 Xác định hàm lượng sinh khối khô 50 2.2.2.7 Đo độ nhớt dịch lên men 50 2.2.2.8 Định tính enzyme amylase 50 2.2.2.9 Định tính enzyme cellulase 50 2.2.2.10 Đặc điểm sinh hóa chủng gốc chủng đột biến 50 2.2.2.11 Tách DNA tổng số giải trình tự gen vi khuẩn 51 2.2.2.12 Xử lý số liệu 52 2.2.3 Phương pháp thí nghiệm 53 2.2.3.1 Phân lập sàng lọc chủng 53 2.2.3.2 Hoạt hóa chủng 53 2.2.3.3 Thu nhận enzyme thủy phân fibrin ngoại bào 53 2.2.3.4 Đột biến chủng vi khuẩn 53 2.2.3.5 Kiểm tra độ ổn định chủng đột biến 56 2.2.3.6 Khảo sát khả tạo bào tử chủng đột biến 57 2.2.3.7 Tối ưu hóa điều kiện lên men đến khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng Bacillus sp 57 2.2.3.8 Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men 60 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 63 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin cao 63 3.1.1 Phân lập vi khuẩn có khả sinh tổng hợp enzyme protease 63 3.1.2 Khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng 65 3.2 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng lựa chọn phương pháp gây đột biến 67 3.2.1 Đột biến tia UV 67 3.2.2 Đột biến chủng HY6 hóa chất EtBr 70 3.2.3 Đột biến UV kết hợp hóa chất 71 3.2.3.1 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr 71 3.2.3.2 Đột biến chủng U5_90.5 EMS 72 3.2.3.3 Đột biến chủng E1 (đã đột biến UV EtBr) EMS 73 3.2.3.4 Đột biến chủng U5_90.5 EtBr kết hợp với EMS 75 3.2.4 Độ ổn định chủng đột biến 76 3.2.5 Bước đầu tìm hiểu hệ gen liên quan đến enzyme thủy phân fibrin chủng HY6 ban đầu chủng đột biến ES4 78 3.3 Nâng cao khả sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 kỹ thuật lên men 82 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn môi trường lên men thích hợp để sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin chủng ES4 82 3.3.1.1 Nguồn carbon 83 3.3.1.2 Nguồn nitrogen 84 3.3.1.3 Các ion kim loại 86 3.3.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men thích hợp cho khả sinh enzyme chủng 88 3.3.2.1 Nhiệt độ lên men 88 3.3.2.2 pH môi trường ban đầu 90 3.3.3 Tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men sinh tổng hợp enzyme thủy phân fibrin 91 3.3.4 Nghiên cứu lựa chọn kỹ thuật lên men thu nhận enzyme thủy phân fibrin 97 3.3.4.1 Lên men theo mẻ 97 3.3.3.2 Lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn 98 3.3.3.3 Lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn 100 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 104 KẾT LUẬN 104 KIẾN NGHỊ 105 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 106 TÀI LIỆU THAM KHẢO 107 PHỤ LỤC 131 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt BSA Tên tiếng anh Bovine Serum Albumin Tên tiếng việt Albumin huyết bò Bắc Ninh BN CFU Colony-forming unit Đơn vị hình thành khuẩn lạc CMC Carboxymethyl cellulose Carboxymethyl xenluloza CTAB Cetyltrimethylammonium Cetyltrimethylammonium bromide bromide Cộng cs DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic DNS 3,5-Dinitrosalicylic acid Axit 3,5-Dinitrosalicylic DO Dissolved Oxygen Oxi hòa tan EDTA Etylenediaminetetraacetic acid Axit etylenediaminetetraacetic EMS Ethyl methanesulfonate Ethyl methanesulfonate EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide FE Fibrinolytic enzyme Enzyme thủy phân fibrin FU Fibrin unit Đơn vị hoạt độ enzyme thủy phân fibrin GĐ Giai đoạn HD Hải Dương HN Hà Nội HP Hải Phòng HY Hưng Yên LB Luria-Bertani LM mPas Lên men Milipascal Đơn vị đo độ nhớt động lực Nghệ An NA NTG Luria-Bertani N-methyl-N-nitro-N- N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanid nitrosoguanid OD Optical density Mật độ quang học PGA Polyglutamic Acid Axit Polyglutamic PT Phú Thọ PHỤ LỤC Phụ lục Dựng đường chuẩn tyrosine Cân 0,001 g tyrosin pha 50 ml HCl 0,2 N, dung dịch gốc Từ pha lỗng nồng độ từ – 20 µg/ml Tiến hành so màu bước sóng 275nm xây dựng đường chuẩn 0.7 y = 0.01x + 0.0039 R² = 0.9997 OD (275nm) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 50 Nồng độ tyrosine (µg/ml) 60 70 Phụ lục Dựng đường chuẩn glucose Dung dịch chuẩn glucose: 100µg/ml (100ml) Pha lỗng dung dịch glucose chuẩn theo dải nồng độ từ 0-100μg/ml Tiến hành so màu bước song 540nm xây dựng đường chuẩn Nồng độ Glucose (mg/ml) 0.12 y = 0.022x + 0.0026 R² = 0.9977 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 OD (540nm) 131 Phụ lục Dựng đường chuẩn Protein Pha loãng nồng độ BSA chuẩn: Thể tích ống ống ống ống ống ống Nồng độ dd gốc (µg/ml) 10 20 30 40 50 V H₂O 0,9 0,8 0,7 0,6 0,8 ∑V (ml) 6 6 6 Vdd chuẩn (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 V Bradford (ml) 5 5 5 + Lắc phút + Đo độ hấp thụ bước sóng 595 nm + Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µm/ml) với mật độ quang 0.8 y = 0.0141x + 0.0148 R² = 0.9982 0.7 OD (595 nm) 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10 20 30 40 Nồng độ BSA (µg/ml) 50 60 132 Phụ lục Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc 23 chủng phân lập có hoạt tính protease cao Đặc điểm, hình thái khuẩn lạc HY5 HY6 HY1 HY4 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng, Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn, nhăn lồi tròn đục, tròn, nhăn lồi đục, tròn, nhăn, bờ viền HY12 HY7 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, bề mặt nhăn xám, tròn, bề mặt nhăn HY14 HY13 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng xám, trịn đều, có sữa, trịn, nhăn vân HD3 HY15 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng sữa, trịn đều, nhăn đục, trịn đều, có vân HP4 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhăn lồi, lõm NA1 Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, nhăn lồi NA3 NA2 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng, sữa, tròn, bề mặt mịn tròn, viền xung quanh NA5 Khuẩn lạc màu trắng xám, khơng trịn, nhăn lồi HN4 Khuẩn lạc màu trắng đục, khơng trịn, nhăn viền HN8 HN9 HN11 HN5 Khuẩn lạc màu xám, Khuẩn lạc màu trắng, Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng khơng trịn, nhăn lồi trịn, vân trịn xám, khơng trịn xám, khơng trịn, nhăn 133 PT1 BN3 BN1 Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng Khuẩn lạc màu trắng đục, tròn đều, viền xám, tròn, vân tròn đục, tròn đều, nhăn cưa lồi Vòng thủy phân sữa gầy số chủng phân lập sàng lọc có hoạt tính protease đĩa thạch LB + % sữa gầy (ủ 37 oC/6 h) Phụ lục Khảo sát tỉ lệ % tế bào sống tế bào chết sau chiếu tia UV khoảng thời gian khác (từ 30 - 180 phút) 120 Tỉ lệ % sống Tỉ lệ % chết Tỉ lệ % 100 80 60 40 20 0 30 60 90 120 150 180 Thời gian chiếu tia UV (phút) 134 Một số hình ảnh sàng lọc chủng đột biến tia UV trải đĩa thạch LB + 1% sữa gầy sàng lọc hoạt tính enzyme protease 135 Bảng tổng hợp số liệu khuẩn lạc thu nhận sau đột biến UV TT Đột biên UV Tổng số khuẩn lạc Lần 94 Lần 85 Lần 91 Lần 87 Lần 83 Tổng số 440 Phụ lục Một số hình ảnh sàng lọc chủng đột biến hóa chất trải đĩa thạch LB + 1% sữa gầy sàng lọc hoạt tính enzyme protease 136 137 138 Bảng tổng hợp số liệu khuẩn lạc thu nhận sau đột biến hóa chất TT Chủng sử dụng để đột biến Hóa chất đột biến Tổng số khuẩn lạc HY6 EtBr 214 U5_90.5 EtBr 201 U5_90.5 EMS 196 E1 EMS 205 U5_90.5 EtBr +EMMS 104 139 Phụ lục So sánh đặc điểm chủng HY6 ES4 ES4 HY6 Hình ảnh khuẩn lạc chủng HY6 ES4 (trên môi trường LB + 1% sữa gầy, 37 oC/16 h) ES4/24 h HY6/24 h HY6/72h ES4/72 h 140 ES4/7 ngày Hình ảnh nhuộm bào tử chủng HY6 ES4 (nuôi môi trường DSM) Hoạt tính enzyme thủy phân tinh bột xenlulolaza chủng HY6 chủng đột biến ES4 (ủ 37 oC/6 giờ) 141 Phụ lục Xây dựng phân loài TYPE (STRAIN) GENOME SERVER cho chủng HY6 ES4 142 Phụ lục Kết phản ứng sinh hóa API 50CH, API 20E sau 18 h kết phân tích phần mềm APIWED TM chủng HY6 ES4 Kết phản ứng hóa sinh API 50CH Kết phản ứng sinh hóa API 20E sau ủ 18 h, chưa nhỏ TDA, IND VP Kết phản ứng sinh hóa API 20E sau ủ 18 h nhỏ TDA, IND VP sau 10 phút 143 Phục lục 10 Bảng tốc độ bổ sung chất theo hàm số mũ lên men theo mẻ bổ sung chất giai đoạn giai đoạn TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Thời gian (h) 5h 5h15 5h30 5h45 6h 5h15 5h30 5h45 7h 7h15 7h30 7h45 8h 8h15 8h30 8h45 9h 9h15 9h30 9h45 10h 10h15 10h30 10h45 11h 11h15 11h30 11h45 12h 12h15 12h30 12h45 13h Tốc độ bổ sung chất (ml/h) Thể tích (ml) 4.83 1.21 5.50 1.37 6.25 1.56 7.10 1.78 8.07 2.02 9.18 2.29 10.44 2.61 11.86 2.97 13.49 3.37 15.33 3.83 17.43 4.36 19.82 4.95 22.53 5.63 25.61 6.40 29.11 7.28 33.10 8.27 37.63 9.41 42.77 10.69 48.63 12.16 55.28 13.82 62.85 15.71 71.45 17.86 81.22 20.31 92.34 23.08 104.97 26.24 119.34 29.83 135.67 33.92 154.23 38.56 175.34 43.83 199.33 49.83 226.60 56.65 257.61 64.40 292.86 73.22 144 Hình ảnh thiết bị lên men lít 145