Nghiên cứu sự đa dạng sinh học của một số chủng xạ khuẩn thuộc chi streptomyces phân lập tại thái nguyên và định hướng ứng dụng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - ĐỖ THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - ĐỖ THỊ TUYẾN NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Vi Thị Đoan Chính Thái Ngun, 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục kí hiệu, viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình vẽ viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.3 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 1.2.1 Phƣơng pháp phân loại truyền thống 1.2.2 Phƣơng pháp phân loại dựa vào thị phân tử gene 16S rRNA 1.3 SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 12 1.3.1 Cơ chế sinh tổng hợp chất kháng sinh 12 1.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 13 1.3.3 Tách chiết chất kháng sinh 15 1.4 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 16 1.4.1 Vi nấm nguyên nhân chủ yếu gây bệnh hại trồng 16 1.4.2 Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 17 1.5 XẠ KHUẨN ỨNG DỤNG TRONG BẢO VỆ MÔI TRƢỜNG .19 iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.5.1 Tuyển chọn xạ khuẩn sinh enzyme 19 1.5.2 Một số enzyme chủ yếu ứng dụng bảo vệ môi trƣờng 20 Chƣơng : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .23 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .23 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 23 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ MÔI TRƢỜNG 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Dụng cụ thiết bị 24 2.2.3 Môi trƣờng nghiên cứu 24 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 26 2.3.2 Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào 26 2.3.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng sinh 27 2.3.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme 28 2.3.5 Phƣơng pháp xác định khả chịu nhiệt enzyme 28 2.3.6 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn 28 2.3.7 Phƣơng pháp xác định trình tự đoạn gene 16S rRNA 30 2.3.8 Nghiên cứu bƣớc đầu trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh 33 2.3.9 Phƣơng pháp tách chiết chất kháng sinh 33 2.3.10 Xác định ảnh hƣởng dịch nuôi cấy đến khả nảy mầm hạt 34 2.3.11 Phƣơng pháp xử lý số liệu 34 Chƣơng : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .35 3.1 SỰ PHÂN BỐ VÀ TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN 35 3.1.1 Sự phân bố xạ khuẩn đất 35 iv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1.2 Tính đa dạng sinh học xạ khuẩn .36 Hoạt tính kháng sinh chọn lọc chủng xạ khuẩn có HTKS cao 37 3.2.1 Hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn phân lập 37 3.2.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao 41 3.3 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 44 3.3.1 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn HT 17.8 HT19.1 44 3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy 45 3.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 46 3.3.4 Phân loại chủng xạ khuẩn HT17.8 HT19.1 .51 3.4 NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP VÀ MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẤT KHÁNG SINH CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 59 3.4.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh .59 3.4.2 Tách chiết xác định số tính chất chất kháng sinh chủng HT17.8 62 3.5 TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH ENZYME 64 3.5.1 Hoạt tính enzyme xạ khuẩn 64 3.5.2 Khả chịu nhiệt enzyme 66 3.6 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT 68 KẾT LUẬN .71 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Hàng năm, giới vi nấm gây bệnh thực vật nhƣ đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng… gây tổn thất nặng nề cho mùa màng, chúng chiếm tới 83% số bệnh trồng [15] Theo thống kê Tổ chức Nông Lƣơng Liên hiệp Quốc (FAO), thiệt hại nông nghiệp bệnh vi nấm lên tới 11,6% tổng sản lƣợng nơng nghiệp giới [46].Trong đó, việc sử dụng thuốc hóa học bảo vệ thực vật từ lâu gây ảnh hƣởng nghiêm trọng tới sức khỏe ngƣời, làm cân sinh thái gây nhiễm mơi trƣờng Chính vậy, việc sử dụng loại VSV đối kháng, chất sinh học diệt khuẩn vào vùng sinh thái khác trồng đích mà nhà khoa học hƣớng đến, xạ khuẩn sinh kháng sinh đối tƣợng trung tâm tìm kiếm [22] Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ (Prokaryote) với số lƣợng loài lớn phân bố nhiều vùng sinh thái khác Chúng ngày đƣợc biết đến rộng rãi với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá trị sử dụng cao nhƣ CKS, chất chống ung thƣ, chất kích thích sinh trƣởng nhiều hợp chất y dƣợc khác Thêm vào đó, XK cịn khả sinh enzyme ngoại bào nên đƣợc sử dụng rộng rãi làm chế phẩm sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng công nghệ xử lý rác thải [9], [18] Thái Nguyên tỉnh giàu tiềm nơng, lâm nghiệp nên có khu hệ VSV phong phú, số có khơng lồi XK sinh CKS Mặt khác, Thái Ngun lại nằm vùng sinh khống, có nhiều loại hình khống sản phân bố tập trung Điển hình khu vực núi Pháo thuộc xã Hà Thƣợng, huyện Đại Từ khu vực thị trấn Trại Cau thuộc huyện Đồng Hỷ, nơi diễn hoạt động khai thác khoáng sản mạnh mẽ Các hoạt động khai thác khống sản có tác động đáng kể đến mơi trƣờng đất, nƣớc qua đó, ảnh hƣởng đến hệ VSV Trên thực tế có nghiên cứu ảnh hƣởng hoạt động khai khoáng tới phát triển đa dạng hệ động, thực vật nhƣng lại chƣa có Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nghiên cứu ảnh hƣởng hoạt động tới phân bố hoạt tính sinh học đến hệ VSV đất khu vực Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đặt nhƣ trên, nhƣ để góp phần khai thác nguồn VSV vô phong phú Thái Nguyên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng sinh học số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces phân lập Thái Nguyên định hướng ứng dụng” Mục tiêu nghiên cứu - Khảo sát phân bố, đặc điểm hình thái XK mẫu đất thu địa điểm nghiên cứu - Nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng XK phân lập đƣợc để từ tuyển chọn số chủng có nhiều triển vọng ứng dụng thực tế, đặc biệt công tác bảo vệ thực vật môi trƣờng Nội dung nghiên cứu - Lấy mẫu, phân lập khiết XK từ mẫu đất - Kiểm tra HTKS chủng phân lập đƣợc với VSV kiểm định để tuyển chọn chủng có HTKS cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, ni cấy, sinh lý – sinh hóa phân loại số chủng XK có hoạt tính kháng nấm đƣợc tuyển chọn - Nghiên cứu khả sinh tổng hợp CKS chủng XK lựa chọn - Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào nghiên cứu tuyển chọn số chủng có hoạt tính enzyme cao, có nhiều triển vọng ứng dụng thực tiễn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẠI CƢƠNG VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố xạ khuẩn tự nhiên Theo hệ thống phân loại nay, XK thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn G (+) XK), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) siêu giới nhân sơ (Prokaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi khoảng 1.000 lồi Trong có 478 lồi thuộc chi Streptomyces 500 lồi thuộc chi cịn lại đƣợc xếp vào nhóm XK [58], [5] Tên xạ khuẩn – Actinomycetes – bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) “mykes” (nấm) ban đầu XK đƣợc coi vi nấm chúng sinh trƣởng giống với nấm Tuy nhiên, đến nay, XK đƣợc chứng minh thuộc nhóm vi khuẩn G(+), có tỷ lệ G+C cao (>55%) DNA [60] Xạ khuẩn nhóm VSV đa dạng đa số sinh trƣởng hiếu khí, hoại sinh phân bố rộng rãi đất, nƣớc, khơng khí, xác thực vật Nhƣng chủ yếu XK phân bố nhiều đất Số lƣợng XK đất không phụ thuộc vào thành phần, tính chất đất mà cịn phụ thuộc vào độ ẩm, mức độ canh tác khả che phủ thảm thực vật Xạ khuẩn phân bố nhiều lớp đất đất tơi, xốp, có độ ẩm thích hợp, giàu chất hữu chất khống Số lƣợng XK đạt tới 9.800.000 – 80.000.000 CFU gam đất [33] Sự phân bố XK đất phụ thuộc nhiều vào pH đất Xạ khuẩn phân bố nhiều loại đất trung tính kiềm yếu axit yếu, có pH khoảng 6,8 – 7,5 Trong lớp đất kiềm hay axit gặp XK gặp lớp đất có độ kiềm mạnh Nhìn chung, nhiệt độ ơn hịa 25 - 30ºC pH trung tính điều kiện tối ƣu cho XK phát triển Mặc dù vậy, nhiều loài XK đƣợc phân lập mơi trƣờng khắc nghiệt ví dụ nhƣ lồi Arthrobacter ardleyensis ƣa lạnh đƣợc phân lập từ trầm tích hồ Nam cực sống nhiệt độ 0ºC [27] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn loài Nocardiopis alkaliphila đƣợc phân lập từ đất sa mạc Ai Cập sống pH 9,5 - 10 [32] Xạ khuẩn nhóm VSV đóng vai trị quan trọng tự nhiên Chúng tham gia tích cực vào q trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu phức tạp đất mà nhiều VSV khác không hấp thu đƣợc Các XK chi Streptomyces đặc biệt nhiều đất nơi chúng phân hủy hoại sinh nhiều hợp chất hữu enzyme ngoại bào Chúng phân hủy sử dụng chất hữu khó phân hủy nhƣ axit humic đất [5] Nhiều chủng XK có khả hòa tan lignin cách sinh enzyme thủy phân cellulase, hemicellulase ngoại bào có ý nghĩa quan trọng công nghiệp bảo vệ môi trƣờng Thực tế, mùi mốc đặc trƣng nhiều loại đất liên quan đến sản sinh hợp chất hữu dễ bay có tên geosmin [57], [25], [44] 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái Đặc điểm bật XK có hệ khuẩn ty (mycelium) phát triển, phân nhánh vách ngăn Đƣờng kính khuẩn ty thay đổi khoảng từ 0,2 µm – µm, chiều dài đạt tới vài cm Kích thƣớc khối lƣợng khuẩn ty thƣờng không ổn định phụ thuộc vào loại điều kiện nuôi cấy Theo ISP, màu sắc KTKS chủng XK đƣợc chia thành nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, nhóm màu khơng xác định (X) [5], [40] Khi nuôi cấy môi trƣờng dịch thể, XK tạo thành dạng bông, già tạo thành kết tủa lắng xuống đáy, phần kết tủa bao gồm hạt liti, sản phẩm phân hủy màng nguyên sinh chất vách tế bào [19] Khi nuôi cấy môi trƣờng đặc khuẩn ty XK phát triển thành loại Một loại cắm sâu vào môi trƣờng gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất - substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dƣỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh - aerial mycelium) với chức chủ yếu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn sinh sản [41] Nhiều loại XK, KTKS phát triển theo hình phóng xạ, tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm Bản chất tƣợng chƣa đƣợc giải thích cách thỏa đáng [19] Sau thời gian phát triển, đỉnh KTKS xuất cuống sinh bào tử – quan sinh sản đặc trƣng XK Trên CSBT mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đơi mang tới 200 bào tử, nhƣng có mang bào tử hai bào tử CSBT đặc điểm quan trọng để phân loại XK Tuy nhiên nhiều trƣờng hợp, đặc điểm không đƣợc ổn định mà thay đổi theo mơi trƣờng ni cấy Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thƣờng có hình trụ, hình ovan, hình cầu, hình que với kích thc trung bỡnh khong 0,7 ữ 0,9 ì 0,7 ữ 1,9 µm Bề mặt bào tử XK nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like Nhìn chung, lồi, hình dạng bào tử XK tƣơng đối ổn định, xem đặc điểm quan trọng để phân loại XK [47] Hình thái khuẩn lạc XK khác nhau, kích thƣớc hình dạng chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trƣờng điều kiện nuôi Khuẩn lạc thƣờng có đƣờng kính 0,5 ÷ mm, nhƣng có khuẩn lạc có đƣờng kính đạt tới cm lớn Khuẩn lạc XK thƣờng rắn chắc, không trơn ƣớt hay suốt nhƣ vi khuẩn hay nấm men mà thƣờng có dạng thơ ráp, xù xì, có dạng vơi với nhiều màu sắc khác có nếp tỏa theo hình phóng xạ 1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa XK thuộc nhóm sinh vật dị dƣỡng, chúng sử dụng đƣờng, rƣợu, axit hữu cơ, lipit, protein nhiều hợp chất hữu khác để làm nguồn cacbon, sử dụng muối nitrat, muối amôn, urê, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả hấp thụ chất không giống loài hay chủng khác Phần lớn XK nhóm VSV hiếu khí, ƣa ấm, số ƣa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng 25 - 300C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ƣu cho sinh tổng hợp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn HT10.6 + 10,20 ± 0,10 12,20 ± 0,30 HT12.7 12,50 ± 0,67 16,17 ± 0,10 16,22 ± 0,30 HT12.5 9,34 ± 0,67 + + HT17.15 + 8,00 ± 0,10 12,20 ± 0,7 HT18.8 + + + Chú thích: +: Hoạt tính yếu (≤4 mm) 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [ơ Hình 3.12 Hoạt tính enzyme số chủng xạ khuẩn lựa chọn 1: HT17.15 2: HT12.7 3: HT12.5 4: HT10.6 5: HT18.8 Chủng HT12.7 có hoạt tính enzyme mạnh nhất, đặc biệt hoạt tính cenlulase protease, chủng TC 16.4 TC 12.10, chủng lại hoạt tính enzyme biểu Căn từ kết trên, lựa chọn chủng HT12.7 để tiếp tục nghiên cứu khả chịu nhiệt enzyme 3.5.2 Khả chịu nhiệt enzyme Các enzyme ngoại bào đƣợc ứng dụng nhiều công tác bảo vệ môi trƣờng để xử lý rác thải hữu công nghệ chế biến thực phẩm Chính vậy, khả chịu nhiệt enzyme đặc điểm cần phải đƣợc nghiên cứu Để xác định khả chịu nhiệt enzyme từ chủng HT12.7, tiến hành nuôi lắc chủng XK môi trƣờng dịch thể để thu dịch enzyme thô Tiến hành xử lý dịch enzyme thô mức nhiệt độ: 400C; 500C; 600C; 700C 800C thời gian 20, 40 60 phút Kết đƣợc trình bày bảng 3.21 Kết cho thấy, hoạt tính enzyme chủng HT12.7 tƣơng đối bền vững với nhiệt độ, đặc biệt hoạt tính loại enzyme tƣơng đối ổn định mức nhiệt độ 400C 500C Đồng thời hoạt tính enzyme có thay đổi tăng dần thời gian xử lý mức nhiệt độ Hoạt tính giảm nhanh mức nhiệt độ 600C, 700C 800C Các enzyme cellulase protease có khả chịu nhiệt tốt hơn, 800C hoạt tính enzyme khơng bị mất, đó, với enzyme amylase, hoạt tính enzyme hẳn 700C 800C (hình 3.13) 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 3.21 Khả bền nhiệt dịch enzyme chủng HT12.7 Thời gian (phút) 20 40 60 Hoạt tính enzyme (D - d, mm ) Enzyme 400C 500C 600C 700C 800C Amylase 17,1±0,2 16,8±0,2 11,1±0,1 - - Cellulase 22,1±0,1 21,5±0,7 11,2±0,1 9,9±0,1 9,8±0,1 Protease 24,8±0,1 23,8±0,1 19,8±0,2 11,2±0,2 9,1±0,1 Amylase 16,9±0,2 16,8±0,1 5,3±0,5 - - Cellulase 20,2±0,6 20,1±0,7 11,0±0,1 6,0±0,1 - Protease 24,1±0,5 22,9±0,1 15,8±0,3 8,4±0,4 6,1±0,1 Amylase 15,9±0,3 15,8±0,2 3,9±0,1 - - Cellulase 18,9±0,1 17,9±0,1 10,0±0,1 6,1±0,1 4,9±0,1 Protease 23,9±0,1 22,9±0,1 13,1±0,1 11,1±0,1 6,1±0,1 Đối chứng: dịch enzyme chưa xử lý nhiệt độ Amylase: 17,2±0,1; Cellulase: 22,1±0,3; Protease: 25,0±0,5; - : Khơng có hoạt tính Hình 3.13 Hoạt tính enzyme sau xử lý với nhiệt độ thời gian 20 phút Nhƣ vậy, enzyme cellulase protease chủng HT12.7 giữ đƣợc hoạt tính nhiệt độ cao (800C) tƣơng đối bền nhiệt Nhìn chung, chúng 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn thuộc nhóm enzyme chịu nhiệt Đây đặc điểm có ý nghĩa quan trọng cơng nghệ tách chiết ứng dụng enzyme để xử lý mơi trƣờng Tuy nhiên, cần phải có nghiên cứu sâu nhằm nâng cao hoạt tính mà khơng thay đổi tính bền nhiệt enzyme để làm tăng giá trị thƣơng mại chúng 3.6 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CKS TRONG DỊCH NUÔI CẤY CHỦNG HT17.8 VÀ HT19.1 TỚI KHẢ NĂNG NẢY MẦM CỦA HẠT Một CKS muốn đƣợc sử dụng nông nghiệp, lâm nghiệp ngồi việc có HTKS chống tác nhân gây bệnh cịn phải đáp ứng số yêu cầu khác nhƣ không độc cây, khơng kìm hãm khả nảy mầm hạt khơng ảnh hƣởng đến q trình sinh trƣởng Để nghiên cứu ảnh hƣởng CKS đến khả nảy mầm hạt, ngâm loại hạt là: thóc, đỗ xanh dƣa leo dịch nuôi cấy chủng XK độ pha loãng 1%, 10%, 50% 100% Sau ngày ngâm hạt, kết cho thấy dịch nuôi cấy chủng HT17.8 HT19.1 có ảnh hƣởng rõ rệt tới nảy mầm loại hạt thí nghiệm (hình 3.13, 3.14 3.15) 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.14 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng HT17.8 lên khả nảy mầm hạt Kết hình 3.14 cho thấy nhìn chung dịch ni cấy chủng HT17.8 có ảnh hƣởng tới khả nảy mầm hạt Cụ thể, nồng độ dịch nuôi cấy 100% gây ức chế khả nảy mầm hạt, đặc biệt thóc dƣa leo, khả nảy mầm giảm 50% Ở nồng độ 1% 10% dịch nuôi có tác động khơng đáng kể đến nảy mầm hạt, riêng dƣa leo, nồng độ 10% dịch ni có tác dụng kích thích nảy mầm hạt Kết bổ sung vào kết nghiên cứu số tác giả dịch nuôi cấy số chủng xạ khuẩn có khả kích thích nảy mầm số loại hạt [10], [15] Hình 3.15 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng HT19.1 lên khả nảy mầm hạt 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.16 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng HT19.1 lên khả nảy mầm hạt dƣa leo Kết thử nghiệm ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng HT19.1 đến khả nảy mầm hạt trình bày hình 3.15 3.16 cho thấy: Khi ngâm hạt với dịch ni cấy khơng pha lỗng (nồng độ 100%) khả nảy mầm hạt so với đối chứng nƣớc cất, chí với dƣa leo nồng độ 100% tỷ lệ nảy mầm giảm 50% Dịch nuôi cấy nồng độ thấp khả nảy mầm hạt bị ức chế, nhiên không ức chế mạnh nhƣ nồng độ 100% Đặc biệt, với đỗ xanh, nồng độ 1%, 10% khả nảy mầm hạt cao so với đối chứng Nhƣ vậy, nồng độ dịch ni 1%, 10% có khả làm tăng tỷ lệ nảy mầm hạt đỗ xanh Đặc biệt, theo dõi thời gian nảy mầm hạt nồng độ pha lỗng khác nhau, chúng tơi nhận thấy: Mặc dù nồng độ pha lỗng dịch ni cấy khác hạt nảy mầm, nhiên thời gian nảy mầm độ dài mầm có khác đáng kể Ở nồng độ pha lỗng 1% 10% hạt thƣờng nảy mầm nhanh sau 24h chiều dài mầm cao đối chứng nƣớc cất, nồng độ pha lỗng 50% 100% phải sau 48 - 72h thí nghiệm quan sát đƣợc nảy mầm hạt mầm thƣờng ngắn Nhƣ vậy, nghiên cứu sơ cho thấy dịch nuôi cấy nồng độ 50% 100% gây ức chế khả nảy mầm hạt Tuy nhiên, nồng độ thấp (1% 10%) không ức chế mà cịn có tác dụng kích thích khả nảy mầm sinh trƣởng hầu hết loại hạt thí nghiệm Những nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng việc sử dụng CKS nồng độ khác ứng dụng thực tiễn theo mục đích đối tƣợng khác Tuy nhiên, nghiên cứu bƣớc đầu, cần phải có bƣớc khảo sát với CKS đƣợc 70 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn tinh khiết để có kết luận xác nồng độ CKS ảnh hƣởng tới nảy mầm hạt KẾT LUẬN Từ 40 mẫu đất thu từ loại đất khác thuộc tỉnh Thái Nguyên, phân lập đƣợc 162 chủng XK Số lƣợng XK phân bố loại đất dao động từ 1,7 ± 0,67 × 106 đến 12,07 ± 0,58 × 106 CFU/g đất Tỷ lệ chủng thuộc nhóm xám: 51,23%, nhóm trắng: 24,07%, nhóm xanh: 8,02%, nhóm hồng: 5,56%, nhóm tím: 2,47%, nhóm vàng: 1,23% Trong tổng số chủng có HTKS có: tỷ lệ kháng vi khuẩn VK G (+) 74,39%, kháng VK G (-) 45,12%, kháng nấm mốc 70,73% Từ tuyển chọn đƣợc chủng HT17.8 HT19.1 có HTKS cao Trên sở kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng XK nghiên cứu đƣợc định tên là: Streptomyces sp HT17.8 Streptomyces parvullus HT19.1 Đã xác định điều kiện lên men cho sinh tổng hợp CKS dung mơi thích hợp để tách chiết CKS chủng HT17.8 HT19.1: - Chủng HT17.8: môi trƣờng lên men thích hợp Gause 2, nguồn nitơ thích hợp pepton, sử dụng iso – butanol để tách chiết CKS từ sinh khối n – butanol để tách chiết CKS từ dịch ngoại bào cho hiệu cao - Chủng HT19.1: mơi trƣờng lên men thích hợp A4H, nguồn nitơ thích hợp cao nấm men 71 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đã khảo sát hoạt tính enzyme: amylase, cellulase protease chủng XK phân lập đƣợc tuyển chọn đƣợc chủng HT12.7 có hoạt tính enzyme cao bền nhiệt Đã bƣớc đầu nghiên cứu ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn HT17.8 HT19.1 tới nảy mầm hạt Ở nồng độ dịch ni cấy 1% 10% có tác dụng kích thích nảy mầm hạt KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu điều kiện lên men tách chiết CKS từ chủng HT17.8 HT19.1 Nghiên cứu nâng cao HTKS chủng HT17.8 HT19.1 Tìm hiểu khả ứng dụng CKS từ chủng HT17.8 HT19.1 chè 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh, Phạm Văn Ty, Lê Gia Hy, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Thanh Huyền (2003), “Tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus TC-54 có hoạt tính cao chống nấm gây bệnh”, Tạp chí Sinh học, 25 (2A), 85 - 91 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB KH&KT, Hà Nội Vi Thị Đoan Chính (2011), Tuyển chọn nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng với số chủng vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện, Báo cáo tổng kết đề tài khoa học công nghệ cấp Bộ, Mã số B2009 - TN07 - 02 Vi Thị Đoan Chính, Trịnh Ngọc Hồng, Trịnh Đình Khá, Vũ Thị Lan (2007), “Nghiên cứu phân bố xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập từ đất Thái Nguyên”, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc NCCB khoa học sống, 433 – 437 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học (tái lần thứ 6), NXB Giáo dục Nguyễn Lân Dũng (dịch) (1993), Thực tập vi sinh vật học, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội Lê Đức, Nguyễn Quốc Việt (2007), “Tác động hoạt động khai thác khoáng sản Đại Từ, Đồng Hỷ, Thái Nguyên đến môi trƣờng khu vực”, Hội tháo Khoa học Quốc gia “Những vấn đề môi trường phát triển bền vững vùng đông bắc”, 153 – 159 Lý Thị Thanh Hà cs (2007), “Nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng xạ khuẩn phân lập Trùng Khánh – Cao Bằng”, Hội thảo Khoa học Quốc gia “Những vấn đề môi trường phát triển bền vững vùng đông bắc, 692 – 695 73 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội 10 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội 11 Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Thanh Huyền, Đinh Xuân Tuấn, Kiều Hữu Ảnh (2004), “Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật chủng xạ khuẩn T-41 D-42”, Tạp chí Di truyền ứng dụng, 4, 50 - 56 12 Ngơ Bích Hảo (2004), “Tình hình nhiễm nấm Aspergillus spp hạt giống số trồng ảnh hƣởng nấm gây bệnh đến nảy mầm sức sống con”, Tạp chí KHKT Nơng nghiệp, 2(1) 13 Nguyễn Bá Hiên, Hồng Hải, Nguyễn Xn Thành (2006), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo Dục 14 Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh ứng dụng, NXB Giáo dục 15 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Tiến sĩ, Hà Nội 16 Biền Văn Minh (2002), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ, Hà Nội 17 Lƣơng Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, 47 - 49 18 Nguyễn Huỳnh Minh Quyên (2011), Điều tra, nghiên cứu số hoạt chất có khả kháng vi sinh vật kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn, Báo cáo kết thực đề tài KHCN đặc biệt cấp Đại học Quốc gia, Mã số QG 09 48 19 Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Thị Hiền (2003), Giáo trình vi sinh vật học nơng nghiệp, NXB Đại học Sƣ phạm 74 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 20 Phạm Hồng Ngọc Thùy (2008), “Bƣớc đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces griseus”, Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản, 21 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), “Tƣơng lai ứng dụng Enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 23, 75 - 85 22 Nguyễn Văn Tuất, Lê Văn Thuyết (2001), Sản xuất, chế biến sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc sinh học, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 23 Trần Thị Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB ĐHQG Hà Nội 24 Ngô Vĩnh Viễn, Hà Minh Trung, Mai Thị Liên, (1998), “Một số kết nghiên cứu bệnh đạo ôn (1991 - 1995)”, Nghiên cứu bệnh hại, 81 – 89 Tiếng Anh 25 Annaliesa S A., Elizabeth M H (2001), “The taxonomy of Streptomyces and related gener”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 797 - 814 26 Bryden D., Fahy P., Jone L C Moffett., Seberry., Taylor., Howard (2005), Antibiotics in Agronomy and Horticulture, National Health and Medical Research Council 27 Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F (2008), “Arthrobacter ardleyensis sp nov isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment”, Arch Microbiol, 183, 301- 305 28 Demain A.L (1974), “How antibiotic producing microorganisms avoid suicide, Annuals of the New York Academy of sciences”, 601 – 602 29 FAO yearbook – Production (1994), 7, 43 75 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 Gause G F., Preobrazhenskaya T P., Sveshnikova M A., Terekhova L P., Maximova T S (1983), “A guide for the determination of actinomycetes”, Genera Streptomyces, Streptoverticillium, and Chaina, USA 31 Haijun D., Taifo M., Ingo T., Sungsook L., Heinz G (2001), “Biosynthesis of the Validamycin A by Streptomyces hygroscopicus var limoneus”, J Am Chem Soc., 123, 2733 - 2742 32 Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang C.L (2004), “Nocardiopsis alkaliphila sp nov., a novel alkaliphilic actinomycete isolated from desert soil in Egypt”, Int J Syst Evol Microbiol, 54, 247 - 252 33 Jeffrey L S H (2008), “Isolation, characterization and identification of actinomycetes from agriculture soils at Semongok, Sarawak”, African Journal of Biotechnology, (20), 3697 - 3702 34 Jesus G M., Silvia G A., Ana I A , Francisco R V (1999), “Use of the 16S–23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity”, Unidad de Microbiological, Centro de Biologia Molecular y Celular, 18 , Spain 35 Kataoka M., Ueda K., Kudo T., Seki T., Yoshida T (1997), “Application of the variable region in 16S rRNA to create an index for rapid species identification in the genus Streptomyces”, FEMS Microbiol Lett, 151, 249 – 255 36 Keswanit J., Whitman W B (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridzation in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, 667 - 678 37 Ludwig W., Schleifer K H (1994), “Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis”, FEMS Microbiol Rev., 15, 155 - 173 38 Lima M.B., De Azeredo L.A., Coelho R.R., Freire D.M (2006), “Thermophilic protease production by Streptomyces sp 594 in submerged and solid-state fermentations using feather meal”, J Appl Microbiol, 100(4), 641 - 76 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 39 Marinelli F (2009), “Antibiotics and Streptomyces: The future of antibiotic discovery”, Microbiol Today, 36, 20 - 21 40 Miyadoh S (2001), “Identification manual of Actinomycetes”, Business Center for Academic Scieties Japan, 65 - 66 41 Nonomura H (1974), “Key for classification and identification of 458 species of Streptomyces included in ISP”, J Ferment Technol, 52 (2), 78 - 92 42 Paul J., Tracy M., Philip W., Fenical W (2005), “Marine actinomycete diversity and natural product discovery”, Antonie van Leeuwenhoek, 87 (1), 43 - 48 43 Patricia S M, Virginia O S, George W S, Alan L J (2002), “Antibiotic use in plant agriculture”, Ann Rev Phytopathol, 40, 443 - 465 44 Shang S Y., Jan Y W (1999), “Protease and amylase production of Streptomyces rimosus in submerged and solid state cultivations”, Bot Bull Acad Sin, (40), 259 - 265 45 Schloss P.D., Handelsman J (2006), “Toward a census of Bacteria in soil”, PloS Comp Biol, 2(7) 46 Shen V Ch (1992), Development and application of agricultural antibiotic Jingangmicin in China, FAO regional consultation on biological control of plant diseases, Hangzhau, China 47 Shirling E.B., Gottlieb D (1996), “Methods for characterization of streptomyces species”, International Journal of Systematic Bacteriology, 16 (3) 48 Strobel G., Daisy B (2003), “Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products microbial”, Microbiol Mol Biol Rev., 67, 491-502 49 Takeuchi T., Sawada H., Tanaka F., Matsuda I (1996), “Phylogenetic analysis of Streptomyces spp causing Potato scab base on 16S rRNA sequences”, International journal of systematic bacteriology, 476-479 50 Thomas T., Michael J., Hitchcock M , Edward K (1980), “Distinct kynureninase and hydroxykynureninase enzymes in an actinomycin-producing strain of 77 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Streptomyces parvullus”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology, 612 (1), 97 – 106 51 Vachkova R., Kappas A., Tyagunenko E., Markaki M., Voutsinas G (1998), “Spicific recombinogenic activity of a new polyene antibiotic”, National Library of medicine, 130 – 135 52 Vasanthabharathi V., Lakshminarayana R., Jayalakshmi S (2011), “Melanin production from manine Streptomyces”, African Journal of Biotechnology, 10(54), 11224 - 11234 53 Waksman S A (1961), “The Actinomycetes: Classification, identification and descriptions of genera and species”, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 2, USA 54 Waksman S.A., Gregory F.J (1954), “Actinomycin-II Classification of organisms producing different forms of actinomycin”, Antibiotics and Chemotherapy, 4, 1050 - 1056 55 Williams S T., Sharpe M E., Holt J G (1989), “Bergey’s manual of systematic bacteriology”, Williams & Wilkins, Baltimore, USA 56 Yamaguchi (1998), “Natural product – derived fungicides as exemplified by the antibiotic”, Fungicidal Activity, 57 – 79 57 Ziad J., Ahlam D., Qotaiba A., Ismail S (2008), “Influence of culture conditions on cellulase production by Streptomyces sp J2”, Jordan Journal of Biological Sciences, (4), 141 – 146 Các trang Web 58 http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria 59 http://www.bacterio.cict.fr/s/streptomycesc.html 60 http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/phanloaixakhuan01.htm 78 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Đỗ Thị Tuyến, Lƣơng Thị Hƣơng Giang, Đào Thị Hằng, Nguyễn Thị Hƣơng Liên, Vi Thị Đoan Chính (2011), Hoạt tính kháng sinh xạ khuẩn đất khu vực có hoạt động khai thác khống sản, Tạp chí Khoa học Công nghệ - ĐH Thái Nguyên, 86(10), 153 – 158 79 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn