Sàng lọc một số vị thuốc bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi b

Trang 1 BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO SÀNG LỌC MỘT SĨ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIÊU CHẾ THUỐC ĐIÊU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VIB Trang 2 BỘ Y TẾ BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE

Trang 1

BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO

SÀNG LỌC MỘT SĨ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIÊU CHẾ THUỐC ĐIÊU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VIB

Trang 2

BỘ Y TẾ

BAO CAO KET QUA NGHIEN CUU DE TAI CAP BO

SÀNG LỌC MỘT SĨ VỊ THUỐC, BÀI THUỐC NHẰM ĐIÊU CHẾ THUỐC ĐIÊU TRỊ VIÊM GAN MẠN DO SIÊU VIB

Chủ nhiệm để tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

Cơ quan chủ trì để tài: Viện Dược Liệu Cơ quan quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2006 đến tháng 12/2008 Tổng kinh phí thực hiện để tài: 320 triệu đồng

Trong đĩ, kinh phí sự nghiệp khoa học: 320 triệ

đẳng

Trang 3

BẢO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ

1 Tên đề tài: Sàng lọc mật số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan

man do siêu vỉ B

2 Chủ nhiệm để tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

3 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu

4 Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế

5 Danh sách những người thực hiện chính:

1 PGS.TS Bùi Thị Bằng Viện Dược liệu (VDL)

2 PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương _ Trung tâm nghiên cứu Sâm và Dược liệu TP Hồ chí Minh (TT SDL TP HCM) 3 DS Nguyễn Kim Phượng VDL

Trang 4

AASLD ALT AST CCly EtOAc GOT GPT HBsAg MDA NCKH SKLCA VDL VGB VGMHĐ WHO YHCT Những chữ viết tắt Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Mỹ Alanine aminotransaminase Aspartate aminotransaminase Carbon tetraclorid Ethyl acetat Cục Dược và Thực phẩm Hoa Kỳ

Glutamic oxaloacetate transaminase Glutamic pyruvie transaminase

Trang 5

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ 'Về tình hình thực hiện và những đĩng gĩp mới của đề tài KH-CN cấp Bộ 1.Tên đề tài: Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn đo siêu vỉ B Mã số: 2 Thuộc chương trình: NCKH cấp Bộ Y tế 3 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Bùi Thị Bằng

4 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu

5 Thời gian thực hiện: Bắt đầu từ tháng 7 năm 2006 Kết thúc tháng 12 năm 2008 6 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 320 triệu đồng

Trong đĩ, kinh phí từ NSNN: 320 triệu đồng 7 Tình hình thực hiện để tài so với đề cương:

7.1 Mức độ hồn thành khối lượng cơng việc: Đã hồn thành đầy đủ khối lượng cơng

việc theo để cương nghiên cứu, cụ thể đã hồn thành các nội dung nghiên cứu sau:

1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây tổn thương gan bằng

CC, các dịch chiết từ 10 cây thuốc và 2 bài thuốc Chọn 5 sản phẩm cĩ tác dung

tốt nhất

2 Nghiên cứu thành phần hĩa học của 5

ịch chiết Xác định hàm lượng các nhĩm chất cĩ tác dụng bảo vệ gan Chọn 3 sản phẩm cĩ hiệu suất chiết cao, nguyên liệu

dễ khai thác và dễ trồng để tiếp tục nghiên cứu so sánh tác dụng được lý

3 Thử các tác dụng lý sau của 3 chế phẩm chọn được: chống oxy hố, ức chế xơ gan,

trên men gan GPT, GOT, bilirubin; tác dụng chống viêm mạn; tác dụng lợi mật Chọn 1 sản phẩm cĩ tác dụng tốt nhất để nghiên cứu độc tính:

i Thử độc tính cấp

ii Độc tính bán trường diễn

4 Nghiên cứu quy trình chiết xuất sản phẩm quy mơ pilot

3 Nghiên cứu đạng bào chế và quy trình sản xuất thuốc trị viêm gan mạn do siêu vi

Trang 6

6 Xây dựng tiêu chuẩn được liệu, bán sản phẩm và thuốc mới

7 Bào chế 5.000 viên bao phim thuốc mới

8 Cơng bố kết quả nghiên cứu trên các tạp chí khoa học và Hội nghị khoa học

Đối chiếu với các nội dung nghiên cứu đã đăng ký và đã được Bộ phê duyệt ở trang 7 của

bản TM đề tài thì cĩ 1 thay đổi: đĩ là tiểu mục “thử độc tính sinh sản” (thuộc nội dung

nghiên cứu 5) đã được Vụ KH-ĐT Bộ Y tế cho phép khơng thực hiện trong buổi họp

thấm định nội dung và kinh phí thực hiện nhưng khi sửa chữa bản thuyết mình, chủ nhiệm để tài đã sơ xuất khơng xố tiểu mục “thử độc tính sinh sản” trong phần “Nội dung nghiên cứu” 7.2 Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHƠM Các sản phẩm của đề tài:

3) Danh sách các vị thuốc vù bài thuốc cĩ tác đựng bảo vệ gan:

Kết quả thử tác dụng bảo vệ gan của các dịch chiết n-hexan, cồn 80% và nước của

10 vị thuốc và 2 bài thuốc trên chuột nhất trắng bị gây độc gan bằng carbon tetraclorid đã cho phép chọn được: e_ Bảy vị thuốc cĩ tác dụng bảo vệ gan sau: - Lá ban trịn -_ Lá muỗng trâu -_ Lá vọng cách = Qué dita gai - Qué khing khéng, + Qué ngé vi -_ Rễ cốt khí

Các vị thuốc này làm giảm cĩ ý nghĩa thống kê hoạt tính của enzym GPT tir 26,53

đến 73,58% và giảm từ 31,22 đến 65,06% ham lugng bilirubin bi gây tăng bởi CCl,

(P<0,05)

e_ Hai bài thuốc cĩ tác dụng bảo vệ gan:

Bài số 1: Hạ khơ thảo (30 g), ý đĩ (20 g), gừng khơ Œ lát), dành đành (12 g), Hồi sơn (20

Trang 7

Bài số 2: Hạ khơ thảo (40 g); thể phục linh (12 g), nghệ vàng (10 g), mã đề (40 g), rau

mé (40 g)

Hai bài thuốc cĩ tác dụng bảo vệ gan tương đương với silymarin (liều 100mg/Ekg thé trọng chuột), làm giảm cĩ ý nghĩa thống kê hoạt tính của enzym GPT từ 46,08 đến

37,54% và giảm từ 46,63 đến 44,98% hàm lượng bilirubin bị gây tăng bởi CCl, (P<0,03)

3) Báo cáo kết quả nghiên cứu tác đụng được {ý và thành phần hố học của vị thuốc điều trị

1m gan mgn do visit VGB

2.1- Nghiên cứu tác dụng dược lý: Kết quả nghiên cứu so sánh tác dụng chống viêm

gan mạn, tác dụng lợi mật, tác dụng chống viêm mạn của 3 chế phẩm chọn được là

flavonoid ban tron, cao nước lá muỗng trâu và bài thuốc số 2 đã cho phép chọn chế phẩm flavonoid chiết xuất từ lá cây ban trịn (Hypericum patulum Thunb ex Murray) lam thuốc

điều trị viêm gan mạn do siêu vi B - được gọi là “Cao ban trịn” (cịn gọi là bột Hypatin)

Kết quả thử các tác dụng được lý của bột Hypatin như sau:

-Tác dụng bảo vệ gan: Với liều thừ 250mg/kg thể trọng chuột nhắt trắng, bột Hypatin

đã làm giảm cĩ ý nghĩa thống kê 36,50% hoạt độ của enzym GPT và 53,38% hàm lượng bilirubin trong huyết thanh chuột bị gây tăng bởi CCl,,

-Tác dụng ức chế xơ gan: Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg đã làm giảm hàm lượng colagen trong gan chuột cống trắng bị gây viêm gan mạn và gây tăng

eolagen bằng CCl,: 10,76% (P<0.05) và 15,24% (P<0,001) tương ứng

-Tác dụng chẳng oxy hố: Bột Hypatin với các liều thử 125mg/kg và 250mg/kg đã làm giảm hàm lượng MDA trong gan chuột cống trắng bị gây ting peroxy hod lipid bằng

CCl¿: 21,38% và 13,65% tương ứng

-Tác dụng trên tỗổ chức tế bảo gan: Bột Hypatin đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan trên chuột cống trắng bị gây xơ gan bằng CC, tuy khơng giúp hồi phục hồn tồn nhưng đã

cải thiện rõ rệt các tốn thương gan Đặc biệt đã hạn chế mức độ xơ hố gan rất nhiều so

với lơ chuột bệnh lý khơng được điều trị Đây là kết quả mới đáng ghi nhận đối với cây ban trịn và chế phẩm flavonoid tồn phan

Trang 8

-Tác dụng chống viêm mạn: Bật Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm giảm cĩ ý nghĩa

thống kê 23,5% trọng lượng ễ

iêm do amian gây ra trên chuột cống trắng

-Tée dung lợi một: Bột Hypatin với liều thử 250mg/kg đã làm tăng tiết mật 29,29%

(P<0,05) so với lơ chứng trên chuột nhất trắng trưởng thành (mơ hình Rudi)

Với các tác dụng được lý thử trên chuột bị gây viêm gan cấp va man tinh bang CCly

đã liệt kê ở trên, chế phẩm flavonoid ban trịn đáp các yêu cầu đối với một thuốc điều trị viêm gan mạn do virút VGB Vì vay flavonoid được chọn để tiếp tục nghiên cứu trên độc

tính cấp và độc tính bán trường diễn

2.2 Nghiên cúu về hố học của chế phẩm flavonoid:

-Đã xác định hàm lượng flavonoid tồn phần trong lá ban trịn thu hái tại Sapa (Lào cai): Đạt trung bình 5,92%

-Đã nghiên cứu chiết tách flavonoid tồn phần và các chất tỉnh khiết astilbin,

quercitrin từ lá ban trịn phục vụ cho thử tác dụng được lý

-Đã phân tích thành phần hố học của flavonoid bằng SKLCA: Kết quả cho thấy trong chế phẩm cĩ ít nhất 11 pie tương ứng với flavonoid Hàm lượng (%) astilbin và

quereitrin trong chế phẩm flavonoid đạt từ 8,76-10,25% và từ 8,70 đến 9,70% tương

ứng

3) Báo cáo kết quả thủ độc tính của flavonoil ban trịn:

*Đậo tính cấp: Kết quả thử độc tính cấp cho thấy liều khơng cĩ chuột chết LDạ = 5000mg bột flavonoid gấp 40 lần liều cĩ tác dụng (125mg/kg) Điều này chứng tỏ bột Flavonoid

cĩ độ an tồn cao khi sử dụng

*Dée tinh bán trường diễn: Cho thẻ uống flavonoid với liều 5000mg/kg thé trong thỏ

trong 30 ngày liên tục đã khơng gây ảnh hưởng đến chức năng gan; thận và chức năng tạo

máu của thỏ thí nghiệm Kết quả nghiên cứu mơ học gan thận cho thấy hình ảnh tế bào gan và thận của thỏ khơng bị tổn thương sau khi uống flavonoid 5000mg/kg x 30 ngày, khơng thấy sự khác biệt khi so sánh với hình ảnh tế bào gan và thận của thỏ lơ đối chứng Như vậy cĩ thể kết luận chế phẩm flavonoid ban trịn khơng gây độc đối với cấu trúc tế

bào gan và thận

Trang 9

4) Quy trình chiết xuất flavonoll tồn phần từ lá ban trịn quy mơ pÏưt: - Dung mơi chiết: nước

- Tỷ lệ nước - được liệu: vừa đủ

- Nhiệt độ chiết: 90-951 - Thời gian chiết: 1h x 3 lần

- Cơ dịch chiết nước đến cao lỏng: tỷ lệ thích hợp

- Chiết flavonoid từ cao lỏng bằng EtOAc: Tỷ lệ thích hợp - Cơ dịch chiết EtOAc dưới áp suất giảm

- Sấy cao EtOAc ở 500C

Đã thực hiện chiết xuất trên dây truyền chiết xuất đa năng của hãng Toumner (Pháp)

với mẻ chiết 10kg lá khơ x 3 mẻ Kết quả: đạt hiệu suất chiết flavonoid trung bình 5,69% so với được liệu khơ (tương đương hiệu suất 85,43% so với khối lượng favonoid cĩ trong

được liệu) Hàm lượng flavonoid tồn phần trong chế phẩm tính theo astilbin đạt trung

bình 40,88% (xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại)

Kết quả định lượng bằng phương pháp SKLCA cho thấy quy trình cho sản phẩm cĩ hàm lượng astilbin và quereitrin trong chế phẩm flavonoid tương đối ổn định đạt từ 17,46

đến 19,95%,

5) Nghiên cứu phương pháp bào chế vù quy trình sẵn xuất thuốc mơi:

Thuốc mới bào chế từ chế phẩm flavonoid ban trịn được đặt tên là Hypatin (xuất

phát từ tên khoa học của edy thuée Hypericum patulum) Đã khảo sát 5 cơng thức với các

thành phần tá được khác nhau, chọn được cơng thức 4 là cơng thức cho viên thuốc đạt các

yêu cầu của DĐVN II

Thuốc được nghiên cứu đưới dạng viên nén bao phim cĩ cơng thức sau: Cơng thức cho điều chế 1 vị

Cao ban trịn (Bột Hypatin) (Một trăm bẩy mươi miligam) 0,1700 g

Magiesi carbonat nhẹ (Ba mươi miligam) 0,0300 g

Avieel (Tám mươi miligam) 0,0800 g

Trang 10

Bét tale (Ba một phần năm miligam) 0,0032 g 6) Nghiên cứu tiêu chuẩn hố:

Đã nghiên cứu xây dựng 3 tiêu chuẩn:

- _ Tiêu chuẩn nguyên liệu - lá ban trịn 04TC1,-01-08

-_ Tiêu chuẩn bán thành phẩm - cao ban trịn (bột hypatin): 04TCI,-02-08 -_ Tiêu chuẩn thuốc - viên bao phim Hypatin: 04TCT,-03 -08

?) Các bài báo:

1 Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hĩa học của các chất từ quả ngũ

vị từ (Sehisandra sphenamthera Rehder et Wils) thu hãi ở Kon Tum Tap chí Dược liệu số 3 + 4 năm 2007: 101-103

2 Anti hepatitis and cirthosis inhibitory effect of Hypericum patulum Thunb

ex Murray (bing tiéng Anh) Tap chí Dược liệu số 6/ 2007: 174-178

3 Quercitrin - flavon glyeosid chiết tách từ cây Ban tron (Hypericum patulun

Thunb ex Mutray) cĩ tác dụng bảo vệ gan tạp chí Dược học số 10 /2007: 40-41, 43, 48

4 Tham gia Hội nghị Quốc tế : “Anti -hepatifis and cithosis inhibitory effect of Hypericum patulum Thunb ex Murray” Book of Abstracts: Intemational Workshop on Herbal Medicinal plants and Traditional Herb Remedies, 20- 21 September 2007, Hanoi, Vietnam., page 47-48

38) Đã bào chế 5.000 vién bao phim dat yéu can DDVN HH

Ket India: Dé tai di hoan thinh cde nhiém vy nghién ctu

-Các sản phẩm khoa học cĩ chất lượng cao, đáp ứng yêu cầu khoa học của để tài cấp

Bộ

7.3 Về tiến độ thực hiện: Đề tài đã thực hiện các nội dung nghiên cứu theo tiến độ đã

dự hiến

Trang 11

8 Những đĩng gĩp mới của đề tài:

-Đã xác định tác dụng bảo vệ gan của các vị thuốc rễ cốt khí và quả khúng khéng và 2 bài thuốc nêu ở trên (số 1 và số 2)

-Đề tài đã thu được những kết quả mới về các tác dụng chống viêm gan mạn, ức chế

xơ gan, chống oxy hĩa, chống viêm mạn, lơi mật và độc tính của chế phẩm flavonoid

tồn phần chiết xuất từ lá ban trịn (đã liệt kê ở trên)

-Quy trình chiết xuất flavonoid từ lá ban trịn quy mơ pilot cũng là một đĩng gĩp mới của đề tài

-Thuốc điều

iêm gan mạn do siêu vi B Hypatin là một thuốc mới lần đầu tiên được

nghiên cứu từ cây ban trịn

-Kết quả nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan mạn, ức chế xơ gan, chống oxy hĩa, chống viêm mạn và lơi mật của lá muỗng trâu

Hà Nội, ngày 24 thing 12 năm 2008

Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS Bùi Thị Bằng

Trang 12

ĐẶT VẤN ĐÈ 1 Tính cấp thiết của đề tài:

Viêm gan siêu vỉ B (viêm gan B) là bệnh nhiễm trùng gan nặng do virút viêm gan B gây ra Bệnh viêm gan B (VGB) nằm trong danh mục 10 bệnh dịch gây tử vong cao

nhất trên thế giới Theo ước tính của Té chức Y tế thế giới (WHO) hiện cĩ khoảng 400

triệu người trên tồn cầu nhiễm virút viêm gan B, hơn nửa triệu người chết mỗi năm do

ung thư gan nguyên phát thì cĩ đến 80% là do VGB Viêm gan B man tính nếu khơng được điều trị cĩ thể dẫn đến suy gan, xơ gan, ung thư gan và tử vong Suy gan và ung thư

gan do VGB man tính làm chết nhiều người tại châu Á, từ 350.000-400.000 người/năm Tại VN các số liệu điều tra về dịch tế học cũng cho biết cĩ khoảng 15% dan số,

tương đương 12 triệu người đang bị nhiễm virút VGB, cao gấp 40 đến 50 lần số người nhiễm HTV Theo Hội Ung thư tồn cầu, Việt Nam đang đứng thứ 2 về ung thư gan và 90% căn bệnh nguy hiểm này do viêm gan B gây ra, 20,5% mắc phải ở người lớn và tỷ

lệ nam thường cao hơn 5 lần phụ nữ [simei.org]

Theo hướng dẫn mới của Hiệp hội Nghiên cứu bệnh gan Mỹ (AASLD) được cơng

bố tại hội nghị APASL 2007 ở châu A, mục tiêu cơ bản của điều trị VGB mạn là đạt được sự ức chế duy trì đối với sự sao chép của virút VGB và đẩy lùi bệnh gan Mục tiêu

tối hậu là ngăn chặn xơ gan, suy gan và ung thư gan

Thuốc uống điều trị VGB mạn tính cĩ 4 loại đã được cơ quan Dược và Thực phẩm

Hoa Kỳ (DA) cho sử dụng trong điều trị là Lamivudine, Adefovir, Entecavir va Telbivudine

Các thuốc tân được thường cĩ nhiều tác dụng phụ và giá thành đắt Vì vậy, các thuốc cĩ nguồn gốc thảo mộc đang được khuyến khích nghiên cứu, đặc biệt là các vị

thuốc Đơng dược đã được dùng theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa các bệnh về gan Số thuốc thảo mộc đưa vào sử dụng chưa nhiều nhưng bước đầu cho thấy cĩ triển vọng tốt

trong hễ trợ điều trị VGB mạn nĩi chung và VGB mạn hoạt động (V GMHĐ) nĩi riêng

Các thuốc thảo mộc thường cĩ tác dụng bảo vệ tế bào gan, giảm viêm gan, phục hồi

Trang 13

lên của virút VGB, tăng sản xuất kháng thể chống lại kháng nguyên HBsAg của virút

VGB Khi dùng phối hợp với các thuốc tân được, các thuốc thảo mộc cĩ tác dụng rút ngắn thời gian điều trị và giảm liều điều trị của thuốc tân được

Theo kinh nghiệm dân gian và kết quả nghiên cứu của một số cơng trình nghiên cứu khoa học (NCKR) gần đây cho thấy cĩ nhiều cây thuốc được đùng điều trị viêm gan

cĩ tác dụng tốt, như: Diệp hạ châu, ngũ vị, đứa gai, cam thảo dây, hạ khơ thảo nam,

khúng khéng, muỗng trâu, vọng cách, cốt khí, mã để, dành đành, nọc sởi, ban trịn,

trạch tả, nhĩ đơng, cải trời, cà gai leo, cúc gai [11, 5, 33, 56, 13, 23, 41, 57] Trong đĩ,

mã đề, chỉ tử, hạ khơ thảo nam đã được Bộ Y tế xếp vào Danh mục cây thuốc Nam điều

trị VGB

Ké thừa và phát virút triển những kinh nghiệm sử dụng thảo được để bào chế thuốc

điều trị VGB man, ching tơi đã được phép thực hiện đề tài: “Sàng lọc một số vị thuốc,

bài thuốc nhằm điều chế thuốc điều trị viêm gan mạn do siêu vi B” 2 Mục tiêu vù nội lưng nghiên cúm:

+ — Đề tài nhằm 2 mục tÊN:

1 Sàng lọc một số vị thuốc, bài thuốc cĩ tác dụng bảo vệ gan 2 Điều chế mộtloại thuốc điều trị viêm gan man đo siêu vị B «Nội đụng nghiên cúm: 1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây tổn thương gan bằng CCH các tốt nhất

Trang 14

So sánh các tác dụng lý sau đây của 3 sản phẩm chọn được: Tác dụng chống oxy

hố, ức chế xơ gan, giảm cnzym GPT, GOT; tác dụng chống viêm mạn và tác dụng lợi mật Chọn 1 sản phẩm cĩ tác dụng tốt nhất để nghiên cứu độc tính: Thử độc tính cấp i ii, Độc tính bán mạn

Nghiên cứu quy trình chiết xuất sản phẩm quy mơ pilot

Nghiên cứu dạng bào chế và quy trình sản xuất thuốc trị VGM đo siêu vi B

Trang 15

L TONG QUAN TAILIEU

1.1 Một số thơng tin chung về 10 cây thuốc -

ĩi tượng nghiên cứu của đề tài:

Cây ban trịn (họ Ban -Hyperaceae) moe rt phé bién & vùng thượng du miền Bắc và miền Trung nước ta [24] Nghiên cứu trước đây của chúng tơi (thuộc Để tài KC10-07)

cho thấy cao nước của lá ban trịn cĩ tác dụng bảo vệ gan, giảm enzym GPT, giảm

bilirubin trên mơ hình gây viêm gan cấp bing CCl, [13] Cao nước của lá ban trịn cịn cĩ

tác dụng giảm hàm lượng colagen và malonyl đialdehyd (MDA) trong gan chuột bị gây

viêm gan mạn bing CCL, [25, 26]

Vị phẫu lá ban trịn đã được nghiên cứu cĩ những đặc điểm sau:

- Gân lá: Gân phía trên hơi lõm, phía dưới lồi nhiều Biểu bì trên là một hàng tế bào hình

chữ nhật cĩ kích thước lớn hơn tế bào biểu bì đưới Mơ day nằm sát biểu bì, thường cĩ 2-

3 lớp tế bào cĩ thành rất dày Mơ mềm cấu tạo bởi các tế bào thành mỏng, hình đa giác, cĩ kích thước nhỏ hơn tế bào mơ dày Bĩ libe gỗ -lớn, hình gần như trịn, với phần libe rất phát triển ở phía đưới bĩ gã Gỗ cấu tạo bởi các mạch gỗ xếp thành hàng cĩ hình cung

-Phiến lá: Biểu bì trên là một hàng tế bào hình chữ nhật cĩ kích thước lớn, xếp đều đặn, tế bào biểu bì phía dưới cĩ kích thước nhỏ hơn Mơ dậu là một hàng tế bào hình chữ nhật

dài xếp vuơng gĩc với tế bào biểu bì trên Mơ mềm khuyết là những tế bào cĩ kích thước

nhỏ, thành mỏng [26]

Bật lá Ban trịn cĩ màu nâu sẫm, mùi thơm nhẹ, vị hơi chát Soi dưới kính hiển vỉ

thấy: Mảnh biểu bì phiến lá là những tế bào hình ngũ giác hoặc đa giác xếp đều đặn, màu

vàng nhạt hoặc lục nhạt Mảnh phiến lá cĩ tế bào mơ đậu hình chữ nhật hình que khá đài,

xếp đều đặn thành một hàng Mảnh mạch xoắn cĩ 3 đến 4 hàng xếp liền nhau với những

tế bào xếp đều đặn, màu vàng tươi Mảnh phiến lá màu lục xen vàng nhạt, mang tế bào lỗ khí hình trịn hoặc hạt đậu Mảnh biểu bì của cuống lá cĩ những tế bào màu lục hoặc vàng

sim xép thành những hàng đài [26]

Gần đây ở Án Độ đã nghiên cứu tác dụng của cao methanol từ lá ban trịn trên khả

năng tái tạo tế bào và làm lành vết thương trên chuột Cao methanol bào chế đưới dạng

Trang 16

chiết methanol của lá và thân cây kê so với nhĩm chứng Dịch chiết chloroform và ban trịn cĩ phổ kháng nắm khá rộng [58, 59] Dịch chiết của lá cây ban trịn cĩ tác dụng làm giảm cĩ ý nghĩa thống kế thời gian ngủ do pentobarbitone gây ra [60]

Thử tác dung kháng ung bướu của cao chiết methanol cây ban trịn cho thấy ICaụ trên

tế bào ung thư gan HEP-2 là 1,71pg/ml, trên đồng RD là 1,530g/ml và trên dịng Vero là

2,23ug/ml, Nếu thử với nồng độ 100 - 200 ug/ml thì cao methanol ức chế hồn tồn dịng

ung thư HEP-2 [60]

Cây mọc hoang ở vùng rừng núi, nhiều nhất ở vùng ven biển Bộ phận sử dung: Rễ,

dây, lá, thu hái vào mùa thu đơng, tốt nhất khi cây mới ra hoa

Cơng dụng: Chữa ho, cảm sốt, hồng đản do viêm gan siêu vi trùng, giải độc, vị ngọt

nên dùng trong các đơn thuốc cho để uống Ngày dùng 8-16g sắc uống [28]

Cam thảo dây cịn chưa được nghiên cứu đối với bệnh viêm gan, chủ yếu được dùng

theo kinh nghiệm của nhân đân

Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá cam thảo day: khang Stephylocaccus

aureus véi gia trị MIC of 8 ug/ml [30] Abruquinone cĩ tác dụng kháng virut và độc tính

tế bào, abruquinone B cĩ tác dụng kháng virut, kháng vi trịng lao và vi trùng sốt rét

[50]

Thành phần hĩa học của lá và đây cam thảo: Trong thành phần hĩa học của lá cam

thảo đây cĩ các isoflavanquinone, abruquinone B, abruquinone G [30]; saponin triterpenoid [48] và các glyeosid triterpenie abrusoside A - D - là các chất ngọt tương tự

như glyeyrrhizin cĩ độ ngọt gấp 30 - 100 lần đường suerose [36] Các saponin

triterpenoid cĩ tác dụng kháng viêm

Nhân dân dùng cây điệp hạ châu để chữa bệnh gan từ lâu đời Kết quả nghiên cứu

Trang 17

virut: Virut viêm gan B, Epstein-Bar virut, retrovirut, hespes simplex virut (HSV), cải các dất

thiện enzym gan, chuyển ấn của virút VGB trên lâm sàng ở bệnh nhân viêm

gan B mạn tính [68]

Gan day, các tác giả Hàn Quốc phát hiện ellagie acid chiết tách từ diệp hạ châu cĩ

tác dụng phĩng bế virut VGB giải phĩng HBeAg (kháng nguyên ©) trong các tế bào gan

(C¿y= 0,07 mierog/ml) [64]

Thành phần hoạt chất của điệp hạ châu là các lignan (phyllanthin, hypophyllanthin, phyltetralin và niranthin) và các flavonoid ellagie acid, gallie acid, geraniin [73]

Ở Việt Nam diệp hạ châu thường được dùng phối hợp với các vị thuốc đơng được

khác trong một số bài thuốc điều trị bệnh gan

Nhân dân thường đùng quả để chữa bệnh gan, đầy bụng, khĩ tiêu, hồng đản

Thành phần hố học và tác dụng sinh học của quả đứa gai cịn ít được nghiên cứu

Năm 2002 trong khuơn khé của đề tài cấp Viện Dược liệu (do TS Phạm Thanh Trúc làm

chủ nhỉ

) chúng tơi đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của cao lỏng quả đứa gai thu hái

tai tinh Kiên Giang Kết quả cho thấy cao lỏng của quả dứa gai cĩ tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hố trên chuột gây viêm gan cấp và mạn tính bing CC

Thành phần hố học của rễ cốt khí: cĩ sHlbene glyeoside, piceid (2.23%),

resveratrol; anthranoid (emo din, chrysophanol, physeion); quinon; phenol

Người Dao thường dùng rễ cây cốt khí làm thuốc chữa bệnh gan

Gan đây ở Đài Loan đã cơng bố kết quả nghiên cứu tác dụng ức chế virut VGB của

dich chiết nước và dich chiết cồn của cốt khí củ Dịch chiết cồn ức chế sự nhân lên của

virút VGB với nồng độ tối thiểu 10 microg/ml ( P< 0,0001) Cao nước ức chế sự nhân lên

của virút VGB với nồng độ cao hơn 30 mierog/ml (P < 0,03) [34]

Trang 18

2,3,4-trihydrobenzoie aeid (7), and (+)-afzeleehin (8) [51]; flavonoid: dihydrokaempferol ©, quercetin (I), (+)-3,3!,5',5,7-p entahydroflavanone (TT) and (+)-dihy dromyricetin

Người dân ở Cao bằng, Lạng Sơn dùng quả cây khúng khéng chữa ngộ độc thức ăn, ngộ độc do rượu

Một số tài liệu của Trung Quốc thơng báo về tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây tổn thương gan do CCl¿/D-galaetosamine gây ra [46]; ức chế xơ gan trên chuột gây xơ gan bằng CCl, [52]; giải độc của rượu, thúc đẩy sự chuyển hố của rượu ở gan [35]

Ở Việt Nam cây muỗng trâu mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi, nhiều nhất ở

miền Nam, miền Trung và một số tỉnh miền Bắc (Thanh Hĩa, Nghệ Tinh) [5, 20]

Thành phần hố học: Lá chứa anthraglueosid (3-4%), acid chrysophanie, rhein

Cơng dụng: Chữa táo bĩn, phù thũng, đau gan, vàng da: Lá dùng đưới dạng chè Chữa hắc lào, bệnh tơkêlơ, ecpét loang vịng, ghẻ, lở loét ở súc vật: Lá tươi giã nát xát, hoặc vất nước bơi vào nơi bị bệnh Dùng nhuận tràng: Ngày 4 - 8g bột thân lá; tẩy: 15 -

20g sắc uống [9]

Nghiên cứu gần đây cho thấy lá muỗng trâu cĩ tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn, vì vậy cĩ triển vọng làm thuốc điều trị nhiễm trùng cơ hội cho bênh nhân AIDS [39]

Cho đến nay chưa tìm thấy tài liệu nghiên cứu về tác dụng của lá muỗng trâu đối với

bệnh VGB trên thực nghiệm cũng như trên lâm sàng

Ở Việt Nam cây ngũ vị hoa nam đã được TS Nguyễn Bá Hoạt và CS của VDL phát hiện tại vùng núi Ngọc Linh thuộc 2 tỉnh Kong Tum và Quảng Nam [12] Kết quả

điều tra sơ bộ cho thấy trữ lượng quả khá cao tại 3 xã Ngọc Lây, Tê Xăng và Ming Ri: ~

4 — 5 tấn quả khơ/năm Viện Dược liệu đã nghiên cứu thăm đị tác dụng bảo vệ gan của

quả ngũ vị hoa nam thu hái tai núi Ngọc Linh so sánh với ngũ vị Trung Quốc Kết qủa cho thấy cao ngũ vị tử hoa nam với liều thử 67mg/kg cĩ tác dụng giảm men gan, giảm

Trang 19

bằng CCl, và bằng ethanol, so với lơ chứng bệnh lý kết quả cĩ ý nghĩa thống kê Cao ngũ

vị tử hoa nam cịn làm giam thời gian ngủ của pentobarbital bị kéo đài đo tiêm CCl, Kết

quả nghiên cứu thăm đị trên đây cho thấy quả ngũ vị hoa nam rất cĩ triển vọng trong điều chế thuốc trị viêm gan mạn [Nguyễn Bá Hoạt, 2005]

Cây noe sởi, cịn cĩ tên là điền cơ hồng, châm hương

(thân, cành mang lá, hoa, rễ) Thành phần hố học: Cây nọc sởi thu hái tại Việt Nam đã

được phân tích sơ bộ thành phần hố học bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM)

hận sử dụng: Tồn cây

Kết quả cho thấy trong phan trên mặt đất của cây cĩ flavonoid, acid amin, acid hitu co

[26]

Tại Nhật Bản các tác giả đã chứng mình trong cây nọc sởi cĩ các dẫn xuất

phloroglucinol: saroaspidin A, B va C; ede sarothralen A, B, C va D; sarothralin va sarothralin G Gần đây các bisxanthones jacarelhypcrol A và B đã được phân lập từ cây nọc sởi ở Nhật Bản

Cây nọc sởi cịn là một vị thuốc dùng trong dân gian Tính chất: Theo Đơng y cây nọc

sởi cĩ vị đống, ngọt, tính bình, khơng độc vào 2 kinh can và tỳ Cĩ tác dụng thanh thấp

nhiệt, tiêu thũng trướng, khử tích tiêu thực (chữa tiêu hố kem, đẩy) dùng chữa cam tích,

thấp nhiệt hồng đản Dùng ngồi chữa rin cắn, bị thương, sưng đau Chữa hồng đản: cây nọc sởi khơ: 40 — 60 g sắc uống [11, 20]

Theo kết quả nghiên cứu của các nước, cây nọc sởi cĩ tác dụng kháng vi rút mạnh (HSV-IL, HIV) va khang khuẩn Tại Trung Quốc cây nọc sởi được dùng chữa viêm gan cấp hoặc mạn tính [5, 11] Gần đây cây nọc sởi được chứng minh cĩ tác dụng chống ơ xy hĩa lipid mạnh Các tác giả cho rằng tác dụng này cĩ liên quan đến tác dụng bảo vệ gan

của dược liệu [33]

Trang 20

Cây vọng cách mọc hoang và được trồng ở đồng bằng và vùng núi để lấy lá làm gia vị ăn gỏi cá Nhân đân thường dùng lá vọng cách làm thuốc chữa kiết ly, tiêu hố kém,

tiểu tiện khĩ, tị phù do gan, xơ gan [5, 11,20] Người Mường Hồ Bình dùng lá vọng cách chữa bệnh gan Ngày dùng 8-12g lá

Thanh phan hod hoe của lá vọng cách: Lá cĩ mùi thơm hắc Trong lá cĩ verbacosid

iridoid glueosid là bremeoryosi d, alealoid premnazol [5]

Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học của lá vọng cách cho thấy trong lá vọng

cách cĩ các thành phần: alealoid, flavonoid, eoumarin, saponin và đường khử Đã xác

định chỉ số bọt của saponin trong lá là 125, chỉ số phá huyết đối với máu đê là 400 Độc éu ~ 50g được liệu/kg chuột

tính cấp: khơng xác định được LDaạ khi cho chuột uống với

[21]

Tác dụng chống oxy hĩa của cao lỏng lá vọng cách với liều tương đương ~10g dl/kg

chuột cĩ tác đụng làm giảm 7,86% hàm lượng MDA ở chuột bị gây tăng oxy hĩa bằng CCl¿ Cao lỏng cịn cĩ tác dụng giảm hoạt tính của GPT từ 154,95 xuống cịn 119,11(/1)

và giảm hàm lượng bilirubin từ 2,78 xuống 2,09 (umol/) trong huyết thanh chuột bị gây viêm gan cấp bing CCl, [21]

* Nhận xét chung:

-Những thơng tin trên đây cho thấy 10 cây thuốc liệt kê ở trên là những cây thuốc đã

được sử dụng trong điều trị một số bệnh về gan theo kinh nghiệm của nhân dân, trong đĩ một số cây đã được nghiên cứu sơ bộ ở trong và ngồi nước về tác dụng bảo vệ gan, ức

chế xơ gan Vì vậy các dược liệu từ các cây thuốc này rất cĩ triển vọng trong nghiên cứu

sàng lọc để tìm các vị thuốc cĩ tác dụng bảo vệ gan tốt nhất, làm cơ sở cho nghiên cứu

bào chế một loại thuốc điều trị viêm gan B mạn

-Việc lựa chọn các cây thuốc này làm đối tượng nghiên cứu sàng lọc vị thuốc cĩ tác

Trang 21

-Kết quả thử nghiệm đồng thời trên cùng một mơ hình nghiên cứu sẽ cho phép lựa

chọn sản phẩm chiết xuất cĩ tác dụng bảo vệ gan tốt nhất để bào chế một loại thuốc điều

trị viêm gan B mạn - là mục tiêu chính của đề

1.2 Một số bài thuốc điều trị viêm gan:

Trong nhân dân đã lưu truyền và đang được sử dụng một số bài thuốc trị các bệnh về

gan, trong đĩ cĩ VGB, xơ gan cỗ chướng, hồng đản, suy giảm chức năng gan :

1) Bài thuậc chữa viêm gan siêu vì khuẩn thễ cấp tính [27]: Hạ khơ thảo (30 g), ¥ di (20 #), gừng khơ (3 lát), đành dành (12 g), Hồi sơn (20 g), thể phục linh (12 g), sâm bố chính (20 g), mã để (10 g), trần bì (6 g) Sắc uống ngày 1 thang

2) Bài thuốc chữa viêm gan siêu vỉ khuẩn thể mạn tính [ 27]: Hạ khơ thảo (40 g); thé phục linh (12 g), nghệ vàng (10 g), mã để (40 g), rau má (40 g) Sắc uống ngày 1 thang 3) Bài thuc chữa viêm gan nhiễm trừng: bạch truật (9 g), Nhân trần (30 g), trạch tả (9 g), dành đành (9 g), thể phục linh (12 g), nước 450 ml sắc cịn 200 ml chia 3 lần uống trong

ngày

4) Bài thuấc chữa viêm gan siêu ví trùng (theo phương pháp chữa thanh nhiệt, lợi thấp) [27]: Nhân trần (30 g), đành dành (12 g), vỏ đại (10 g) (hoặc chất chiết 8 g)

tống

ngày 1 thang, uống trong 5 — 7 ngày

3) Xươ nhân trần: Chữa vàng da, ving mit, viém gan [20]: Nhân trần (24 g), chỉ tử (12 #), nước 600 ml, sắc cịn 100 ml, thêm đường cho đủ thành xirơ Chia 3 lần uống trong

ngày

6) Bài thuấc LIV-94: Di

cứu trong khuơn khể đề tài cấp thành phố : “Đánh giá tác dụng của thuốc LIV-94 làm

giảm và sạch HBsAg trên bệnh nhân viêm gan mạn tính” do BS Nguyễn Bá Kinh(Giám

đốc bệnh viện Thanh nhàn) làm chủ nhiệm kết hợp với Viện quân Y 103 Các vị thuốc

hạ châu đắng, chua ngút, cỏ nhọ nồi Đây là bài thuốc nghiên

trong bài thuốc này đều là các vị thuốc chỉ huyết lương, cĩ tác dụng cằm máu, lợi mật, hạ

men gan, làm giảm và sạch HBsAg- kháng nguyên bề mặt của viêm gan B Bệnh nhân bị

viêm gan mạn tính sau khi dùng thuốc LIV-94 từ 50 đến 97% số bệnh nhân được phục hồi

Trang 22

men gan transaminase, từ 67 — 100% số bệnh nhân (tuỳ theo bệnh lý ban đầu) giảm bilirubin tồn phần trở về bình thường

7) Xird Hebevera — bài thuốc gia truyền của Lương Ý Trần Xuân Thiện: Bài thuốc gồm 3 vị: Diệp hạ châu đắng, xuyên tâm liên và chỉ tử Bài thuốc này đã được lương y Trần Xuân Thiện dùng điều trị cho nhiều thanh niên tình nguyện cĩ HBsAg(+) sau thời gian điều trị cĩ HBsAg (-) Kết qủa nghiên cứu đã được cơng bố Bài thuốc cĩ 2 tác dung:

+Chuyển HBsAg (+) trở về âm tính HBsA g(-) là 26,5% (26/98 người)

+Tác động lên hệ miễn dịch, kích thích sản xuất ra kháng thể chống kháng nguyên

HBsAg là 62% trường hợp (59/98 người)

+Thuốc khơng cĩ tác đụng phụ

Sau này DS Trần Dũng Sỹ cùng PGS Hà Văn Ngạc (Viện Quân Y 103) tiếp tục nghiên

cứu đưới dạng xirơ Hebevera

8) Bai thude VG 99: Bai thuốc gồm 7 vị: Diệp hạ châu đắng, nhân trần, sa tiền, rau má,

ngũ vị tử, uất kim, đại hồng Thuốc được bào chế dưới dạng cao lỏng chiết xuất theo quy

trình của Khoa được, Viện Y học cổ truyền (YHCT) Việt Nam Thuốc đã được dùng điều

trị cho 18 bệnh nhân VGB tại Bệnh viện Đống đa và Viện YHCT với liễu dùng 30

ml/ngày trong 2 tháng Kết quả thuốc VG 99 cĩ tác dụng cải

tốt các triệu chứng lâm

sàng, làm giảm trasaminase máu, giảm hoạt động viêm trên mơ học ở bệnh nhân VGB

mạn tính Tại Sơn La từ lâu bài thuốc này cũng được nhiều người sử dụng để chữa VGB

9) Bai thude bd gan — thơng miệt: Thành phần cĩ 3 vị: Cao aelisõ, cao khơ biển súc (rau

đẳng), bột hạt bìm bìm Bài thuốc này được một số cơng ty Dược trong nước sản xuất

10) Bài thuấc tiêu phong nhuận gan số 40: Là thuốc do Cơ sở Đơng Nam Dược Ngọc liên

Mỹ tho, Cần thơ sản xuất Thành phần gồm 20 vị: Muỗng trâu, rau má, xuyên tâm liên, rau đắng biển, dâu tằm, hồng đằng, nghệ, đứa gai, bèo cái, actisơ, lạc tiên, vơng nem, cỏ mẫn trầu, cỏ mực, mĩp gai, ơ rơ, quau nước, chỉ tử, hương phụ và kim ngân hoa Thuốc

cĩ tác dụng nhuận gan, lợi mật, kháng viêm, giải độc, nhuận tràng Trị viêm gan mạn, mệt

mỗi, kém ăn, đầy bung, đau vùng gan

Trên đây là một số trong số rất nhiều bài thuốc được sử dụng trong nhân đân để điều trị viêm gan, rối loạn chức năng gan, viêm gan mạn tính Trong số này cũng cĩ những

Trang 23

bài thuốc đã được chứng minh trên lâm sàng Nhận xét chung: Các bài thuốc thường cĩ ít

nhất 3 vị , nhiều nhất

thuốc là: Diệp hạ châu đắng, dành đành, mã để, rau má, nhân trần, actisơ, rau đắng Thành

én 20 vi Một số được liệu cĩ tần suất sử dụng nhiều trong các bài phần các bài thuốc thường gồm các vị thanh nhiệt, lương huyết Theo y học hiện đại các

vị thuốc cĩ tác dụng chống ơ xy hố là cĩ tác dụng bảo vệ gan, chống viêm gan do đĩ cĩ tác dụng giảm các enzym gan và chống hoại tử tế bào gan Một số vị cĩ tác dụng kích thích sản xuất kháng thể chống kháng nguyên HBsAg, ức chế sự nhân lên của vi rút VGB nhờ vậy làm chuyển HBsAg (+) về âm tính và giảm số lượng vi rút VGB

1.3 Một số hoạt chất cĩ tác đựng trong điều trị viêm gan:

Việc tìm kiếm các chất bảo vệ gan thường được bắt đầu từ các cây thuốc đã được sử

dụng theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa các bệnh liên quan đến gan Trong số các cây được chú ý nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất cĩ thể kể đến: cúc gai (Slybien marianuum

), actisd (Cynara scolymus ), ngũ vị tik (Schizandra chinensis), digp ha chu (Phyllanthus urinaria ), ngh§ (Curcuma longa), sti hé (Buplerum chinensis) Nhiều chất đã được

phân lập và được chứng minh cĩ tác dụng bảo vệ gan Các chất đĩ thuộc nhiều nhĩm

chất: nhĩm hep chat phenol (flavonolignan, flavonoid, lignan, coumarin, xanthon, tanin, acid phenolie ), terpenoid, alealoid và các chất khác

Trong đĩ, các hợp chat flavonoid da duge nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh cĩ tác dụng bảo vệ gan thơng qua các tác dụng: dap tắt gốc tự do, tác dụng chống oxy

hố, bảo vệ tế bào, chống lão hố tế bào, tăng tiết dịch mật, giải độc gan, bảo vệ chức

năng gan, lợi tiểu, chống viêm, giảm đau trên thực nghiệm Hoạt tính của flavonoid chủ

yếu là nhờ trong cấu trúc hố học của chúng cĩ vịng thơm, hệ nối đơi liên hợp, nhĩm

carbonyl, nhém OH phenol Cĩ 49 chất thuộc nhĩm flavonoid đã được chứng minh cĩ tác dụng bảo vệ gan [15, 29, 38, 40, 44, 65 ]

Catechin (eyanidanol-3) là một bioflavonoid đã được nghiên cứu chứng mỉnh tác dụng trên các mơ hình gây viêm gan ở động vật và trên lâm sàng Biệt được Catergen

Trang 24

chứa (+)-cateehin đơn chất đã được đưa vào sử dung trong điều trị viêm gan từ 1976,

[71] Hop chất này thể

ện tác dụng kích thích miễn địch, bảo vệ chức năng gan ở bệnh

nhân viêm gan B Khi dùng phối hợp với alpha-interferon nĩ làm tăng tác dụng chống viưút VGB của alphainterfron Các dẫn chất của catechin như gallocatechin, epigallocatechin cũng cĩ tác dụng bảo vệ gan trên các mơ hình gây tổn thương gan bởi D- galactosamin và lipopolysaccharid ở chuột nhất [70, 72] Các chất này cĩ trong chè xanh

Camellia sinensis và thường gặp trong nhiều cây khác Các flavonoi

llagie acid, gallic acid, geraniin trong điệp hạ châu đã được chứng mình cĩ tác dụng bảo vệ gan [73]

Tuy nhiên trong nhiều trường hợp các chất này chỉ là chất chỉ định được dùng để

kiểm sốt chất lượng của các thuốc thảo mộc Trên thực tế chúng chiếm một hàm lượng

thấp trong nước sắc của các bài thuốc hoặc các đạng bào chế Đa số các bài thuốc cĩ thành phần phức tạp cùng với sự phối chế tỉnh sảo của thiên nhiên làm nên những tổ hợp

các chất trong các sản phẩm chiết xuất từ dược liệu mà chúng ta chưa biết hết Vì vậy việc

dự đốn thành phần hoạt chất trong các bài thuốc chỉ là tương đối Điểm quan trọng là

thuốc cĩ tác dụng làm giảm các triệu chứng của bệnh và cải thiện các xét nghiệm enzym

gan, bilirubin, giảm viêm, chuyển đảo huyết thanh, xuất hiện anti-HBeAg và làm giảm số

lượng vi rút VGB, ức chế xơ gan

Trang 25

TE VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu:

Vật liệu nghiên cứu là 10 vị thuốc (bảng 2.1) và 2 bài thuốc điều trị viêm gan siêu vị cấp và mạn tính Bảng 2.1: Danh sách các vị thuốc nghiên cứu STT 'Tên khoa học của cây Nơi thu hái mẫu thuốc

1 | Quả cây ngi vi tir hoa | Schisandra sphenanthera | Dic TS, Kon Tum

nam Rehder & E.H Wilson

7 | Cam thảo dây ‘Abrus precatorius Thanh Trì, Hà Nội 8 — | Quả khúng khéng Havenia dulcis Thunb _ | Thj xi Cao Bing 9 |Lá muồng trâu Cassia elata L Thanh Trì, Hà Nội

10 |Lá vọng cách Premna corymbosa Thanh Trì, Hà Nội

*Hai bài thuốc chữa viêm gan siêu vi mạn tính đã được nghiên cứu sàng lọc tác dụng bảo

vệ gan [27]:

Trang 26

-Bài số 1: Thành phần cĩ: Hạ khơ thảo (30g), ý đĩ (20 g), gừng khơ (3 lá, đành dành (12 g), hồi sơn (20 g), thể phục linh (12g), sâm bố chính (20g), mã dé (10g), trần bì (6g) Sắc uống ngày 1 thang dùng điều trị viêm gan siêu vi cấp tính

- Bài số 2: Thành phần cĩ: Hạ khơ thảo (40 g), mã để (40 g), thể phục linh (12 g), nghệ vàng (10g) và rau má (40g) Sắc uống ngày 1 thang dùng điều trị viêm gan siêu vi mạn

tính

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu hố học vù chiết xuất:

2.2.4.4 Dinh tính các nhĩm chất trong được liệu: Các dược liệu chưa biết thành phần

hố học được phân tích sơ bộ bằng các phản ứng hĩa học

3.2.1.2 Phương pháp định lượng:

+ Phương pháp định lượng astlbin vù querciin trong bot Hypatin và thuốc Hypatin bằng sắc ký lơng cao áp (SKLCA) [26]

Dieu kiện sắc ký:

Máy HPLC Hewlett- Packard 100

Cột Liehrosorb Rp 18 101m (250x4mm)

Pha déng : Acetonitril: Dung dich acid acetic 0,25M (25:75) (cĩ thể điều chỉnh tỉ lệ)

Detector Diod Array G1315A : 284nm

Tốc độ địng : 1ml/phút Thể tích tiêm: 20u

+ Hố chất, dung mơi:

~_ Aeetonitril tỉnh khiết (Merck) - Aeidacetieglaeial tỉnh khiết (Merek) - Methanol tinh khiét (Merck)

+ Mẫu đái chiếu:

Mẫu đối chiếu Astilbin: Viện Dược liệu điều chế, hàm lượng 92% (định lượng bằng

SKLCA)

Trang 27

Mẫu đấi chiếu Querctrir: của hãng Chromadex Ine, hàm lượng 98,69%

lượng

bằng SKLCA - theo phiếu kiểm nghiệm của hãng Chromadex) *Tién hành:

* Dung dịch đất chiếu Astlbi: Cân chính xác khoảng 50mg Astilbin đối chiếu vào

bình định mức 100ml, thêm 70ml Methanol lắc siêu âm để hồ tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45m

*Dụng dịch đất chiếu Querctrii: Cân chính xác khoảng 50mg Quereitrin đối chiếu

vào bình định mức 100ml, thêm 70ml Methanol lắc siêu âm để hồ tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45m

* Dung dịch thử của viên Hypatin: Cân chính xác một lượng bột viên khoảng 490mg

vào bình định mức 50ml, thêm 40ml Methanol lắc siêu âm để hồ tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45um

* Dung dịch thử của bột Eypatin: Cân chính xác một lượng bột khoảng 280mg vào

bình định mức 30ml, thêm 40ml Methanol lắc siêu âm để hồ tan, sau thêm Methanol đến vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45m

Tiêm các dung của mẫu đối chiếu và mẫu thử của viên Hypatin vào hệ thống sắc ký,

ghỉ sắc ký đề Từ điện tích hoặc chiều cao của các píc Astilbin, Quereitrin đối chiếu và

của dung thử tương ứng, lượng cân của mẫu đối chiếu và mẫu thử, độ pha lỗng của mẫu đối chiếu và mẫu thử, khối lượng trung bình viên ta tính được hàm lương (mg) của

Astilbin và Quereitrin trong viên

Tiêm các dung địch đối chiếu và dung địch thử của bột Hypatin vào hệ thống sắc ký, ghỉ sắc ký đề Từ điện tích hoặc chiều cao của ede pic Astilbin, Quereitrin đối chiếu

và của dung dịch thử tương ứng, lượng cân của mẫu đối chiếu và mẫu thử, độ pha lỗng

của mẫu đối chiếu và mẫu thử ta tính được hàm lương (%) của Astilbin và Quereitrin

trong bột Hypatin

Thời gian lưu của pie Astilbin đối chiếu : 5,782 phút Thời gian lưu của pie Quereitrin đối chiếu : 7,856 phút

Trang 28

Cân chính xác khoảng 4 g được liệu lá Ban trịn đã xay nhỏ Tiến hành chiết siêu âm

với 200 ml methanol trong 30 phút Cân trọng lượng bình cùng dung mỗi trước và sau khi

chiết Bổ sung dung mơi cho đến trọng lượng ban đầu Lọc lấy 100 ml địch lọc (tương

đương 2 g được liệu) Cơ cạn trên bếp cách thủy đến cắn Hịa cắn trong 20 mÏ nước nĩng, lọc qua giấy lọc, tráng giấy lọc bằng 5 mÍ nước nĩng x 2 lần, gộp vào địch lọc

Chuyển dịch lọc vào bình lắng gan Tráng bình bing 30 ml ethyl acetat Chuyén dich ethyl acetat vao bình lắng gạn Lắc hén hep trong 5 phút, để tách lớp Gạn lớp thyl acetat vào cốc đã sấy đến trọng lượng khơng đổi Tiếp tục làm như vậy đến khi dịch ethyl acetat

khơng màu Cơ dịch ethyl acetat trên bếp cách thủy đến cắn Sấy cốc cùng cắn trong tủ sấy ở 105C trong 3 giờ Để cốc trong bình hút ẩm 30 phút và cân nhanh Tính trọng

lượng của cắn (a gam)

Hàm lượng (%) flavonoid tồn phần tính theo hàm lượng chất chiết được bằng cthyl

acetat duge tính theo cơng thức:

ax 100 x 100

X(%) =

P (100 - B)

Trong 46: X : Him lượng flavonoid tồn phần trong được liệu (%)

Ð: Khối lượng bột được liệu đã cân để định lượng (g)

a: Trọng lượng của cắn (g)

B: Độ ẩm của dược liệu (9)

+ Đậnh lượng flavonoid tồn phần trong cúc chế phẩm chiết xuất từ lá ban trồn

bing phương pháp quang phổ tử ngoại:

Hàm lượng flavonoid tồn phan trong các chế phẩm chiết xuất từ lá ban trịn được

tinh theo astilbin

-Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,05g chế phẩm cho vào bình định mức 50ml, thêm 30ml methanol Siêu âm 15 phút cho tan hồn tồn, thêm methanol vừa đủ Lắc đều Lọc qua giấy lọc, lấy chính xác 1ml dịch lọc cho vào bình định mức 50ml thêm methanol vừa

đủ được dung địch thử

Trang 29

-Mẫu đấi chiếu: Cân chính xác 10mg Astilbin, hồ tan với methanol trong binh định mức dung tích 100ml Lắc đều, được dung dịch A Lấy chính xác 1ml dung dich A vio bình

định mức dung tích 10ml Thêm methanol đến vạch, lắc đều, được mẫu đối chiếu cĩ nồng độ 10ug/ml

Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu đối chiếu ở bước sĩng 290nm

Hàm lượng (%) flavonoi đ tồn phần tính theo astilbin được tính theo cơng thức:

D, x 10 x 2500 x 100 X%=

D,x10'xm

Trong đĩ: D„- Mật độ quang của mẫu đối chiếu

D„- Mật quang của mẫu thử

m-Khéi lượng mẫu thử đã cân (g)

5 Đậnh lượng suponin toan phan trong duge li

Hàm lượng saponin tồn phan trong các được được lượng bằng phương pháp

cân [9]

Cân chính xác khoảng 10 g bột được liệu (đã xác định độ ẩm) Cho vào túi lọc rồi chiết

soxhlet với 300 mÌ methanol cho tới khi dịch chiết trong suốt và khơng cho phản ứng với

H;SO, đặc Dịch chiết methanol được thu hồi dung mơi đưới áp suất giảm bằng máy cất

quay cho tới khi cịn khoảng 40 ml Để nguội, lọc qua giấy lọc Tráng giấy lọc bằng 10 mÌ methanol Cơ cịn khoảng 30 ml Rĩt từ từ vào 300 ml aeeton Để cốc phản ứng vào tủ

lạnh qua đêm Gạn lấy tủa Tủa được để ngồi khơng khí cho bay hết hơi aceton, hồ lại

trong 20 mÍ methanol, đun cách thuỷ Để nguội, lọc, tráng giấy lọc bằng 10 ml methanol

Rĩt từ từ vào 300 ml aceton, để lạnh qua đêm Gạn lấy tủa Tủa Saponin tồn phần được

sấy trong tủ sấy chân khơng ở nhiệt độ 60C dến khối lượng khơng đổi Cân và tính hàm

lượng saponin tồn phần

Trang 30

Ð: Khối lượng được liệu đem định lượng (9)

B: Độ Âm của được liệu (%)

+ Định lượng lgnan tồn phẪn trong quả ngũ vật

Phương pháp: Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng kết hợp với phương pháp đo quang Hàm lượng lignan tồn phần được tính theo chất chuẩn Gomisin C

Tiên hành:

- Chuẩn bị mẫu: 1g bột được liệu được chiết với 25 ml MeOH theo tỷ lệ1:25 (10

x 10 x 5ml) bằng siêu âm ở 40°C, lọc, cơ địch chiết đến cắn trên bếp cách thủy 4 60°C,

hịa tan cắn bằng CHCI; và định mức chính xác 20 ml Hút 0,2 mÌ dịch CHC]; tiến hành

sắc ký lớp mỏng chế hĩa (bản silieagel tráng sẵn GF254) với hệ dung mơi hexan - aceton (65:53), phát hiện bằng cách soi UV 254nm, cạo vùng hấp thu tương ứng với nhĩm hợp chat lignan va dùng MeOH giải hấp phụ Cơ dịch MeOH đến cắn trên bếp cách thủy ở

60C Hịa tan cắn bằng CHCI;, lọc và quy vào bình định mức 50 ml, tiến hành đo mật độ

quang

- — Đo độ hấp thụ: địch CHCI; được đo bằng cuvete thạch anh 1em, bước sĩng 242

am Tiến hành định lượng 3 lần Trị số OD thu được đối chiếu với đường chuẩn Gomisin

€ và suy ra hàm lượng lignan tồn phần cĩ trong mẫu

+ Định lượng Antirunoll trong lá mung trâu được thục hiệu theo phương pháp ghi trong DDVN TH, chuyên luận “Muơng trâu”: Hàm lượng anthranoid được xác định

bằng phương pháp quang phổ tử ngoại tinh theo anthraquinon [9]

3.2.1.3- Phương pháp điều chế các mẫu cao tồn phần vù chiết tách các chất tình khiết

cho thử sàng lọc tác đựng bảo vệ gan:

*Điều chế cao tồn phần: Các vị thuốc được chiết với 3 dụng mơi khác nhau: n-hexan,

ethanol 80% và nước trên bếp cách thuỷ cĩ ống sinh hàn ngược đến hết màu của dịch chiết Lọc các dịch chiết Cơ thu hồi dung mơi dưới áp suất giảm đến cao đặc dùng để

nghiên cứu

Trang 31

*Chiết tach các chất tình khiết Astibin và quercirin từ lá ban tron: Các chất tỉnh khiết được tách từ hỗn hợp flavonoid của lá ban trịn bằng phương pháp sắc ký cột pha thường

và pha đảo với các hệ dung mơi rửa giải thích hợp, kết tỉnh nhiều lần, thu được các chất tỉnh khiết Kiểm tra độ tỉnh khiết bằng SKLCA và SKLM

*Chiất tách và nhận dang các chất tình khiết từ quả ngũ vị: Bột quả NVT (100 g) khẽ

được chiết với methanol bằng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 50ÌC Sau khi thu hồi dung mơi

dưới áp suất giảm thu được 8 gam cao đặc

Bổ sung 700 ml nuée cất vào cao đặc, lắc đều, sau đĩ chiết lần lượt bằng n-hexan,

cloroform, ethyl acetat và n-butanol Bốc hơi đung mơi, thu được các phân đoạn n-hexan (1,2), cloroform (4,1g), ethyl acetat (0,7g) và n-butanol (0,6g)

4,1 g cao cloroform được tiến hành phân lập bằng các phương pháp sắc ký cột với các dung mơi rửa giải khác nhau Các phân đoạn thu được tiếp tục tính chế bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) điều chế Kết tỉnh trong các dung mơi thích hợp, thu được 6 chat tinh

khiết ký hiệu: NVTLA1, NV T1A2, NVT1A3, NVT1A4, NVTIA6 và NVTLA7 Cấu trúc hĩa học được xác định dựa trên các đặc trưng lý, hĩa học và các dữ liệu phổ cộng hưởng

tir hat nhan “C-NMR, ‘H-NMR, phé DEPT

3.2.1.4 Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất bắn thành phẩm (bot Hypatin): 5 _ Nghiên cứu phương pháp chấết xuất bản thành phẩm ở phịng thí nghiệm:

Thiết kế nghiên cứu phịng thí nghiệm:

Xác định hàm lượng flavonoid trong được liệu ban trịn

Khảo sát các yếu tơ ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng sản phẩm:

Các điều kiện đã được khảo sát gồm:

- Dung mơi chiết xuất: Ethanol 70%, 80% và nước

- Nhiệt độ chiết xuất: nhiệt độ phịng; nhiệt độ 80 - 95C (tùy theo dung mơi)

-_ Tỷlệ được liệu dung mơi: 1/10 - — Thời gian chỉ

giờ x 3 lần Chiết ở 80-95C: Chiết hồi lưu trên cách thủy: 1,5 giờ x 3-4 lần

: ở nhiệt độ phịng: ngâm trong 48 giờ, lọc địch chiết; ngâm tiếp 24

Trang 32

- Kích thước nguyên liệu: xay nhỏ qua rây 1 mm để chiết bằng ethanol; xay thơ để chiết với nước

-Các dịch chiết nước được cơ, dịch chiết cồn được thu hồi cồn đến cao lỏng, chiết tách

flavonoid tồn phần từ cao lỏng bằng FtOAc, sau đĩ sấy trong tủ sấy chân khơng đến

khơ và cân

-Đánh giá phương pháp chiết xuất thơng qua: Hiệu suất chiết flavonoid và hàm lượng

flavonoid toan phan trong chế phẩm

+ _ Phương pháp nghiên cứu gay trình chiết xuất bin thinh pham 6 quy mo pilot:

Áp dụng các điều kiện chiết xuất tối ưu đã chọn được cho quy trình chiết xuất

phịng thí nghiệm để xây dựng quy trình chiết xuất quy mơ pilot Thiết bị chiết xuất là máy chiết đa năng của hãng Tourner, lắp đặt tại khoa Cơng nghệ chiết xuất - VDL

*Dây chuyền thiết bị chiết xuất cao dược liệu ở quy mơ pilot bao gồm:

1 Thiết bị chiết 2 vỏ 250lít gia nhiệt bằng hơi nước bão hịa - Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306

- Nước SX: Pháp

- Bom dung mơi 500w

2 Thiết bị cơ áp suất giảm 2 vỏ 250lít gia nhiệt bằng hơi nước bão hịa

-Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306

- Nước SX : Pháp

-Bơm chân khơng vịng nước 2,2lew

3 Thiết bị sấy áp suất giảm 2m3

- Vật liệu chế tạo: Inox SUS 306

- Nước SX: Pháp

-Bơm chân khơng vịng nước 2,2lew

4 Thùng lọc áp suất giảm 50lít

-Vật liệu chế tạo Inox SUS 304

446 td qui trình chiết xuất:

-Dược liệu sau khi thu hái được xử lý :phơi khơ hoặc sáy đạt độ ẩm < 12%

Trang 33

-Dược liệu xay thơ (1 -1,5em) nhằm mục đích cho dung mơi thấm nhanh, đều và sử dụng

lượng dung mơi tối thiểu, cĩ thể tích rỗng nhỏ nâng cao cơng suất thiết bị chiết nhưng

khơng bị quá nát trong khi chiết xuất, dé dang lọc dịch chiết

-Nạp được liệu vào nồi chiết, sau khi đã nạp đủ dược liệu, đĩng nắp kiểm tra độ kín của

thiết bị

- Bơm dung mơi chiết theo tỉ lệ 1 được liệt

: 10 dung mơi

-Gia nhiệt đến nhiệt độ 85-90°C Duy trì nhiệt độ trong suốt thời gian chiết

-Kết thúc quá trình chiết xuất dịch chiết được rút ra, lọc bằng thiết bị lọc chân khơng và

chuyển vào thiết bị cơ áp suất giảm

Ši cơ, rồi cho các thiết bị trao đổi nhiệt hoạt động, sau đĩ mở van

- Kiểm tra độ kín của

cấp hơi từ từ, kiểm tra nhiệt độ ra của dung mơi và điều chỉnh van cấp hơi,van chân khơng và van cấp tác nhân lạnh trung gian cho các thiết bị trao đổi nhiệt hoạt động thích

hợp

- Dịch chiết được thu hồi áp suất giảm đến cao lỏng (1 : 1)

-Khĩa van cấp hơi, mở chân khơng, mở van đáy thu hồi dịch chiết đặc (cao lỏng) *Chiét tách và tình chế flavonoid:

-Để nguội cao lỏng Lắc cao lỏng với Ethyl acetat trong thiết bị cĩ cánh khuấy trong vịng 30 phút, để yên tách lớp 30 phút Rat lép Ethyl acetat ra thang cĩ nắp Cho tiếp Ethyl

aeetat để lắc lần 2 Gộp 2 địch Ethylacetat vào, cất chân khơng

-Cơ chân khơng đến cạn cịn 1L Tháo cao lỏng ethylacetat ra Tráng thiết bị bằng 0,51 nước Gộp vào đem sấy chân khơng đến khơ

Trang 34

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu tác đụng được lý và độc tính 2.2.2.4-Thit tie dung bio v8 gan:

-Nguyên liệu nghiên cứu - - cĩ

Các mẫu cao chiết xuất bằng n-hexan, cồn 80% và nước từ 10 vị thuốc, cao chiết bằng

nước từ 2 bài thuốc và một số ché phim khée tir 14 ban tron (flavonoid toan phan, astilbin,

quereitrin) đã được thử tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây viêm gan cấp bing CCl,

-8úc vật nghiên cứu

Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 23 g + 2 g) được cung cấp bởi Viện Pasteur Tp HCM và được để ổn định ít nhất 1 tuần trước khi thử nghiệm Thể tích cho uống hoặc tiêm phúc mơ là 10 ml/kg thể trọng

-Phương pháp nghiên cửu

+ Thực nghiệm gây tổn thương gan chuột nhắt trắng bing CCly:

Các mẫu thử nghiệm được cho uống trong 8 ngày CCl¿ được hịa trong đầu oliu và được tiêm phúc mơ ở liều 1 g/kg một giờ sau khi uống mẫu thử nghiệm vào ngày thứ 1, thứ 3 và ngày thứ 5 của thực nghiệm Một giờ sau lần cho uống thứ 8, tiến hành lấy máu đuơi

chuột, ly tâm trích huyết thanh và định lượng transaminase GPT và bilirubin tịan phần Các lơ thử nghiệm được bế trí như sau:

- Lơ 1: uống nước cất, khơng tiêm CCl, (-) (lơ chứng sinh học)

- Lơ 2: uống nước cất và tiêm phúc mơ tetraclorua carbon liều 1 g/kg (lơ chứng bệnh - Lơ 3: uống thuốc tham chiếu silymarin (liều 0,1 g/kg x 8 ngày) và tiêm phúc mơ CCI, lều 1 g/kg

- Các lơ thử: uống mẫu cao thử (liều tương đương với 10 g được liệu/kg thể trọng x 8 ngày) và tiêm phúc mơ CCI, liều 1 g/kg

+ Định lượng transaminase GPT (ALT) trong huyết thanh [65]

Nguyên tắc:

2-oxoglutarate + L-alanine <> L-glutamate + pyruvate

pyruvate+NADH+H+ << Lilactate+NAD+

Trang 35

Tiến trình: Mẫu: Huyếtthanh chuột

Đo đối chiếu với nước cất

Bước sĩng 340 nm (334-365 nm)

Nhiệt độ 3 00C hoặc 37C

Thuốc thử: Bộ kít định lượng của Human Co (Germany), gồm:

RI: TrsbuferpH73: 150 mmoll L-alanine: 750 mmol/l LDH: 212kUA R2: 2-oxoglutarat: 90mmoll NADH: 0,9 mmol/l Quy trinh: Bang 2 2: 30°C 37% Mẫu thử 200 jul 100 yl Thuốc thử R1 1000 yl 1000 yl Trộn, ủ 5 phút Thuộc thử R2 250 ul 250 ul Trộn đều, ủ 01 phút, đọc kết quả từng phút trong vịng 03 phút trên máy định lượng sinh hĩa bán tự động -Dinh lwong bilirubin tadn phân trang huyết thanh [45, 66] Nguyên tí

Sulphanilie acid + sodium nitrite > DSA (diazotised sulphanilic acid) Bilirubin + DSA + accelerator (caffeine) —> total azobilirubin

Tiến trình: Mẫu: Huyếtthanh chuột

Đo đối chiếu với mẫu trắng

Bước sĩng 346 nm

Trang 36

Nhiệt độ 250C Thuốc thử: Bộ kít định lượng của Human Co (Germany), gồm:

TBR: Sulphanili acid: 14 mmoll Hydrochloric acid: 300 mmol/l

Caffeine (accel erator): 200 mmol/l Sodium benzoate: 420 mmol/l TNR: Sodium nitrite: 390 mmol/l Quy trình: Bang 23: Mẫu trắng Mẫu thử TBR 1000 jul 1000 jul TNR - 40 ul Tron kỹ, ủ 5 phút Mẫu thử 100 yl 100 yl - Đánh giá kết quả

Các số liệu được biểu thị bằng số trung bình + SEM (Standard Error of the Mean:

sai số chuẩn của giá trị trung bình) và được xử lý thống kê bằng phần mềm Tandel

Scientific Sigma-Stat 98 theo phép kiém One-way ANOVA với độ tin cậy là 95% (P < 0,05)

2.2.2.2- Thir tie dung chong vid gan mun

+ Nguyên vật liệu: Các chế phẩm flavonoid tir 14 ban tron, cao nước lá muỗng trâu và cao nước bài thuốc số 2

+ Động vật thí nghiệm: Chuột cống trắng, trọng lượng từ 80 - 100g, sử dụng cả chuột đực và chuột cái, là những chuột khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

+ Kủ định lượng GOT; GPT; Bilirubin do hãng Human cung cấp

+ Các hố chất:

- Dung địch Trs 02M

Trang 37

- Dung dịch đệm tris (pH8.3): 12.5 mlTrí 0.2M và 20ml HCL 0.1N - Dung dịch Aeid trieloracetie 309

- Dung dịch Aeid thiobarbiturie 0.8% - Dung dịch H2O2 6% - Dung dịch H2SO4 3N - Dung dịch CuSO4 0.01M - Dung dịch P.DAB 5% (Para Dimetyl Amino Benzaldehyt) - Dung dịch HCL ON

- Dung dich NaOH 2.5N

- Dung dich Formaldehyt 10%

-Máy định lượng sinh hố bán tự động Seout

-Máy nghiền đồng thể IKA

-Máy quang kế UV- VIS - Speetrophotometer 1240 - Shimadzu

~ Máy ly tâm lạnh

-Mặt kính đồng hé ¿ 10 em -Bếp cách thuỷ

+ Phương pháp thí nghiệm:

-Gây xơ gan theo phương pháp của Maros và CS [33]: tiêm phúc mạc dung địch CCl, pha

lỗng trong dầu olive và tiêm kéo đài trong 3 tháng để tăng quá trình tổng hợp colagen và tích tụ colagen ở tổ chức gan

-Định lượng colagen trong gan theo phương pháp Neuman và Logan -Định lượng MDA: theo phương pháp Yoshika và CS

-Mơ tả phương pháp thí nghiệm:

Chuột thí nghiệm mua về được nuơi tại nhà chăn nuơi vài ngày trước khi thí nghiệm

Chia chuột 1 cách ngẫu nhiên thành 4 lơ thí nghiệm: 1 lơ chứng sinh lý, 1 lơ chứng gây xơ

gan và 2 lơ thử thuốc

Trang 38

+ Tháng thứ 1: gây xơ cho tất cả chuột thí nghiệm bằng cách tiêm tiêm phúc mạc, tiêm 2

lần/1 tuần với liều 02 mÌ dung địch CCl, 30% trong đầu olive/100g chuột Lơ chứng sinh lý tiêm dung địch dầu olive với liều 0,2ml dầu/100g chuột, cũng với 2 lần/1 tuần

+ Tháng thứ 2 và thứ 3: Các lơ thí nghiệm vẫn tiêm như trên đồng thời bắt đầu cho các lơ thử thuốc uống các chế phẩm thuốc thử; các lơ chứng uống nước với cùng thể tích uống của các lỗ thử thuốc

+ Hết tháng thứ 3: Cắt động mạch cổ lấy máu định lượng các enzym GOT; GPT;

Bilirubin trong huyết thanh và lấy gan định lượng MDA và colagen 2.2.2.3-Tée dung tot mật

+ Nguyên vật liệu: Các chế phẩm flavonoid từ lá ban trịn, cao nước lá muỗng trâu và cao

nước bài thuốc số 2

+Đậng vật thí nghiệm: Chuột nhất trắng trưởng thành, khoẻ mạnh, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, trọng lượng 22 - 25 g, do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp, sử dụng cả chuột đực và

chuột cái

+ Ether gây mê

+ Kim, chỉ khâu vơ trùng

+ Bộ đồ mỗ vơ trùng

+ Cân phân tích cĩ độ chính xác 10%

+Phwong pháp: Ap dụng phương pháp của Rudi (1977) [63]

Phương pháp này dùng để xác định khối lượng mật sinh ra được giữ lại trong túi mật

trong 1 thời gian nhất định Nếu lượng mật của lơ thử thuốc lớn hơn lượng mật của lơ đối

chứng thì thuốc thử được đánh giá là cĩ tác dụng tăng sinh mật

Mơ tả phương pháp:

Chuột mới mua về, được nuơi tại nhà chăn nuơi 3 ngày trước khi thí nghiệm Chia chuột

một cách ngẫu nhiên thành 4 lơ: 1 lơ đối chứng và 3 lơ thử thuốc với 3 mẫu thử khác nhau Ngày thứ 1 và 2: Cho chuột lơ thuốc uống thuốc với liều tương ứng và chuột lơ chứng uống nước với thể tích tương đương lỗ thuốc

Trang 39

Ngày thứ 3: Cho chuột lơ thuốc uống thuốc và chuột lơ chứng uống nước Sau 30 phút ud:

g, gây mê nhẹ cho từng chuột của các lơ bằng ether Khi chuột đã mê, mé bụng, thắt ống mật chủ để mật sinh ra khơng đổ vào tá tràng mà chỉ được giữ lại trong túi mật và khâu đĩng vết mỗ Sau 30 phút thất ống mật chủ, giết chuột bằng cloroform, mé bung,

bĩc tách túi mật và cân tươi ngay từng túi mật sẽ được trọng lượng tồn túi m1 (mg), rạch

túi mật thấm tat cả dịch mật trong túi mật trên giấy lọc, cân ngay lại vỏ túi mật m2 (mg)

Khối lượng mật trong từng túi mật sẽ là m (mg) = m1 (mg) - m2 (mg)

Quy lượng mật cho 100 g trọng lượng chuột

So sánh khối lượng mật trung bình của lơ chứng với lơ thử thuốc Kết quả thí nghiệm được sử lý theo phương pháp thống kê dùng trong sinh học t - Studen Sử dụng phần mềm

Microsoft - Exeel [17]

3.2.2.4- Phương pháp thủ tác đụng chống viêm mạn [42

+ Nguyên vật liệu: Các chế phẩm flavonoid từ lá ban trịn, cao nước lá muỗng trâu và cao nước bài thuốc số 2

+ Thuấc tham chiếu: Viên prednisolon của Đức sản xuất, hàm lượng 5mg/viên, liều uống

trên chuột là 5mg/kg

+ Động vật thí nghiệm: Chuột cơng trắng trưởng thành, khoẻ mạnh đạt tiêu chuẩn thí

nghiệm, trọng lượng 100 ~ 120 g, cả chuột đực và chuột cái + Ether gây mê, cloroform dược dụng + Amian tiệt trùng + Cân phân tích, độ chính xác 10” + Dụng cụ mễ + Bơm tiêm đầu tù v.v

+ Phương pháp thí ghiệm: Áp dụng phương pháp của Flandre và cộng su Gay 6 viêm

thực nghiệm bằng cách cấy hạt Amian đã tiệt trùng duéi da lung của chuột

+Mơ tả phương pháp thí nghiệm :

Trang 40

Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 5 lơ: 1 lơ đối chứng; 1 lơ tham chiếu và 3 lỗ

thử thuốc với 3 mẫu thử khác nhau

Ngày thứ 1: Gây viêm cho tất cả chuột bằng cách gây mê nhẹ cho chuột bằng ether, khi

chuột đã mê, cấy viên amian đã được về trịn và chặt vào dưới da lưng chuột Mỗi viên cĩ

trọng lượng 30 mg và đã được sấy tiệt trùng & 120°C/ 2 gid Phẫu thuật được tiến hành

trong điều kiện bán vơ trùng Ngay sau khi gây viêm, chuột thí nghiệm được uống thuốc (ếc lơ thử thuốc) và uống nước (lơ chứng), đồng thời lỗ tham chiếu uống prednisolon, tất cả chuột thí nghiệm được uống liền trong 5 ngày Chiều ngày thứ 5 làm chết chuột bing

Cloroform, bĩc tách ổ viêm và cân từng ỗ viêm khi cịn tươi

Nếu thuốc

So sánh trọng lượng trung bình ổ viêm giữa lơ đối chứng và các lơ thử thuố

cĩ tác dụng chống viêm mạn thì trọng lượng ổ viêm của các lơ thử thuốc sẽ nhỏ hon 16

đối chứng gây viêm

2.2.3- Phương pháp thử: độc tính:

2.2.3.1- Thủ độc tính cấp vù xác định LD¡; của chế phim flavonoid ban tron

* Nguyên vật liệu thí nghiệm:

- Mẫu thử: Chế phẩm flavonoid ban trịn (Bột Hypatin)

- Động vật thí nghiệm: Chuột nhất trắng cĩ trọng lượng 20-22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp

* Phương pháp thí nghĩệ

-Phương pháp nghiên cứu: Thử theo hướng dẫn khảo sát độc tính cấp (ban hành kèm theo

Quyết định 371 BY T/QĐ ngày 12/3/1996) của Bộ Y tế và các tài liệu về phương pháp thử

độc tính cấp của thuốc [8, 16, 22] -Tiấn hành thí nghiệm

Trước khi thí nghiệm, chuột đã được nhịn đĩi 12 giờ và được uống nước tuỳ thích

Đường dùng thuốc: Đường uống, cho chuột uống bằng cách dùng bơm tiêm cĩ kim cong

đầu tù để đưa thuốc thử một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột

Chế phẩm flavonoid được pha trong nước với nồng độ thích hợp để cĩ thể bơm trực tiếp

vào đạ đầy chuột

Định dạng
Số trang	144
Dung lượng	17,94 MB