Nghiên cứu bào chế thuốc bột từ bài thuốc hỗ trợ điều trị thoái hóa cột sống của lương y nguyễn thiện chung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU MAI LYNH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC BỘT TỪ BÀI THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ THOÁI HOÁ CỘT SỐNG CỦA LƯƠNG Y NGUYỄN THIỆN CHUNG LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỮU MAI LYNH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC BỘT TỪ BÀI THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ THOÁI HOÁ CỘT SỐNG CỦA LƯƠNG Y NGUYỄN THIỆN CHUNG NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HẠNH PGS.TS PHAN THANH DŨNG TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc bột từ thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung” cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Đức Hạnh PGS.TS Phan Thanh Dũng Các số liệu, kết đề tài trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Nguyễn Hữu Mai Lynh TÓM TẮT Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2020 – 2022 Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm bào Bào chế thuốc Mã số: 8720202 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC BỘT TỪ BÀI THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ THOÁI HOÁ CỘT SỐNG CỦA LƯƠNG Y NGUYỄN THIỆN CHUNG Nguyễn Hữu Mai Lynh Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Đức Hạnh PGS.TS Phan Thanh Dũng Đặt vấn đề Cao khô sấy phun từ thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung (BT) chứng minh tính an toàn hiệu giảm đau, kháng viêm Cao khơ BT có liều điều trị hiệu người 5- g/ngày Đề tài thực nhằm mục tiêu “Nghiên cứu bào chế thuốc bột từ BT hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung” Đối tượng phương pháp nghiên cứu Cao khơ BT kiểm nghiệm theo TCCS Hình dạng kích thước hạt cao khơ BT xác định kính hiển vi điện tử quét (SEM) Công thức thuốc bột BT xây dựng dựa khả cải thiện lưu tính cao khơ BT phối hợp với tá dược Khảo sát khả cải thiện lưu tính cao khơ BT sử dụng tá dược độn dextrose (DEX), maltodextrin (MAL), sucrose đồng kết tinh (CCS), sucrose phun sấy (SDS) tỷ lệ đơn lẻ phối hợp khác Thuốc cốm BT bào chế phương pháp xát hạt ướt sử dụng tá dược MAL Lưu tính thời gian hòa tan thuốc cốm BT so sánh với thuốc bột BT Quy trình định lượng chất điểm acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC xây dựng thẩm định theo hướng dẫn ICH Tiêu chuẩn sở (TCCS) thuốc bột BT xây dựng đề xuất dựa kết kiểm nghiệm 03 lô thuốc bột BT Độ ổn định thuốc bột sơ khảo sát điều kiện bảo quản (ĐKBQ) dài hạn (nhiệt độ 30 ± oC, độ ẩm 75 ± 5%) ĐKBQ cấp tốc (nhiệt độ 40 ± oC, độ ẩm 75 ± 5%) 03 tháng Kết Cao khơ BT đạt u cầu TCCS Cao khơ BT có tiểu phân hình cầu gần cầu, kích thước 20 – 50 µm, lưu tính mức Cơng thức thuốc bột BT với tỷ lệ 30% cao khô BT 70% hỗn hợp tá dược dextrose maltodextrin (tỷ lệ 8:2 (kl/kl)) chứng minh có khả cải thiện lưu tính cao khơ BT tốt, tỷ lệ cao khơ BT lớn có thời gian hịa tan ngắn thuốc cốm BT Công thức thuốc bột BT chọn gồm cao khô BT:DEX:MAL với tỷ lệ 30:56:14 Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC đạt yêu cầu thẩm định tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ TCCS thuốc bột BT xây dựng với tiêu chí cảm quan, độ ẩm, giới hạn vi sinh vật, định tính định lượng Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT 03 tháng cho thấy thuốc bột BT đạt yêu cầu TCCS cảm quan, độ ẩm, định tính định lượng ĐKBQ dài hạn ĐKBQ cấp tốc Kết luận Đề tài xây dựng thành cơng cơng thức, quy trình bào chế TCCS thuốc bột BT Kết nghiên cứu làm tiền đề cho việc phát triển hoàn thiện sản phẩm thuốc bột BT Từ khoá: thuốc bột, định lượng acid asperulosidic, độ ổn định, thuốc hỗ trợ điều trị thối hóa cột sống ABSTRACT Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2020 – 2022 Speciality: Pharmaceutical technology and pharmaceutic Code: 8720202 STUDY ON PREPATION OF POWDER FROM SPINAL DEGENERATION REMEDY OF PHYSICIAN NGUYEN THIEN CHUNG Nguyen Huu Mai Lynh Instructor: Assoc Prof Ph.D Nguyen Duc Hanh Assoc Prof Ph.D Phan Thanh Dung Introduction Spray-dried extract from spinal degeneration remedy of physician Nguyen Thien Chung (BT) has been demonstrated its safety and effectiveness in analgesic, antiinflammatory treatment The spray-dried extract from BT has an effective dose of 5-6 g/day This study aimed at developing the powder from spinal degeneration remedy of physician Nguyen Thien Chung Materials and methods The spray-dried BT extract was evaluated their quality based on its In-house specification The shape and particle size of the spray-dried BT extract were determined by scanning electron microscopy method The powder’s formulation was developed based on the improvement of the flowability of the spray-dried BT extract using suitable fillers The effects of each filler (DEX, MAL, CCS, SDS) at different ratios and mixtures of fillers at different ratios in combination with spray-dried BT extract on the flowability of the powder were investigated BT granules were prepared by wet granulation method using MAL as filler The flowability and the dissolving time of BT granules were compared with those of the BT powder The quantitative method of asperulosidic acid in BT powder was developed and validated according to ICH guideline Based on the analysis results of 03 batches of BT powder, the Inhouse specification of BT powder was proposed The stability of the BT powder was investigated under long-term storage conditions (temperature of 30 ± oC, humidity of 75 ± 5%) and accelerated storage conditions (temperature of 40 ± oC, humidity of 75 ± 5%) for 03 months Result The spray-dried BT extract met the requirements of its In-house specification The spray-dried BT extract’s particles possessed the spherical or nearly spherical shape, small size (20 – 50 µm) and very poor flowability The BT powder formulation including 30% spray-dried BT extract and 70% mixture of dextrose and maltodextrin (ratio 8:2) has been proved to possess the suitable flowability with a high ratio of spray-dried BT extract and shorter dissolving time than BT granules The HPLC quantitative method of asperulosidic acid in BT powder was validated for system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy The In-house specification of the BT powder was established with the criteria of organoleptic, moisture content, microbial limits, qualitative and quantitative analysis The results of the stability tests showed that the BT powder’s organoleptic, moisture content, qualitative and quantitative results met the requirements of the In-house Specification under longterm storage conditions and accelerated storage conditions for 03 months Conclusion The BT powder formulation, preparation process and In-house Specification were successfully established The results could be useful for futher study on development of BT powder Keywords: powder, quantitative method of asperulosidic acid, stability, spinal degeneration remedy i MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1.  TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.  TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ THOÁI HOÁ CỘT SỐNG CỦA LƯƠNG Y NGUYỄN THIỆN CHUNG 1.1.1.  Giới thiệu thuốc 1.1.2.  Tác dụng dược lý 1.1.3.  Công dụng cách dùng .4 1.1.4.  Tổng quan acid asperulosidic 1.1.5.  TCCS cao khô BT 1.2.  THUỐC BỘT 1.2.1.  Ưu, nhược điểm thuốc bột 1.2.2.  Yêu cầu chất lượng chung thuốc bột 1.2.3.  Một số nghiên cứu thuốc bột có nguồn gốc từ dược liệu 1.2.4.  Các yếu tố ảnh hưởng đến lưu tính khối bột 11 1.3.  ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC .12 1.3.1.  Yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định .12 1.3.2.  Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định 12 1.3.3.  Xác định độ ổn định thuốc .13 1.3.4.  Thử nghiệm độ ổn định thuốc vùng IVb 14 1.3.5.  Một số nghiên cứu độ ổn định thuốc bột dược liệu 15 1.4.  TỔNG QUAN VỀ TÁ DƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 15 1.4.1.  Dextrose 15 1.4.2.  Maltodextrin 16 1.4.3.  Sucrose đồng kết tinh 17 1.4.4.  Sucrose sấy phun 17 ii CHƯƠNG 2.  ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1.  HÓA CHẤT – THIẾT BỊ 18 2.1.1.  Nguyên liệu – hố chất – dung mơi 18 2.1.2.  Thiết bị 19 2.2.  PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.2.1.  Kiểm nghiệm cao khô BT theo TCCS 20 2.2.2.  Xây dựng cơng thức quy trình bào chế thuốc bột chứa cao khô BT 20 2.2.3.  Xây dựng TCCS thuốc bột BT .23 2.2.4.  Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT .32 CHƯƠNG 3.  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1.  KIỂM NGHIỆM CAO KHÔ BT THEO TCCS 33 3.2.  XÂY DỰNG CÔNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ THUỐC BỘT CHỨA CAO KHÔ BT 35 3.2.1.  Kết khảo sát tính chất cao khô BT 35 3.2.2.  Kết khảo sát ảnh hưởng tá dược độn lên lưu tính cao khơ BT 37 3.2.3.  Quy trình bào chế thuốc bột BT quy mô kg 49 3.2.4.  So sánh lưu tính thời gian hịa tan thuốc bột BT thuốc cốm BT 50 3.3.  XÂY DỰNG TCCS CỦA THUỐC BỘT BT .52 3.3.1.  Xây dựng thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT 52 3.3.2.  Xây dựng TCCS thuốc bột BT .62 3.4.  SƠ BỘ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC BỘT BT 66 3.4.1.  Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc 68 3.4.2.  Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn 71 iii 3.4.3.  Ước tính tuổi thọ thuốc bột BT 74 CHƯƠNG 4.  BÀN LUẬN .78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO 84 PHỤ LỤC PL-1 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên AO 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic Ý nghĩa acid 28-O--D-glucopyranosyl ester BT Bài thuốc hỗ trợ điều trị thoái hóa cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung BVTV Bảo vệ thực vật BuOH n- Butanol CCS Co-crystallized sucrose DĐVN Sucrose đồng kết tinh Dược điển Việt Nam DEX Dextrose ĐKBQ Điều kiện bảo quản DMSO Dimethyl sulfoxide EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu cao Chromatography ICH International Conference on Hội nghị quốc tế hài Harmonization hồ hố kl/kl Khối lượng/ khối lượng KLTB Khối lượng trung bình LAC Lactose monohydrate LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng MAL Maltodextrin MeOH Methanol v PL Phụ lục PVP Polyvinylpyrrolidone RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SDS Spray-dried sucrose Sucrose phun sấy SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét SKLM Sắc ký lớp mỏng TCCS Tiêu chuẩn sở tt Thể tích vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.  TCCS cao khô BT Bảng 1.2.  Một số chế phẩm thuốc bột thị trường 10 Bảng 1.3.  ĐKBQ cấp tốc .13 Bảng 1.4.  ĐKBQ tần số thử nghiệm độ ổn định vùng IVb 14 Bảng 2.1.  Các dược liệu chất đối chiếu nghiên cứu 18 Bảng 2.2.  Tá dược nghiên cứu 18 Bảng 2.3.  Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.4.  Các mức đánh giá khả chảy bột .21 Bảng 2.5.  Thành phần công thức thuốc cốm BT khảo sát .22 Bảng 2.6.  Chương trình pha động khảo sát quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT .25 Bảng 2.7.  Nồng độ acid asperulosidic khảo sát tính tuyến tính .27 Bảng 2.8.  Độ lặp lại độ hồi phục chấp nhận nồng độ khác 28 Bảng 3.1.  Kết kiểm nghiệm cao khô BT theo TCCS 35 Bảng 3.2.  Các số lưu tính cao khơ BT (n = 3) 36 Bảng 3.3.  Kích thước khối lượng riêng cao khơ BT tá dược sử dụng nghiên cứu 37 Bảng 3.4.  Lưu tính cơng thức phối hợp cao khô BT tá dược độn riêng lẻ (n = 3) 38 Bảng 3.5.  Lưu tính công thức phối hợp cao khô BT hỗn hợp tá dược độn công thức A13 – A21 (n = 3) .44 Bảng 3.6.  So sánh số lưu tính công thức A14, A5 A22 (n = 3) .48 Bảng 3.7.  Công thức thuốc bột BT chọn 49 Bảng 3.8.  Phân bố kích thước hạt thuốc cốm BT B24, B25 (n = 3) .51 Bảng 3.9.  So sánh số lưu tính cơng thức A22, B24 B25 (n = 3) 51 Bảng 3.10.  Thời gian hòa tan thuốc bột BT A22 thuốc cốm BT B24, B25 (n = 3) 52 vii Bảng 3.11.  Hàm lượng acid asperulosidic thuốc bột BT với tỉ lệ khối lượng thuốc bột BT: thể tích methanol khảo sát khác 54 Bảng 3.12.  Tính tương thích hệ thống quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT .56 Bảng 3.13.  Tương quan diện tích pic nồng độ acid asperulosidic 58 Bảng 3.14.  Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT 59 Bảng 3.15.  Kết xác định nồng độ giới hạn LOD 59 Bảng 3.16.  Độ lặp lại quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT 60 Bảng 3.17.  Độ phương pháp định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT 61 Bảng 3.18.  Độ ẩm 03 lô thuốc bột BT 63 Bảng 3.19.  Giới hạn nhiễm khuẩn 03 lô thuốc bột BT .63 Bảng 3.20.  Độ đồng khối lượng 03 lô thuốc bột BT 64 Bảng 3.21.  Hàm lượng acid asperulosidic 03 lô thuốc bột BT 66 Bảng 3.22.  Dự thảo TCCS thuốc bột BT 67 Bảng 3.23.  Độ ẩm thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc 69 Bảng 3.24.  Kết định lượng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc 71 Bảng 3.25.  Độ ẩm thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn 72 Bảng 3.26.  Kết định lượng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn 74 Bảng 3.27.  Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc 74 Bảng 3.28.  Kết sơ nghiên cứu độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn ĐKBQ cấp tốc 03 tháng 75 Bảng 3.29.  Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính Ln[D%] theo thời gian 76 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.  Cấu trúc hố học acid asperulosidic Hình 1.2.  Hình chụp SEM tá dược DEX (JRS Pharma) 16 Hình 1.3.  Hình chụp SEM tá dược MAL (Roquette) .16 Hình 1.4.  Hình chụp ESEM tá dược CCS (Domino Foods, Inc.) 17 Hình 1.5.  Hình chụp SEM tá dược SDS (Tereos) 17 Hình 2.1.  Quy trình bào chế thuốc cốm BT 22 Hình 3.1.  Hình chụp cao khơ BT 33 Hình 3.2.  SKLM định tính dược liệu Râu mèo cao khơ BT 33 Hình 3.3.  SKLM định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng cao khô BT 34 Hình 3.4.  SKLM định tính dược liệu Mía dị cao khơ BT 34 Hình 3.5.  Hình SEM mẫu cao khơ BT độ phóng đại (A) x500, (B) x1000, (C) x2000, (D) x5000 36 Hình 3.6.  Tương quan khối lượng riêng trước gõ tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) 39 Hình 3.7.  Tương quan tỷ số Hausner tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) 40 Hình 3.8.  Tương quan số nén tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) 40 Hình 3.9.  Tương quan tốc độ chảy tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) 41 Hình 3.10.  Tương quan góc nghỉ tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) 42 Hình 3.11.  Biểu đồ so sánh tỷ số Hausner công thức A3, A6, A9, A12, A13 – A21 (n = 3) 43 Hình 3.12.  Biểu đồ so sánh tốc độ chảy công thức A3, A6, A9, A12, A13 –A21 (n = 3) 45 Hình 3.13.  Biểu đồ so sánh góc nghỉ công thức A3, A6, A9, A12, A13 – A21 (n = 3) 47 ix Hình 3.14.  Quy trình bào chế thuốc bột BT quy mơ kg .49 Hình 3.15.  Hình chụp cốm BT cơng thức B24, B25 .50 Hình 3.16.  SKLM phân tích mẫu thử thuốc bột BT chuẩn bị dung môi khác .53 Hình 3.17.  Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thuốc bột BT với điều kiện sắc ký khảo sát 54 Hình 3.18.  Sắc ký đồ HPLC khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT (tR acid asperulosidic khoảng 10,5 phút) .57 Hình 3.19.  Độ tinh khiết pic acid asperulosidic (a) mẫu đối chiếu (b) mẫu thử 57 Hình 3.20.  Tương quan diện tích pic nồng độ acid asperulosidic 58 Hình 3.21.  Hình chụp 03 lơ thuốc bột BT .62 Hình 3.22.  SKLM định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng thuốc bột BT .65 Hình 3.23.  SKLM định tính dược liệu Râu mèo thuốc bột BT 65 Hình 3.24.  SKLM định tính dược liệu Mía dị thuốc bột BT 65 Hình 3.25.  Mặt trước (A) mặt sau (B) bao bì cấp thuốc bột BT .68 Hình 3.26.  Thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc 68 Hình 3.27.  Kết định tính dược liệu Râu mèo thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc 69 Hình 3.28.  Kết định tính dược liệu Mía dị thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc 70 Hình 3.29.  Kết định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc .70 Hình 3.30.  Hình chụp thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn 71 Hình 3.31.  Kết định tính dược liệu Râu mèo thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn 72 Hình 3.32.  Kết định tính dược liệu Mía dị thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn 73 x Hình 3.33.  Kết định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn .73 Hình 3.34.  Đường biểu diễn Ln[D%] theo thời gian 76 MỞ ĐẦU Dược phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên từ thuốc dân gian sử dụng để điều trị bệnh trở thành xu hướng phổ biến với ưu điểm an tồn, tác dụng phụ sử dụng lâu dài1,2 Bài thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung gồm 13 dược liệu, chứng minh tính an tồn, có tác dụng giảm đau, kháng viêm3 Lương y Nguyễn Thiện Chung dùng điều trị thành công bệnh thối hóa cột sống cho nhiều bệnh nhân tỉnh An Giang Cao khơ BT hỗ trợ điều trị thối hoá cột sống nghiên cứu bào chế xây dựng tiêu chuẩn sở4 với liều điều trị hiệu người 5- g/ngày Một dạng bào chế thích hợp cho thuốc có liều dùng cao đường uống dạng thuốc bột Thuốc bột có ưu điểm thời gian bảo quản lâu, tiện dụng dễ mang theo lại Bên cạnh đó, kỹ thuật bào chế thuốc bột đơn giản, khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp, dễ vận chuyển Vì vậy, việc phát triển sản phẩm thuốc bột dùng đường uống từ cao khô BT dự kiến đáp ứng nhu cầu người dùng thị trường Tuy nhiên, việc sản xuất thuốc bột từ cao khơ cịn gặp số khó khăn cao khơ có kích thước hạt nhỏ, khối lượng riêng nhỏ5 dẫn đến lưu tính gây khó khăn việc đóng gói sản xuất… Nhằm kiểm sốt yếu tố trên, việc lựa chọn loại tá dược với tỷ lệ thích hợp quan trọng sản xuất sản phẩm thuốc bột Để kiểm soát chất lượng độ ổn định sản phẩm, tiêu chuẩn sở thuốc bột thuốc cần xây dựng Bên cạnh đó, nghiên cứu độ ổn định sản phẩm đóng vai trò quan trọng cần thiết việc xác định thời hạn sử dụng sản phẩm đảm bảo chất lượng sản phẩm6 Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc bột từ thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung” thực với nội dung cụ thể sau: - Xây dựng cơng thức quy trình bào chế thuốc bột từ cao khơ thuốc hỗ trợ điều trị thối hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung - Xây dựng TCCS thuốc bột thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung - Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ BÀI THUỐC HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ THOÁI HOÁ CỘT SỐNG CỦA LƯƠNG Y NGUYỄN THIỆN CHUNG 1.1.1 Giới thiệu thuốc Bài thuốc hỗ trợ điều trị thoái hoá cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung (BT) gồm 13 dược liệu: Mã đề, Cối xay, Cỏ tranh, Dây mãng bát, Râu mèo, Ý dĩ, Cỏ xước, Nhàu, Đủng đỉnh, Mía dị, Rau bợ, Mướp gai, Đinh lăng xẻ Các dược liệu vị thuốc BT gồm Nhàu (vị “Quân”), Đủng đỉnh (vị “Thần”), Đinh lăng xẻ (vị “Thần”) Râu mèo (vị “Thần”)7 BT Lương y Nguyễn Thiện Chung sử dụng hỗ trợ điều trị thành cơng bệnh thối hóa cột sống lưng, lợi thủy, sỏi thận tỉnh An Giang tỉnh lân cận3,7,8 Cao khô sấy phun nghiên cứu chiết xuất từ BT với dung môi nước 100 oC, tỷ lệ dược liệu: dung môi 1:12 (kl/tt) Dịch chiết lọc, cô áp suất giảm sấy phun thu cao khô BT3 1.1.2 Tác dụng dược lý Nghiên cứu Nguyễn Cao Sang cộng năm 2020 chứng minh cao khô BT liều 1,26 g/kg liều 2,52 g/kg có tác dụng giảm đau, kháng viêm chuột cụ thể sau: 1.1.2.1 Tác dụng giảm đau ngoại biên Tác động giảm đau ngoại biên chuột khảo sát cách cho chuột đau quặn bụng acid acetic9 Thời gian đau quặn bụng chuột ghi nhận 05 phút 40 phút sau tiêm acid acetic Thời gian đau quặn bụng 40 phút giảm chuột cho uống cao khô BT Lô chuột cho uống cao khô BT có thời gian đau quặn bụng thấp lơ chứng bệnh (lô chuột cho uống nước cất) suốt khoảng thời gian theo dõi Mức độ giảm tổng thời gian đau 40 phút giảm dần theo thứ tự: lô diclofenac liều 7,5 mg/kg (75%) > cao khô BT liều 1,26 g/kg (57%) > cao khô BT liều 2,52 g/kg (53%)3 1.1.2.2 Tác dụng kháng viêm cấp Tác động kháng viêm cấp chuột khảo sát mơ hình gây phù bàn chân chuột carrageenan10 Đo thể tích chân chuột sau gây viêm 1, 3, 5, 24, 48, 72, 96, 120, 144 Sau đo thể tích 24, 48, 72, 96 120 giờ, chuột cho uống diclofenac, cao khô BT liều 2,52 g/kg liều 1,26 g/kg (1 lần/ngày) Cao khô BT liều 2,52 g/kg thể tác động kháng viêm cấp chuột nhắt với mức độ giảm viêm khoảng 24 - 77%; mức độ giảm viêm cao khô BT liều 2,52 g/kg không khác biệt so với mức độ giảm viêm diclofenac liều 7,5 mg/kg (37 – 86%) (p > 0,05) Cao khô BT liều 1,26 g/kg (mức độ giảm viêm khoảng 15 – 62%) thể tác động kháng viêm cấp chậm, so với diclofenac liều 7,5 mg/kg Mức độ giảm sưng phù bàn chân chuột nhóm uống cao khô BT tăng dần theo thời gian3 1.1.2.3 Tác dụng kháng viêm mạn Tác động kháng viêm mạn chuột nhắt khảo sát cách gây u hạt chuột cotton11 Tác động kháng viêm mạn đánh giá % giảm khối lượng u hạt lô thử so với lô chứng bệnh Cao khô BT liều 1,26 g/kg thể tác động kháng viêm mạn chuột nhắt Cao khô liều 2,52 g/kg làm giảm khối lượng u hạt ướt u hạt khô so với lô chứng bệnh Tùy vào loại u hạt ướt hay u hạt khô, mức độ giảm khối lượng u giảm dần theo thứ tự: lô diclofenac liều 7,5 mg/kg (40 – 55%), cao khô BT liều 1,26 g/kg (28 – 31%), cao khô BT liều 2,52 g/kg (17 – 18%)3 1.1.3 Công dụng cách dùng Theo Lương y Nguyễn Thiện Chung ngồi cơng dụng giảm đau, kháng viêm chứng minh, BT dùng với tác dụng lợi thuỷ, trị sỏi thận Liều dùng người lớn (khoảng 60 kg) thang (144 g dược liệu khô) tương ứng với g cao khô BT/ngày3 1.1.4 Tổng quan acid asperulosidic Acid asperulosidic (Hình 1.1) chất điểm BT, phân lập từ dược liệu Nhàu (vị “Quân” BT) sử dụng để kiểm nghiệm tiêu chí định tính định lượng TCCS cao khơ BT7,8,12 Hình 1.1 Cấu trúc hố học acid asperulosidic Tính chất vật lý: bột trắng vơ định hình Phân tử lượng: 432,4 g/mol Độ tan: tan DMSO, pyridin, methanol, ethanol, … Tác dụng dược lý acid asperulosidic: có tác dụng kháng viêm cách làm giảm sản xuất oxid nitric (NO), prostaglandin E2 (PGE2), yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) ức chế synthase oxid cảm ứng (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) với chế giảm biểu chất trung gian gây viêm cytokine tiền viêm thông qua ức chế tín hiệu yếu tố nhân kappa B (NF-kB) MAPK (mitogen-activated protein kinases)13 1.1.5 TCCS cao khô BT Phạm Ngọc Thạc cộng (2021) nghiên cứu xây dựng TCCS cao khơ BT với tiêu chí trình bày Bảng 1.1 Phụ lục Bảng 1.1 TCCS cao khô BT STT Phương pháp thử Đánh giá cảm Cảm quan quan Tiến hành theo Độ ẩm DĐVN V, PL 9.6, tr PL-203 Tiến hành theo Giới hạn DĐVN V, phụ kim loại lục 9.4.8, nặng phương pháp Chỉ tiêu Mức chất lượng Cao dạng bột mịn, đồng nhất, màu nâu, mùi dược liệu, dễ hút ẩm Không 5% Không 20 ppm Tổng số vi sinh vật hiếu khí: Khơng q 104 cfu/g Tổng số nấm men – mốc: Không Giới hạn Tiến hành theo 102 cfu/g nhiễm DĐVN V, PL Escherichia coli, Staphylococcus aureus: khuẩn 13.6, tr PL-300 Khơng có g Salmonella: Khơng có 10 g Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật: Không 102 cfu/g Tiến hành theo Dư lượng phương pháp hóa chất Khơng phát thuốc bảo vệ thực vật BS EN bảo vệ 15662:2017 thực vật mod.(GC-MS) Trên sắc ký đồ mẫu thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết Định tính SKLM Định lượng HPLC chất đối chiếu acid asperulosidic, sinensetin, 3-O--D-glucopyranosyl(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester dược liệu đối chiếu Mía dị Hàm lượng acid asperulosidic khơng thấp 0,20% 1.2 THUỐC BỘT Thuốc bột dạng thuốc rắn, gồm hạt nhỏ, khơ tơi, có độ mịn xác định, có chứa hay nhiều dược chất Ngồi dược chất, thuốc bột cịn thêm tá dược độn, tá dược hút, tá dược màu, tá điều hương, vị… Thuốc bột dùng để uống, để pha tiêm hay dùng ngoài14 1.2.1 Ưu, nhược điểm thuốc bột Ưu điểm: - Kỹ thuật bào chế thuốc bột đơn giản, khơng địi hỏi trang thiết bị phức tạp, dễ đóng gói vận chuyển - Thích hợp cho trẻ em15 - Thuốc bột dạng rắn nên xảy tương kỵ hóa học Do đó, thuốc bột phối hợp nhiều dược chất khác công thức - Chế phẩm dạng rắn bền vững mặt hóa học chế phẩm dạng lỏng - Thuốc bột để uống có tốc độ hồ tan nhanh thuốc viên nén hay viên nang Vì thế, hấp thu dược chất từ thuốc bột nhanh từ thuốc viên nén viên nang tương ứng - Sinh khả dụng cao dạng thuốc rắn khác - Từ hỗn hợp bột bào chế thành thuốc bột phân liều để pha thành dung dịch hay hỗn dịch uống tiêm, thuốc bột dùng ngoài, thuốc bột dùng hít, 16 Nhược điểm - Thuốc bột dễ hút ẩm diện tích tiếp xúc lớn - Thuốc bột khơng thích hợp với dược chất có mùi vị khó chịu, dược chất bị hoạt tính mơi trường dày Thuốc bột từ dược liệu khó uống16 1.2.2 Yêu cầu chất lượng chung thuốc bột Tính chất Quan sát màu sắc mắt thường, ánh sáng tự nhiên với lượng bột vừa đủ, phân tán tờ giấy trắng mịn Bột phải khơ tơi, khơng bị ẩm, vón, màu sắc đồng nhất14 Độ ẩm Xác định độ ẩm thuốc bột theo phương pháp “Xác định khối lượng làm khô” (Phụ lục 9.6, DĐVN V) Thuốc bột không chứa hàm lượng nước 9,0%, trừ dẫn khác14 Độ mịn Nếu khơng có dẫn khác, độ mịn thuốc bột xác định qua phép thử cỡ bột rây (Phụ lục 3.5, DĐVN V) Thuốc bột phải đạt độ mịn quy định chuyên luận14 Độ đồng khối lượng (Phụ lục 11.3, DĐVN V) Những thuốc bột không quy định thử độ đồng hàm lượng phải thử độ đồng khối lượng Nếu thuốc bột chứa nhiều hoạt chất tất dược chất thử độ đồng hàm lượng không thử độ đồng khối lượng14 Định tính định lượng: Theo chuyên luận riêng14 Giới hạn nhiễm khuẩn : Đáp ứng yêu cầu Thử giới hạn nhiễm khuẩn (Phụ lục 13.6, DĐVN V)14 Ghi nhãn: Theo quy định hành Đối với thuốc bột đơn vị đóng gói liều phải ghi tên hàm lượng dược chất Thuốc bột đóng gói nhiều liều phải ghi tên, lượng dược chất tổng khối lượng Trên nhãn phải ghi tên lượng chất bảo quản kháng vi khuẩn, hạn dùng, ĐKBQ14 Bảo quản: Thuốc bột phải bảo quản đồ đựng kín Để nơi khơ mát14 Thuốc bột để uống: Thuốc bột để uống dùng nuốt trực tiếp sử dụng sau hòa tan hay phân tán nước chất lỏng thích hợp Thuốc bột để uống phải đáp ứng yêu cầu chất lượng chung thuốc bột14 1.2.3 Một số nghiên cứu thuốc bột có nguồn gốc từ dược liệu 1.2.3.1 Một số nghiên cứu bào chế thuốc bột có nguồn gốc từ dược liệu Năm 2018, Đặng Thị Yến cộng nghiên cứu thành cơng quy trình sản xuất trà Bụt giấm (Hibiscus sabdariffa Linn.) hòa tan cách cô đặc dịch chiết 90 oC, sau phối trộn với tá dược MAL (tỷ lệ 15%) sấy phun 190 oC Khi tăng tỷ lệ MAL (từ đến 20%), thời gian hòa tan bột Bụt giấm giảm (từ 15,0 giây xuống 6,67 giây) Sau đó, bột Bụt giấm trộn theo tỷ lệ bột Bụt giấm: LAC: bột hương dâu 1:22:6 (kl/kl)17 Nhược điểm cơng trình nghiên cứu lượng hoạt chất thuốc bột thấp (khoảng 3% (kl/kl)) Năm 2019, Đỗ Thị Ngọc Mai cộng nghiên cứu thành cơng quy trình bào chế trà hòa tan từ Sung (Ficus racemosa Linn) cách sao, trích ly, đặc dịch chiết 70 oC, sau phối trộn với tá dược MAL tỷ lệ 25% tiến hành sấy thăng hoa để tạo thành sản phẩm Sản phẩm có khả khả ức chế enzyme αglucosidase, khả kháng oxy hóa với giá trị 54,32 mg/ml 61,48 mg/ml so với nguyên liệu sung đầu vào (khả ức chế enzyme αglucosidase, khả kháng oxy hóa với giá trị 128.6 μg/ml 186.4 μg/ml)18 Năm 2020, Nguyễn Quốc Thịnh cộng nghiên cứu bào chế thành công trà tan từ Hoa hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott) Thảo minh (Senna obtusifolia) Nguyên liệu đầu vào chiết xuất theo phương pháp ngâm lạnh, sau cất hồi lưu dung môi cô cách thủy thành cao đặc Tá dược đường glucose cho vào loại cao, với tỷ lệ cao đặc Hoa hòe: glucose 80:20, tỷ lệ cao đặc Thảo minh: glucose 76:24 Sau đó, bột Hoa hịe bột Thảo minh phối trộn với Sản phẩm có tiêu đạt tiêu chuẩn DĐVN19 Năm 2020, Zehra Tülek cộng nghiên cứu bào chế thành công bột Tía tơ đất (Melissa officinalis L.) Chiết xuất từ Tía tô đất sấy phun hiệu 165 oC Bột hịa tan Tía tơ đất vi bao phương pháp sấy phun với tỷ lệ dịch chiết Tía tơ đất: MAL 1:1 Nhiệt độ khơng khí vào có ảnh hưởng khơng đáng kể (p > 0,05) đến khả chống oxy hóa vi nang Axit phenolic Tía tơ đất bị ảnh hưởng nhẹ điều kiện chiết xuất sấy phun Quá trình chiết xuất sấy phun dẫn đến việc giảm đáng kể lượng chất bay geranial, neral, citronellal caryophyllene20 10 1.2.3.2 Một số chế phẩm thuốc bột thị trường Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc bột thị trường Tên sản Hãng sản phẩm xuất Yu Xing Active Cao Herb Qing Dai Treasure Thành phần Công dụng Liều dùng Diếp cá Thanh nhiệt, giải 1,5 g/lần độc, lợi tiểu x 1-2 lần/ngày Thanh nhiệt, giải 1,5 g/lần of the độc, lương huyết x 1-3 lần/ngày East tiêu ban Thanh đại Thuốc bột Ryukakus Rễ Cát cánh, Trị ho, viêm 300 mg/lần Ryukak- -an rễ Cam thảo, họng x 3-6 lần/ngày 3-5 gói/ngày usan rễ Seneca Snakeroot Acotea QD- Can khương, Đương Hỗ trợ giảm Meliphar quy, Hoàng kỳ, Đảng triệu chứng Sâm, Cam thảo huyết áp thấp 1.2.3.3 Một số nghiên cứu cải thiện lưu tính thuốc bột Năm 2007, TP de Souza cộng nghiên cứu cải thiện lưu tính cao khơ Phyllanthus niruri tăng kích thước hạt thông qua phương pháp xát hạt Cốm Phyllanthus niruri xát hạt Eudragit E (tỷ lệ 10% (kl/kl)) dung mơi aceton (tỷ lệ 12,5% (tt/kl)) Các tính chất thuốc cốm Phyllanthus niruri phụ thuộc vào tỷ lệ Eudragit E công thức Phương pháp cải thiện lưu tính tính hút ẩm cao khơ Phyllanthus niruri21 Tuy nhiên, dung môi xát hạt aceton dễ gây cháy nổ, không phù hợp với quy mô công nghiệp Năm 2014, V Vanhoorne cộng cải thiện số lưu tính cách bao phủ hạt paracetamol phương pháp sấy phun với thông số: tốc độ nguyên liệu vào: 100 g/phút, nhiệt độ khơng khí vào: 240 oC, nhiệt độ khơng khí ra: 112 oC, tốc độ khí: 210 kg/giờ, áp suất khơng khí ngun tử: 0,5 bar Cơng thức với 75% 11 paracetamol, 5% PVP 20% LAC cải thiện kích thước hạt dẫn đến cải thiện lưu tính sản phẩm22 Năm 2016, CJ Etti cộng cải thiện số lưu tính bột dược liệu Labisia pumila, Ortosiphon stamineus, Eurycoma longifolia Andrographis paniculate cách phối hợp với tá dược LAC Các thông số bột dược liệu độ ẩm, kích thước hạt phân bố kích thước hạt bột dược liệu, khối lượng riêng trước sau gõ, số nén tỷ số Hausner đánh giá23 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến lưu tính khối bột Kích thước tiểu phân Kích thước tiểu phân nhỏ, bột mịn làm giảm đáng kể khả chảy bột24,25 Kích thước tiểu phân lớn làm tăng khả chảy bột26,27 Kích thước tiểu phân cịn ảnh hưởng đến độ hồ tan sinh khả dụng thuốc16 Hình dạng tiểu phân Hình dạng tiểu phân ảnh hưởng đến khả trơn chảy lực liên kết khối bột16,28 Tiểu phân hình cầu trơn chảy tốt tiểu phân hình khối bề mặt tiếp xúc tiểu phân hình cầu nhỏ16 Lực liên kết tiểu phân Lực liên kết tiểu phân: bao gồm lực kết dính, lực bám dính lực tĩnh điện Lực kết dính: lực xảy 02 bề mặt giống (tiểu phân-tiểu phân) Bản chất liên kết lực Van der Waals, lực tăng kích thước tiểu phân giảm độ ẩm tương đối khơng khí tăng Lực kết dính tăng, độ trơn chảy giảm16,29 Lực bám dính: lực liên kết xảy bề mặt khác (tiểu phân-thành phễu) Bản chất lực lực kết dính Hiện tượng bám dính xảy bột chảy qua phễu đóng thuốc bột vào bao bì, nên phải dùng tá dược chống dính để khắc phục16 Lực tĩnh điện: trình chảy, bề mặt tiểu phân tích điện, với dược chất ion hóa Lực tĩnh điện làm tăng sức hút liên tiểu phân, làm cho bột khó chảy dễ liên kết hơn16 12 Độ ẩm Trong đa số trường hợp, lưu tính khối bột giảm độ ẩm tăng hình thành cầu nối lỏng tiểu phân30,31 Vì vậy, trình sản xuất độ ẩm phải xác định kiểm soát chặt chẽ 1.3 ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC Độ ổn định thuốc khả nguyên liệu chế phẩm bảo quản điều kiện xác định giữ đặc tính vốn có hố lý, vi sinh, sinh dược học… giới hạn định32 1.3.1 Yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định Độ ổn định thuốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố33, phân chia yếu tố thành 02 nhóm32:  Các yếu tố liên quan đến môi trường: nhiệt độ, độ ẩm34, ánh sáng, hàm lượng oxy với yếu tố bên khác tác động lên thuốc  Các yếu tố liên quan đến thuốc: + Tính chất lý hoá hoạt chất tá dược dùng để bào chế thuốc + Dạng bào chế thuốc + Quy trình sản xuất thuốc + Ngun liệu bao bì, đóng gói35 1.3.2 Tiêu chuẩn đánh giá độ ổn định Độ ổn định hóa học Các tính chất hóa học hoạt chất chế phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng định tính định lượng32 Độ ổn định vật lý Các đặc điểm chế phẩm màu sắc, độ rã, độ hoà tan,… dao động khoảng giới hạn cho phép tiêu chuẩn chất lượng32 Độ ổn định vi sinh Độ vô trùng giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm phải đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn Nếu chế phẩm có chứa chất kháng khuẩn hàm lượng khơng vượt q giới hạn cho phép32 13 Độ ổn định độc tính Độc tính chế phẩm khơng tăng lên suốt trình bảo quản lưu hành thị trường32 1.3.3 Xác định độ ổn định thuốc Khi đánh giá độ ổn định cần xem xét đến yếu tố:  Tính chất đặc điểm dược chất chế phẩm  Vùng khí hậu thuốc lưu hành  Tài liệu công bố liên quan đến độ ổn định thuốc cần nghiên cứu Những yếu tố định số lượng mẫu thử, thời gian tần số thử nghiệm khác nhau32 1.3.3.1 Quy tắc lấy mẫu Với dược chất tương đối ổn định, cần lấy hai mẫu hai lô sản xuất khác Nếu dược chất bền có tài liệu công bố, cần lấy ba mẫu ba lô khác nhau36 Đối với nghiên cứu độ ổn định liên tục quy mô công nghiệp việc lấy mẫu lơ tiến hành theo chương trình định trước, ví dụ36:  Với cơng thức ổn định, hai năm lấy mẫu lô Trong trường hợp ngược lại, năm lấy mẫu lô  Đối với công thức nghiên cứu xong độ ổn định, thường đến năm kiểm tra lại độ ổn định lần 1.3.3.2 Phương pháp thử cấp tốc ĐKBQ cấp tốc phụ thuộc vào vùng khí hậu mà thuốc phân phối sử dụng, tuỳ thuộc vào dạng bào chế thuốc36 Bảng 1.3 ĐKBQ cấp tốc36 Vùng Nhiệt độ (oC) Độ ẩm (%) Thời gian thử (tháng) II (khí hậu nhiệt đới) 40 ± 75 ± IV (khí hậu nóng ẩm) 40 ± 75 ± 14 Với chế phẩm có hoạt chất bền, có tài liệu nghiên cứu cơng bố, thời gian thử kéo dài 03 tháng so với quy định Người nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ cao thời gian ngắn hơn32 Nếu q trình nghiên cứu, chế phẩm có thay đổi tính chất hóa lý, vi sinh cần thực phép thử nghiệm bổ sung điều kiện ôn hoà hơn32 Việc thử cấp tốc thường tiến hành buồng vi khí hậu kiểm sốt nhiệt độ (± 2°C) độ ẩm (± 5%) Một số chế phẩm khơng thích hợp với thử nghiệm cấp tốc như: chế phẩm sinh học, thuốc đạn, thuốc trứng32,… 1.3.3.3 Phương pháp thử dài hạn ĐKBQ dài hạn phải gần với ĐKBQ thực thị trường mà thuốc lưu hành Nghiên cứu độ ổn định dài hạn tiến hành suốt thời hạn bảo quản thuốc Kết thực nghiệm chấp nhận khơng có thay đổi đáng kể tính chất hóa lý, vi sinh, chế phẩm đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn đề ra36 Phương pháp thử dài hạn nhiều thời gian kết đáng tin cậy Phép thử giúp khẳng định tuổi thọ dự tính theo phương pháp thử cấp tốc36 1.3.4 Thử nghiệm độ ổn định thuốc vùng IVb ĐKBQ tần số thử nghiệm độ ổn định vùng IVb thể Bảng 1.4 Bảng 1.4 ĐKBQ tần số thử nghiệm độ ổn định vùng IVb37 ĐKBQ Nhiệt độ, độ ẩm Tần số thử nghiệm Điều kiện dài hạn (cho Nhiệt độ 30 ± oC thành phẩm chứa bao bì Độ ẩm tương đối 75 ± 5% 0, 3, 6, 9, 12, 18, 24 sơ cấp bán thấm nước) tháng, hàng năm cho Điều kiện dài hạn (cho Nhiệt độ 30 ± oC đến hết hạn dùng thành phẩm chứa bao bì Khơng cần rõ độ ẩm đề xuất khơng thấm nước) tương đối Điều kiện cấp tốc Nhiệt độ 40 ± oC Độ ẩm tương đối 75 ± 5% 0, 3, tháng 15 1.3.5 Một số nghiên cứu độ ổn định thuốc bột dược liệu Năm 2010, RF Bott cộng nghiên cứu độ ổn định bột Passiflora alata ĐKBQ khắc nghiệt Các mẫu bảo quản hai nhiệt độ khác (34 45 °C) hai độ ẩm tương đối khác (52 63% RH 34 °C; 52 60% RH 45 °C) vòng 28 ngày (lấy mẫu 04 ngày lần) Kết cho thấy thời hạn sử dụng dao động từ 09 đến 184 ngày, tùy thuộc vào quy trình làm khô ĐKBQ38 Năm 2011, Francini K.J Yatsu cộng nghiên cứu độ ổn định quang học độ ổn định nhiệt bột Ilex paraguariensis Trong thử nghiệm độ ổn định quang học, polyphenol bột Ilex paraguariensis chứng minh ổn định với xạ tia cực tím C 48 Trong thử nghiệm độ ổn định nhiệt, polyphenol có khả hút ẩm phản ứng nhiệt độ (40 °C) mơi trường có độ ẩm tương đối cao (75%) tháng Kết cho thấy, nhiệt độ độ ẩm đóng vai trị quan trọng ổn định polyphenol bột Ilex paraguariensis39 Năm 2022, NIE Jayani cộng nghiên cứu độ ổn định bột Chùm ngây (Moringa oleifera) với ĐKBQ nhiệt độ 28,5 ‒ 33,5 °C, độ ẩm tương đối 50 ‒ 75% thời gian lấy mẫu ba tháng lần Các thơng số vật lý (đặc tính cảm quan độ ẩm), thơng số hóa học (tổng hàm lượng phenolic tổng hàm lượng flavonoid), thông số vi sinh vật (tổng số đĩa tổng số nấm men, nấm mốc) kiểm tra Thử nghiệm cảm quan cho thấy khơng có thay đổi màu sắc, mùi vị hình dạng sản phẩm tháng thứ sáu Tuy nhiên, có thay đổi đáng kể độ ẩm, tổng hàm lượng phenol sản phẩm Các thơng số vật lý, hóa học vi sinh vật đáp ứng yêu cầu chất lượng Chất lượng bột Chùm ngây bảo quản nhiệt độ phòng (28,5 ‒ 33,5 °C) độ ẩm tương đối 50 ‒ 75% cho thấy đặc tính hóa lý tốt ổn định thử nghiệm suốt 06 tháng40 1.4 TỔNG QUAN VỀ TÁ DƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 1.4.1 Dextrose Dextrose (DEX) tá dược dạng bột hạt trắng, không mùi, vị ngọt41 DEX hỗn hợp tá dược gồm 95% dextrose 5% dextrat DEX sử dụng tá dược độn, tá dược dính cơng thức viên nén, viên nhai, viên sủi bọt, viên hoà tan, 16 thuốc bột với ưu điểm sau: lưu tính vượt trội, tính hút ẩm thấp, tan nhanh hồn tồn nước, phân bố kích thước hạt hẹp42 Ở 20 oC, DEX có độ tan nước 1000 g/l41 Hình 1.2 Hình chụp SEM tá dược DEX (JRS Pharma)43 1.4.2 Maltodextrin Maltodextrin (MAL) tá dược dạng bột hạt trắng, khơng mùi, với DE (Dextrose equivalent – đương lượng dextrose) tối đa 20 Độ hòa tan, độ hút ẩm, vị khả nén MAL tăng DE tăng MAL bào chế cách thuỷ phân tinh bột khơng hồn tồn acid enzym thích hợp Cấu trúc MAL gồm đơn vị D-glucose nối với chủ yếu liên kết α-(1→4) tạo nhánh liên kết α-(1→6) MAL thường sử dụng công thức tá dược độn tá dược dính với ưu điểm lưu tính tốt, tan tự nước41 Ở 20 oC, độ tan nước MAL 600 g/l44 Hình 1.3 Hình chụp SEM tá dược MAL (Roquette)44 17 1.4.3 Sucrose đồng kết tinh Sucrose đồng kết tinh (co-crystallized sucrose – CCS) tá dược dạng bột, khơng mùi, có vị CCS sản xuất kết tinh tự phát dung dịch sucrose bão hoà (96,5 ± 1,5%) maltodextrin (3,0 ± 0,75%) CCS sử dụng làm tá dược độn, tá dược dính cơng thức viên nén, viên nhai, thuốc bột với ưu điểm sau: lưu tính tốt, tính hút ẩm thấp, tan hồn tồn nước, có tính trơ, độ ổn định tốt, cải thiện phân tán, pha trộn45 Ở 20 oC, độ tan nước sucrose 2000 g/l41 Hình 1.4 Hình chụp ESEM tá dược CCS (Domino Foods, Inc.)45 1.4.4 Sucrose sấy phun Sucrose phun sấy (spray drying sucrose – SDS) tá dược dạng bột kế tinh màu trắng, không mùi, vị SDS hỗn hợp sấy phun sucrose (95 - 98%) với maltodextrin (2,3 ± 0,5%) đường nghịch đảo (khoảng 1,7%) Sucrose sấy phun sử dụng tá dược độn, tá dược dính cơng thức viên nén, viên nhai, viên sủi, thuốc bột sirơ Do cấu trúc hạt hình cầu, rỗng nên sucrose phun sấy có ưu điểm lưu tính tốt, hoà tan nhanh46 Ở 20 oC, độ tan nước sucrose 2000 g/l41 Hình 1.5 Hình chụp SEM tá dược SDS (Tereos)47 18 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 HÓA CHẤT – THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên liệu – hoá chất – dung môi 2.1.1.1 Nguyên liệu Cao khô BT (số lô NC01) cung cấp nhóm nghiên cứu Khoa Dược – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Các dược liệu chất đối chiếu nghiên cứu trình bày Bảng 2.1 Bảng 2.1 Các dược liệu chất đối chiếu nghiên cứu Dược liệu/Chất đối chiếu 3-O--D-glucopyranosyl-(14) --D glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O--Dglucopyranosyl ester Sinensetin Hàm lượng Nguồn gốc (%) 95,38 Viện kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh 96,21 Acid asperulosidic 97,41 Dược liệu Nhàu Dược liệu Đinh lăng xẻ Dược liệu Mía dị Dược liệu Râu mèo Viện kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh Phân lập nhóm nghiên cứu Khoa Dược – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Cơng ty Nam Khoa Công ty Nam Khoa Công ty Nam Khoa Công ty cổ phần Dược Sơn Lâm Các tá dược nghiên cứu trình bày Bảng 2.2 Bảng 2.2 Tá dược nghiên cứu Tá dược Tiêu chuẩn Xuất xứ Dextrose (DEX) NF Đức Maltodextrin (MAL) NF Pháp Sucrose đồng kết tinh (CCS) NF USA Sucrose phun sấy (SDS) NF Pháp 19 2.1.1.2 Hoá chất – dung môi Acetonitril đạt tiêu chuẩn HPLC, sản xuất công ty Scharlau (Tây Ban Nha) Methanol, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích, sản xuất cơng ty Merck (Đức) Acid acetic băng, acid formic, acid hydrocloric, acid sulfuric, ammoniac, cloroform, đệm acetat, ethanol, ethyl acetat, methanol, n-butanol, n-hexan, phenolphthalein, thioacetamid đạt tiêu chuẩn phân tích, sản xuất công ty Xilong (Trung Quốc) 2.1.2 Thiết bị Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu xác dùng phân tích Thiết bị sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 2.3 Bảng 2.3 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu Tên dụng cụ - thiết bị Model Bản mỏng silica gel 60 F254 Xuất xứ Merck, Đức Bể siêu âm Sonorex RK - 1028H Bandelin, Đức Bếp cách thủy 14 lít WNB Memmert, Đức Cân điện tử Satorius GS-622N Satorius, Nhật Bản Cân phân tích số lẻ PR224/E Ohaus, Trung Quốc Cân phân tích số lẻ CP225D Satorius, Đức Cột sắc ký C18 Shim-pack GIST Shimadzu, Nhật Bản Đèn soi UV bước sóng 254/365 CN-15-LC Viber Loumart, Pháp Máy chụp hình SEM JSM-IT100 JEOL, Nhật Bản Máy HPLC LC-2030C 3D plus Shimadzu, Nhật Bản Máy khuấy từ VELP VELP, Ý Tủ sấy ULM 500 Memmert, Đức Tủ sấy chân khơng VO29 Memmert, Đức Tủ vi khí hậu HCP50 Memmert, Đức 20 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Kiểm nghiệm cao khô BT theo TCCS Kiểm nghiệm cao khô BT theo TCCS (Phụ lục 1) với tiêu: tính chất, độ ẩm, kim loại nặng, định tính, định lượng, giới hạn vi sinh vật dư lượng thuốc bảo vệ thực vật 2.2.2 Xây dựng công thức quy trình bào chế thuốc bột chứa cao khơ BT 2.2.2.1 Khảo sát số tính chất cao khơ BT Khảo sát tính chất hóa lý cao khơ BT: hình dạng hạt, kích thước hạt đánh giá lưu tính cao khơ BT Phương pháp xác định hình dạng kích thước hạt Hình dạng kích thước hạt cao khơ BT xác định kính hiển vi điện tử quét (SEM) Mẫu dàn mỏng băng dính, gạt bỏ hạt dư, tiến hành phủ dẫn điện Chụp hình mẫu SEM độ phân giải x500; x1000; x2000; x5000 Phương pháp đánh giá lưu tính cao khơ BT  Xác định khối lượng riêng trước gõ, khối lượng riêng sau gõ, số nén tỷ số Hausner Bột có khối lượng m (g) cho vào ống đong Thể tích lượng bột trước gõ (V0) ghi nhận Sau đó, ống đong gõ thể tích bột ống đong (V) khơng đổi16 Mỗi thí nghiệm tiến hành 03 lần xác định giá trị trung bình Khối lượng riêng trước gõ (d0), khối lượng riêng sau gõ (ds), số nén tỷ số Hausner xác định công thức sau48: d0 = Chỉ số nén = 100 - m V0 m ; ds = ; V ; Tỷ số Hausner = Xác định góc nghỉ tốc độ chảy bột Bột có khối lượng m (g) chảy qua phễu gắn cố định Thời gian (t) để toàn khối bột chảy qua phễu ghi nhận Chiều cao (h) đường kính (d) khối bột sau chảy qua phễu xác định16 Mỗi thí nghiệm tiến hành 03 lần xác định giá trị trung bình Góc nghỉ (α) tốc độ chảy (v) tính theo công thức sau16: 21 tgα = 2h/d v (g/s) = m/t Lưu tính bột đánh giá theo giá trị số nén, tỷ số Hausner góc nghỉ tương ứng trình bày Bảng 2.4 Bảng 2.4 Các mức đánh giá khả chảy bột48 Lưu tính Chỉ số nén (%) Chỉ số Hausner Góc nghỉ α 10 1,00 – 1,11 25-30 Chảy tốt 11 – 15 1,12 – 1,18 31-35 Chảy 16 – 20 1,19 – 1,25 36-40 Chảy 21 – 25 1,26 – 1,34 41-45 Chảy 26 – 31 1,35 – 1,45 46-55 Chảy 32 – 37 1,46 – 1,59 56-65 >38 > 1,60 >66 Chảy tốt Chảy rất, 2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng tá dược độn lên lưu tính cao khơ BT Cao khơ BT cải thiện lưu tính phương pháp phối hợp tá dược độn riêng lẻ hỗn hợp tá dược độn Trường hợp khảo sát với tá dược độn riêng lẻ: cao khô BT phối hợp với tá dược độn riêng lẻ DEX, MAL, CCS, SDS với tỷ lệ tá dược: cao khô BT 6:4, 7:3 8:2 (kl/kl) Trường hợp khảo sát với hỗn hợp tá dược độn: hỗn hợp MAL DEX MAL CCS MAL SDS sử dụng theo tỷ lệ 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 (kl/kl) Sau đó, hỗn hợp tá dược trộn với cao khô BT theo tỷ lệ hỗn hợp tá dược: cao khô BT 6:4, 7:3 8:2 (kl/kl) Khảo sát khối lượng riêng trước gõ, khối lượng riêng sau gõ, tỷ số Hausner, góc nghỉ tốc độ chảy hỗn hợp bột đánh giá lưu tính Mỗi thí nghiệm lặp lại 03 lần tính giá trị trung bình 22 Đề xuất cơng thức quy trình điều chế thuốc bột BT dựa kết khảo sát lưu tính 2.2.2.3 So sánh lưu tính thời gian hịa tan thuốc bột BT thuốc cốm BT Bào chế thuốc cốm từ cao khô BT Tiến hành bào chế thuốc cốm BT sử dụng phương pháp thường quy xát hạt cao khô BT với tá dược MAL 02 tỷ lệ cao khô BT khác (Bảng 2.5), sử dụng dung môi xát hạt cồn 80% Quy trình bào chế thuốc cốm BT trình bày Hình 2.1 Rây MAL cao khơ BT qua rây 0,5 mm Trộn tá dược MAL cao khô BT Tạo khối ẩm cho hỗn hợp bột BT Xát hạt ướt qua rây 1,0 mm Sấy cốm 60 oC Sửa hạt qua rây 1,0 mm Hình 2.1 Quy trình bào chế thuốc cốm BT Các thành phần công thức thuốc cốm BT trình bày Bảng 2.5 Bảng 2.5 Thành phần công thức thuốc cốm BT khảo sát CT % Cao khô BT (kl/kl) % MAL (kl/kl) B24 30 70 B25 40 60 23 Đánh giá tính chất hóa lý thuốc cốm BT kích thước hạt, lưu tính thời gian hịa tan Kích thước hạt lưu tính thuốc cốm BT Các rây chồng lên theo thứ tự lỗ mắt rây nhỏ dần từ xuống: 0,710 mm, 0,355 mm, 0,180 mm 0,125 mm Xác định % lượng cốm khơng qua rây (kl/kl) Mỗi thí nghiệm lặp lại 03 lần, lấy giá trị trung bình Khảo sát khối lượng riêng trước gõ, khối lượng riêng sau gõ, tỷ số Hausner, góc nghỉ tốc độ chảy thuốc cốm BT theo phương pháp mục 2.2.2.1 Mỗi thí nghiệm lặp lại 03 lần tính giá trị trung bình Thời gian hịa tan thuốc cốm BT thuốc bột BT Cân 6,67 g thuốc bột BT (hoặc 6,67 g thuốc cốm BT B24 g thuốc cốm BT B25) cho vào 250 ml nước, khuấy thuốc cốm BT hòa tan hồn tồn Thời gian hịa tan hồn tồn t (giây) ghi nhận Mỗi thí nghiệm lặp lại 03 lần, lấy giá trị trung bình 2.2.3 Xây dựng TCCS thuốc bột BT 2.2.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Khảo sát quy trình xử lý mẫu Phương pháp SKLM sử dụng để khảo sát chọn dung môi chiết xuất acid asperulosidic thuốc bột BT với điều kiện khảo sát sau: Chuẩn bị mẫu - Dung dịch đối chiếu gốc: cân mg chất chuẩn acid asperulosidic, cho vào bình định mức 10 ml Thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc - Dung dịch đối chiếu: cho ml dung dịch đối chiếu gốc vào bình định mức 10 ml, bổ sung methanol đến vạch, lắc Dung dịch acid asperulosidic đối chiếu có nồng độ 30 μg/ml methanol - Dung dịch thử: cân 500 mg thuốc bột BT, cho vào bình định mức 25 ml Thêm 20 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung 24 methanol đến vạch, lắc đều, lọc Tiến hành tương tự với dung môi ethanol, acetonitril nước Cách tiến hành: - Chấm riêng biệt 20 µl dung dịch đối chiếu dung dịch thử lên mỏng SKLM triển khai với hệ dung môi CH3Cl - MeOH - H2O (60:40:10, lớp dưới) phát thuốc thử H2SO4 10% ethanol (sấy 105oC) - Dựa vào kết SKLM, chọn dung môi chiết nhiều acid asperulosidic để chuẩn bị mẫu thử Khảo sát tỉ lệ khối lượng thuốc bột BT: thể tích dung mơi Dung mơi chiết xuất chọn dùng để tiếp tục khảo sát chọn tỷ lệ thuốc bột BT: dung môi để chuẩn bị mẫu thử Khảo sát 02 tỷ lệ thuốc bột BT dung môi sau:  Tỷ lệ 1: cân xác 300 mg thuốc bột BT chiết với 25 ml dung môi chọn  Tỷ lệ 2: cân xác 300 mg thuốc bột BT chiết với 50 ml dung môi chọn Sau chiết xuất phương pháp siêu âm 30 phút, hiệu suất chiết acid asperulosidic 02 tỷ lệ khảo sát ghi nhận phương pháp HPLC Chọn tỷ lệ tích dung mơi chiết nhỏ chiết tối đa chất điểm acid asperulosidic Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Mẫu thử chuẩn bị theo quy trình chọn Thành phần mẫu thử phân tích phương pháp HPLC với điều kiện HPLC sau: Hệ thống sắc ký: Máy HPLC Shimadzu LC-2030C 3D Plus (Nhật Bản) Detector: PDA Cột sắc ký: C18 Shimpack GIST (250 × 4,6 mm; μm) v tin ct HQ105C18 (10ì4,6 mm, àm) (Thermo Scientific, Mỹ) 25 Bước sóng phát hiện: 236 nm Nhiệt độ cột: 30 oC Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 10 μl Pha động: Kênh A: Dung dịch acid H3PO4 0,1% nước Kênh B: Acetonitril Thăm dị số chương trình pha động Bảng 2.6 Bảng 2.6 Chương trình pha động khảo sát quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Chương trình Thời gian (phút) Kênh A Kênh B I 0-15 90 10 II 0-15 90,5 9,5 Điều kiện HPLC chọn cho pic acid asperulosidic tách hoàn toàn khỏi pic tạp mẫu thử thông số sắc ký đạt yêu cầu Thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT thẩm định theo hướng dẫn ICH tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ đúng49  Tính tương thích hệ thống Mẫu thử chuẩn bị cách cân 300 mg thuốc bột BT vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Tiến hành cân cột pha động 15 phút Tiêm lần liên tiếp mẫu dung dịch thử Tính tương thích hệ thống khảo sát với thơng số sắc ký sau: thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), hệ số bất đối (As), độ phân giải (Rs) số đĩa lý thuyết (N) 26 u cầu: Quy trình đạt tính tương thích hệ thống độ lệch chuẩn (% RSD) thời gian lưu (tR), diện tích pic hoạt chất (S) 2%, hệ số bất đối, độ phân giải, số đĩa lý thuyết đạt yêu cầu phân tích49  Tính đặc hiệu Chuẩn bị mẫu sau: Mẫu trắng: Methanol Mẫu đối chiếu: Dung dịch acid asperulosidic nồng độ 20 μg/ml methanol Mẫu thử: Cân xác khoảng 300 mg thuốc bột BT vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm Mẫu thử thêm chất đối chiếu: Cân xác khoảng 300 mg thuốc bột BT vào bình định mức 25 ml Thêm 0,5 mg chất đối chiếu 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 µm Mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử mẫu thử thêm chất đối chiếu tiến hành sắc ký HPLC Yêu cầu49: - Sắc ký đồ mẫu trắng khơng có pic xuất khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic acid asperulosidic mẫu chuẩn - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với pic acid asperulosidic mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ xuất thêm pic khác (pic tạp), pic chất điểm phải tách hoàn toàn khỏi pic tạp - Khi thêm chuẩn vào mẫu thử, chiều cao diện tích pic acid asperulosidic mẫu thử tăng - Phổ UV – Vis thời gian lưu pic acid asperulosidic mẫu thử giống với phổ UV – Vis thời gian lưu tương ứng acid asperulosidic đối chiếu - Kiểm tra độ tinh khiết pic đầu dò PDA, pic acid asperulosidic mẫu thử phải đạt yêu cầu độ tinh khiết pic 27  Tính tuyến tính Dung dịch đối chiếu gốc chuẩn bị cách cân 5,6 mg chất chuẩn acid asperulosidic, cho vào bình định mức ml Thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc Dung dịch đối chiếu gốc có nồng độ 1,0910 mg/ml Dung dịch đối chiếu gốc pha lỗng bình định mức 10 ml methanol thu dung dịch chuẩn có nồng độ khác trình bày Bảng 2.7 Bảng 2.7 Nồng độ acid asperulosidic khảo sát tính tuyến tính Dung dịch đối chiếu V dd chuẩn gốc (μl) 70 140 250 350 500 750 38,18 54,55 81,82 V hỗn hợp pha động vđ (ml) Nồng độ chất đối chiếu 10 7,64 15,27 27,27 (µg/ml) Xác định tương quan nồng độ diện tích pic dung dịch chuẩn, thiết lập phương trình hồi quy vẽ đồ thị biểu diễn tương quan nồng độ diện tích đỉnh Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa thông số phương trình hồi quy trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp phương trình hồi quy Yêu cầu: Hệ số tương quan R2 ≥ 0,99549  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Mẫu chuẩn acid asperulosidic pha lỗng dung mơi pha mẫu đến nồng độ: 40; 10; 2; 0,4; 0,08; 0,008 µg/ml Tiến hành sắc ký, ghi nhận tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) Các dung dịch tiêm lặp lại nồng độ LOD, LOQ dung dịch 06 lần, ghi nhận kết Yêu cầu49: Giới hạn phát nồng độ cho pic có tỉ lệ S/N  Giới hạn định lượng nồng độ cho pic có tỉ lệ S/N  10 28  Độ lặp lại độ xác trung gian Mẫu thử chuẩn bị cách cân xác khoảng 300 mg thuốc bột BT vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Tiến hành chuẩn bị tương tự 05 mẫu dung dịch thử cịn lại Từ diện tích pic 06 mẫu thử, xác định hàm lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Xử lý thống kê, xác định độ lệch chuẩn tương đối Yêu cầu: Độ lệch chuẩn (% RSD) phải nằm khoảng cho phép với nồng độ acid asperulosidic mẫu thử, trình bày Bảng 2.8 Bảng 2.8 Độ lặp lại độ hồi phục chấp nhận nồng độ khác Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%) Độ hồi phục 100 100% 1,3 98 – 102 10 10-1 10% 2,8 98 – 102 10-2 1% 2,7 97 – 103 0,1 10-3 0,1% 3,5 95 – 105 0,01 10-4 100 ppm 5,3 90 – 107 0,001 10-5 10 ppm 7,3 80 – 110 0,0001 10-6 ppm 11 80 – 110 0,00001 10-7 100 ppb 15 80 – 110 0,000001 10-8 10 ppb 21 60 – 105 0,0000001 10-9 ppb 30 40 – 102  Độ Chất chuẩn acid asperulosidic thêm vào mẫu thử mức 80, 100 120% so với nồng độ acid asperulosidic định lượng Tại mức nồng độ thực mẫu độc lập Xác định độ hồi phục phương pháp theo công thức: Độ hồi phục (%) = (Lượng chất thu hồi/ Lượng chất thêm vào) × 100% 29 Yêu cầu: Phương pháp định lượng đạt độ tỉ lệ hồi phục nằm khoảng cho phép ứng với nồng độ chất điểm mẫu thử49, trình bày Bảng 2.8 2.2.3.2 Xây dựng quy trình định tính dược liệu thuốc bột BT phương pháp SKLM Phương pháp SKLM định tính thuốc bột BT kế thừa có điều chỉnh từ phương pháp định tính dược liệu cao khô BT Phạm Ngọc Thạc cộng sự7 có thay đổi thành phần mẫu thử thuốc bột BT  Định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng xẻ Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1, lớp trên) Dung dịch thử: Cân 667 mg thuốc bột BT vào bình định mức 10 ml Thêm ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch đối chiếu: Hịa tan chất đối chiếu acid asperulosidic 3-O--Dglucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D glucopyranosyl ester methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Mẫu dược liệu Nhàu: Cân 500 mg bột dược liệu Nhàu vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu dược liệu Đinh lăng xẻ: Cân 500 mg bột dược liệu Đinh lăng vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng 30 Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chất đối chiếu acid asperulosidic, 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester, dược liệu Nhàu dược liệu Đinh lăng xẻ  Định tính dược liệu Râu mèo Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) Dung dịch thử: Cân 6,67 g thuốc bột BT vào bình định mức 10 ml Thêm ml cloroform, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung cloroform đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu sinensetin methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Mẫu dược liệu Râu mèo: Cân 200 mg bột dược liệu Râu mèo vào bình định mức 10 ml Thêm ml cloroform, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung cloroform đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng Quan sát mỏng ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chất đối chiếu sinensetin dược liệu Râu mèo  Định tính dược liệu Mía dị Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: Cloroform – methanol – nước (65:35:10, lớp dưới) Dung dịch thử: Cân 100 mg thuốc bột BT phân tán ml H2O (siêu âm phút) làm dung dịch mẫu nạp lên cột SPE C18 Lần lượt cho qua cột 30 ml dung môi 31 H2O, MeOH 50% MeOH 60%, gom dịch rửa giải methanol 60% cô đến cắn Thêm ml MeOH vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu dược liệu Mía dị: Cân 500 mg bột dược liệu Mía dị vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml MeOH, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, đến cắn Cân 30 mg cao Mía dị phân tán ml H2O (siêu âm phút) làm dung dịch mẫu nạp lên cột SPE C18 Lần lượt cho qua cột 30 ml dung môi H2O, MeOH 50% MeOH 60%, gom dịch rửa giải methanol 60% cô đến cắn Thêm ml MeOH vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Các vết có Rf tương ứng với dược liệu đối chiếu Mía dị tách riêng biệt với vết khác mẫu thử 2.2.3.3 Xây dựng TCCS thuốc bột BT Kiểm nghiệm 03 lô thuốc bột BT với tiêu chí sau:  Tính chất: Mơ tả cảm quan thể chất, màu sắc, mùi vị  Độ ẩm: Tiến hành xác định khối lượng làm khô theo DĐVN V, phụ lục 9.6  Độ đồng khối lượng Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 11.3  Giới hạn nhiễm khuẩn Kiểm nghiệm theo DĐVN V phương pháp thử giới hạn nhiễm khuẩn (PL 13.6)  Định tính Theo phương pháp mục 2.2.3.2  Định lượng 32 Định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT sử dụng phương pháp HPLC xây dựng thẩm định 2.2.3.4 Đề xuất TCCS thuốc bột BT Từ kết kiểm nghiệm 03 lô thuốc bột BT, đề xuất TCCS thuốc bột BT với tiêu chí: tính chất, độ ẩm, độ đồng khối lượng, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính định lượng 2.2.4 Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT 02 ĐKBQ ĐKBQ cấp tốc ĐKBQ dài hạn  Thuốc bột BT đóng gói với bao bì cấp 01 gồm: màng PET 12 µm, màng PE 20 µm, màng nhơm 07 µm màng LLDPE 37 µm  ĐKBQ cấp tốc: Bảo quản nhiệt độ 40 ± oC độ ẩm 75 ± 5% Lấy mẫu kiểm nghiệm với tiêu chí cảm quan, độ ẩm, định tính định lượng thời điểm 0, tháng  ĐKBQ dài hạn: Bảo quản nhiệt độ 30 ± oC độ ẩm 75 ± 5% Lấy mẫu kiểm nghiệm với tiêu chí cảm quan, độ ẩm, định tính định lượng thời điểm 0, tháng Áp dụng cơng thức van’t Hoff để ước tính tuổi thọ (t90) thuốc bột BT ĐKBQ nhiệt độ 30 ± oC độ ẩm 75 ± 5% C = K x C* = 2Δt/10 x C* Trong đó: C: tuổi thọ thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn C*: tuổi thọ thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc K: hệ số van’t Hoff Δt: chênh lệch nhiệt độ ĐKBQ cấp tốc ĐKBQ dài hạn 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KIỂM NGHIỆM CAO KHÔ BT THEO TCCS Nguyên liệu đầu vào nghiên cứu cao khô BT kiểm nghiệm theo TCCS Kết trình bày Bảng 3.1  Cảm quan Hình 3.1 Hình chụp cao khơ BT Cao khơ BT có dạng bột mịn, đồng nhất, màu nâu, mùi dược liệu, dễ hút ẩm  Định tính Kết định tính cao khơ BT trình bày Hình 3.2, Hình 3.3 Hình 3.4 Định tính dược liệu Râu mèo cao khơ BT Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Hệ dung môi: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) Phát hiện: UV 365 nm L1: Cao khô BT Sine: Chất đối chiếu sinensetin RM: Dược liệu Râu mèo Hình 3.2 SKLM định tính dược liệu Râu mèo cao khơ BT 34 Định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng cao khô BT Hệ dung môi: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1) Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC L1: Cao khô BT Asp: Chất đối chiếu acid asperulosidic N: Dược liệu Nhàu; ĐL: Dược liệu Đinh lăng AO: Chất đối chiếu 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D- glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester Hình 3.3 SKLM định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng cao khơ BT Định tính dược liệu Mía dị cao khô BT Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Hệ dung môi: Cloroform – methanol – nước (65:35:10) Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC L1: Cao khô BT MD: Dược liệu đối chiếu Mía dị L1 MD Hình 3.4 SKLM định tính dược liệu Mía dị cao khơ BT Trên sắc ký đồ SKLM, mẫu thử có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ chất đối chiếu acid asperulosidic, sinensetin, 3-O--D-glucopyranosyl(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester dược liệu đối chiếu Mía dị 35 Bảng 3.1 Kết kiểm nghiệm cao khô BT theo TCCS STT Chỉ tiêu Tính chất Yêu cầu chất lượng Dạng bột mịn, đồng Kết luận nhất, Đạt màu nâu, mùi dược liệu, dễ hút ẩm Độ ẩm Không 5% Đạt (4,19%) Định tính Thực phép thử định tính Đúng Nhàu, Đinh lăng xẻ, Râu mèo, Mía dị Định lượng Hàm lượng acid asperulosidic Đạt cao khô BT không (0,3427%) 0,2% Giới hạn kim loại Không 20 ppm Đạt nặng Giới hạn vi sinh vật Đạt yêu cầu ghi DĐVN V Đạt Dư lượng hoá chất Đạt yêu cầu ghi DĐVN V Đạt bảo vệ thực vật Kết luận: Cao khô BT đạt yêu cầu TCCS 3.2 XÂY DỰNG CÔNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ THUỐC BỘT CHỨA CAO KHƠ BT 3.2.1 Kết khảo sát tính chất cao khơ BT Cao khơ BT khảo sát kích thước, hình dạng lưu tính 3.2.1.1 Hình dạng kích thước hạt cao khơ BT Hình 3.5 cho thấy hạt cao khơ BT hình dạng gần cầu, bề mặt hạt cao gồ ghề, kích thước hạt mịn, khoảng 20-50 μm 36 A B C D Hình 3.5 Hình SEM mẫu cao khơ BT độ phóng đại (A) x500, (B) x1000, (C) x2000, (D) x5000 3.2.1.2 Kết khảo sát lưu tính cao khơ BT Các số lưu tính cao khơ BT trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Các số lưu tính cao khơ BT (n = 3) Thơng số đo Giá trị Khối lượng riêng trước gõ (g/ml) 0,21 ± 0,01 Khối lượng riêng sau gõ (g/ml) 0,37 ± 0,01 Tỷ số Hausner 1,78 ± 0,02 Chỉ số nén (%) 43,74 ± 0,77 Tốc độ chảy (g/s) Không xác định Góc nghỉ Khơng xác định Tỷ số Hausner số nén cao khô BT 1,78 ± 0,02 43,76 ± 0,7 Dựa vào Bảng 2.4, lưu tính cao khơ BT nằm mức rất, kém48 Cao khô BT 37 chảy tự qua phễu nên khơng xác định tốc độ chảy góc nghỉ Điều kích thước hạt cao khơ BT nhỏ, hạt mịn nên diện tích bề mặt tiếp xúc tiểu phân lớn dẫn đến lực tĩnh điện, lực Val der Waals hạt lớn nên lưu tính cao mức rất, kém16,29 Hình 3.5 cho thấy, bề mặt cao khô BT gồ ghề làm tăng diện tích bề mặt nên dù có dạng hình cầu lợi lực liên kết hạt lớn nên làm giảm lưu tính cao khơ BT50 Kết luận: Lưu tính cao khơ BT thuộc mức rất, kém, cần có phương pháp cải thiện lưu tính để đạt u cầu đóng gói trực tiếp Các phương pháp cải thiện khả chảy cao khô BT như: thay đổi phân bố kích thước hạt (tăng lượng hạt thơ giảm lượng hạt mịn), giảm điện tích, lực liên kết giữ hạt, tăng lực rung máy, thêm tác nhân tăng khả chảy (tá dược trơn chảy)50… 3.2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng tá dược độn lên lưu tính cao khơ BT Lưu tính cao khô BT cải thiện phương pháp phối hợp với tá dược độn riêng lẻ DEX, MAL, CCS, SDS với hỗn hợp tá dược độn Kích thước khối lượng riêng trước gõ cao khô BT tá dược sử dụng nghiên cứu trình bày Bảng 3.3 Bảng 3.3 Kích thước khối lượng riêng cao khô BT tá dược sử dụng nghiên cứu43-45,47 Kích thước (µm) Khối lượng riêng trước gõ (g/ml) Cao khô BT 20 – 50 0,21 ± 0,01 DEX 190 – 220 0,67 ± 0,01 MAL 40 – 100 0,47 ± 0,01 CCS 180 – 250 0,70 ± 0,01 SDS 150 – 300 0,56 ± 0,01 3.2.2.1 Ảnh hưởng tá dược độn riêng lẻ lên lưu tính cao khơ BT Ảnh hưởng tá dược độn (DEX, MAL, CCS, SDS) riêng lẻ lên lưu tính cao khơ BT công thức thể Bảng 3.4 38 Bảng 3.4 Lưu tính cơng thức phối hợp cao khô BT tá dược độn riêng lẻ (n = 3) Công % % % % % Khối lượng Khối lượng Chỉ số nén Tỷ số Tốc độ chảy thức Cao DEX MAL CCS SDS riêng trước gõ riêng sau gõ (%) Hausner (g/s) (g/ml) (g/ml) khơ BT Góc nghỉ A1 40 60 0 0,46 ± 0,01 0,66 ± 0,01 29,53 ± 0,26 1,42 ± 0,01 - - A2 30 70 0 0,57 ± 0,01 0,77 ± 0,01 25,31 ± 0,98 1,34 ± 0,02 - - A3 20 80 0 0,61 ± 0,01 0,80 ± 0,01 23,08 ± 0,28 1,30 ± 0,01 33,74 ± 0,72 24,85 ± 0,18 A4 40 60 0 0,39 ± 0,01 0,58 ± 0,01 32,77 ± 0,65 1,49 ± 0,01 - - A5 30 70 0 0,43 ± 0,01 0,62 ± 0,00 31,62 ± 0,55 1,46 ± 0,01 - - A6 20 80 0 0,47 ± 0,01 0,68 ± 0,01 31,09 ± 0,28 1,45 ± 0,01 - - A7 40 0 60 0,48 ± 0,01 0,69 ± 0,01 29,95 ± 0,83 1,43 ± 0,02 - - A8 30 0 70 0,57 ± 0,01 0,79 ± 0,01 27,84 ± 0,80 1.38 ± 0,02 - - A9 20 0 80 0,67 ± 0,01 0,85 ± 0,02 20,61 ± 0,27 1,26 ± 0,01 23,79 ± 0,18 35,61 ± 0,19 A10 40 0 60 0,46 ± 0,01 0,65 ± 0,01 29,01 ± 0,80 1,41 ± 0,02 - - A11 30 0 70 0,51 ± 0,01 0,70 ± 0,01 26,40 ± 0,88 1,36 ± 0,02 - - A12 20 0 80 0,55 ± 0,01 0,70 ± 0,01 21,34 ± 0,84 1,27 ± 0,01 33,51± 0,85 27,36 ± 0,11 (-) Không xác định 39 Khối lượng riêng trước gõ khối lượng riêng sau gõ công thức A1 – A12 Khối lượng riêng trước gõ (g/ml) DEX MAL CCS SDS 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0% 60% 70% 80% Tỷ lệ tá dược độn (%, kl/kl) Hình 3.6 Tương quan khối lượng riêng trước gõ tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) Bảng 3.4 Hình 3.6 cho thấy, khối lượng riêng trước sau gõ hỗn hộp bột tăng tỷ lệ tá dược độn riêng lẻ tăng Khối lượng riêng hỗn hợp bột giảm dần theo thứ tự phối hợp với CCS, DEX, SDS, MAL Điều giải thích CCS tá dược có khối lượng riêng cao (0,70 ± 0,01 g/ml)45 MAL tá dược có khối lượng riêng thấp (0,47 ± 0,00 g/ml)44 (Bảng 3.3) Khối lượng riêng hỗn hợp bột tăng khối lượng riêng tá dược độn sử dụng lớn đáng kể so với khối lượng riêng cao khơ BT (0,21 ± 0,01 g/ml) Ngồi ra, hạt cao có kích thước nhỏ lắp vào khoang trống hạt tá dược có kích thước lớn dẫn đến xếp lại hạt hỗn hợp bột51 Vì vậy, tá dược sử dụng cải thiện khối lượng riêng hỗn hợp bột Tỷ số Hausner số nén cơng thức A1 – A12 Bảng 3.4, Hình 3.7 Hình 3.8 cho thấy, tỷ số Hausner số nén hỗn hợp bột giảm tỷ lệ phối hợp tá dược riêng lẻ tăng Khi phối hợp với tá dược MAL, lưu tính thuốc bột BT cải thiện từ rất, thành Khi phối hợp với tá dược DEX, CCS, SDS, lưu tính thuốc bột BT cải thiện thành chảy Vậy, tá dược độn có khả cải thiện lưu tính cao khô BT 40 DEX MAL CCS SDS 1,9 Tỷ số Hausner 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 0% 60% 70% 80% Tỷ lệ tá dược độn (%, kl/kl) Hình 3.7 Tương quan tỷ số Hausner tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) DEX MAL CSS SDS 45 Chỉ số nén 40 35 30 25 20 15 0% 60% 70% 80% Tỷ lệ tá dược độn (%, kl/kl) Hình 3.8 Tương quan số nén tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) Bảng 3.4 Hình 3.7, Hình 3.8 cho thấy, tỷ số Hausner số nén hỗn hợp bột trộn với MAL (A4 - A6) lớn so với hỗn hợp bột trộn với DEX (A1 - A3), CCS (A7 - A9) SDS (A10 – A12) Điều giải thích kích thước trung bình tá dược MAL (40 – 100 µm) nhỏ so với tá dược DEX (190 – 220 µm), CCS (180 – 250 µm), SDS (150 – 300 µm) (Bảng 3.3) nên làm tăng lực liên kết hạt (lực tĩnh điện, lực Val der Waals) gây khó khăn cho việc 41 xếp hạt trước gõ so với tá dược khác Khi gõ, hạt nhỏ lăn vào dễ dàng lắp đầy khoảng trống hạt làm cho khối lượng riêng trước sau gõ có khác biệt lớn dẫn đến tỷ số Hausner số nén lớn51 Như vậy, số 04 tá dược độn khảo sát, khả cải thiện số nén tỷ số Hausner tá dược MAL Tốc độ chảy góc nghỉ cơng thức A1 – A12 40 Tốc độ chảy (g/s) 35 30 25 20 15 10 DEX DEX DEX MAL MAL MAL SDS SDS SDS CCS CCS CCS 60% - 70% - 80% - 60% - 70% - 80% - 60% - 70% - 80% - 60% - 70% - 80% A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Hình 3.9 Tương quan tốc độ chảy tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) Bảng 3.4 Hình 3.9 cho thấy, phối hợp với tá dược MAL với cao khô BT tỷ lệ khảo sát, hỗn hợp bột công thức A4 – A6 chảy qua phễu Nguyên nhân tá dược MAL có kích thước nhỏ so với tá dược khác có hình dạng góc cạnh (Hình 1.3) nên tạo lực cản, ma sát với thành phễu tăng lực liên kết hạt với Vì nên dù khối lượng riêng hỗn hợp bột cải thiện cao khô BT phối hợp với tá dược MAL hỗn hợp bột A4 – A6 không chảy qua phễu Khi phối hợp với tá dược DEX, CCS, SDS tỷ lệ 60 – 70% với cao khô BT, hỗn hợp bột công thức A1, A2, A7, A8, A10, A11 không xác định tốc độ chảy góc nghỉ Cao khơ BT có kích thước nhỏ nên cao khô BT chiếm tỷ lệ lớn (30 – 40%) dẫn đến lực liên kết, lực tĩnh điện lực ma sát hạt chiếm ưu làm hỗn hợp bột không chảy được24,25,29 42 40 35 Góc nghỉ 30 25 20 15 10 DEX DEX DEX MAL MAL MAL SDS SDS SDS CCS CCS CCS 60% - 70% - 80% - 60% - 70% - 80% - 60% - 70% - 80% - 60% - 70% - 80% A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Hình 3.10 Tương quan góc nghỉ tỷ lệ tá dược độn công thức A1 – A12 (n = 3) Khi phối hợp tá dược DEX, CCS, SDS tỷ lệ 80% với cao khô BT, hỗn hợp bột công thức A3, A9, A12 chảy qua phễu Góc nghỉ mức tốt tá dược CCS (35,61 ± 0,19o) mức tốt tá dược DEX (24,85 ± 0,18o) tá dược SDS (27,36 ± 0,11o) Đối với tá dược CCS dù có khối lượng riêng lớn tá dược độn khơng hình dạng cầu (Hình 1.4) nên hỗn hợp bột phối hợp với tá dược CCS có tốc độ chảy nhỏ góc nghỉ lớn so với tá dược cịn lại Đối với tá dược DEX SDS, dù hai có dạng hình cầu tá dược SDS cấu tạo có khoang rỗng (Hình 1.5) dẫn đến khối lượng riêng nhỏ (Bảng 3.3) nên khả chảy tá dược DEX Từ kết cho thấy phối hợp tá dược độn DEX, CSS, SDS, tá dược có lưu tính tốt theo hạt cao chảy giúp hỗn hợp bột đạt yêu cầu lưu tính Kết luận Khi phối hợp với tá dược DEX, CCS SDS tỷ lệ 80%, lưu tính cao khơ BT cải thiện đáng kể Khi phối hợp với tá dược MAL, lưu tính cao khơ BT khơng cải thiện nhiều 43 3.2.2.2 Ảnh hưởng hỗn hợp tá dược lên lưu tính cao khơ BT Khảo sát ảnh hưởng hỗn hợp tá dược độn lên lưu tính cao khơ BT tỷ lệ tá dược 80% (kl/kl) Trong số tá dược khảo sát, MAL tá dược cải thiện lưu tính nhất, cải thiện số nén tỷ số Hausner đến mức kém, không xác định tốc độ chảy góc nghỉ (Mục 3.2.2.1) Tuy nhiên, MAL sử dụng lượng nhỏ cơng thức kích thước hạt tá dược MAL (40 – 100 μm) nhỏ so với tá dược DEX, CCS, SDS (khoảng 150 – 300 μm) nên phối hợp MAL vào công thức làm giảm khả tách lớp hỗn hợp bột BT Ngoài ra, tá dược MAL cịn có vị giá thành rẻ, tiết kiệm chi phí sản xuất Các công thức phối hợp cao khô BT hỗn hợp tá dược độn (A13- A21) trình bày Bảng 3.5 Tỷ số Hausner công thức A13 – A21 1,5 Tỷ số Hausner 1,45 1,4 1,35 1,3 1,25 1,2 1,15 1,1 Hình 3.11 Biểu đồ so sánh tỷ số Hausner công thức A3, A6, A9, A12, A13 – A21 (n = 3) 44 Bảng 3.5 Lưu tính cơng thức phối hợp cao khơ BT hỗn hợp tá dược độn công thức A13 – A21 (n = 3) Công % thức Cao % % % DEX MAL CCS % Tỷ lệ SDS phối hợp riêng trước riêng sau tá dược gõ (g/ml) gõ (g/ml) khô BT Khối lượng Khối lượng Chỉ số nén Tỷ số Tốc độ (%) Hausner chảy (g/s) Góc nghỉ A13 20 72 0 (9:1) 0,57 ± 0,01 0,72 ± 0,01 20,51 ± 0,80 1,26 ± 0,01 38,52 ± 0,91 31,35 ± 0,11 A14 20 64 16 0 (8:2) 0,61 ± 0,01 0.76 ± 0,01 19.72 ± 0,86 1,25 ± 0,01 45,63 ± 0,98 30,59 ± 0,34 A15 20 56 24 0 (7:3) 0,62 ± 0,01 0,78 ± 0,01 20,69 ± 0,25 1,26 ± 0,01 30,52 ± 0,81 33,43 ± 0,37 A16 20 48 32 0 (6:4) 0,55 ± 0,01 0,71 ± 0,01 23,31 ± 0,96 1,30 ± 0,02 - - A17 20 72 (9:1) 0,63 ± 0,01 0,81 ± 0,01 22,52 ± 0,68 1,29 ± 0,01 - - A18 20 16 64 (8:2) 0,57 ± 0,01 0,79 ± 0,01 27,56 ± 0,70 1,38 ± 0,01 - - A19 20 72 (9:1) 0,53 ± 0,01 0,68 ± 0,01 22,15 ± 0,94 1,29 ± 0,01 41,61 ± 0,84 31,28 ± 0,58 A20 20 16 64 (8:2) 0,53 ± 0,01 0,69 ± 0,01 23,67 ± 0,78 1,31 ± 0,01 38,64 ± 0,81 31,86 ± 0,81 A21 20 24 56 (7:3) 0,51 ± 0,01 0,70 ± 0,01 27,41 ± 0,81 1,38 ± 0,02 (-) Không xác định - - 45 Kết Bảng 3.5 Hình 3.11 cho thấy, MAL phối hợp với CCS SDS (A17 – A21) tỷ số Hausner cơng thức tăng, khơng cải thiện lưu tính so với A9 A12 Tuy nhiên, phối hợp MAL với DEX, tỷ số Hausner cải thiện đến mức chảy công thức A13, A14 Công thức A14 có tỷ số Hausner tốt nhất, thay đổi đáng kể so với công thức A3 Vậy, phối hợp DEX MAL tỷ lệ 8:2 có khả cải thiện lưu tính tốt phối hợp với DEX MAL riêng lẻ Tốc độ chảy 50 Tốc độ chảy (g/s) 45 40 35 30 25 20 15 10 Hình 3.12 Biểu đồ so sánh tốc độ chảy công thức A3, A6, A9, A12, A13 –A21 (n = 3) Bảng 3.5 Hình 3.12 cho thấy, phối hợp tá dược DEX MAL, tốc độ chảy công thức A13 – A15 38,52, 45,63 30,52 g/s Trong đó, cơng thức A14 (tỷ lệ DEX: MAL 8:2) có tốc độ chảy nhanh vượt trội so với tốc độ chảy cơng thức A3 Điều MAL có kích thước hạt khối lượng riêng nhỏ, làm giảm chênh lệch khối lượng riêng thành phần công thức, tránh tách lớp dẫn đến hỗn hợp bột chảy hơn, tốc độ chảy tốt Tuy nhiên, tăng dần tỷ lệ MAL, tốc độ chảy hỗn hợp bột giảm tăng số lượng hạt có kích thước khối lượng nhỏ dẫn đến làm tăng lực tĩnh điện, lực liên kết hạt 46 làm giảm tốc độ chảy hỗn hợp bột Khi tỷ lệ DEX: MAL 6:4 (A16), hỗn hợp bột không chảy qua phễu Khi phối hợp tá dược CCS MAL, hỗn hợp bột A17 A18 không chảy qua phễu nên không xác định tốc độ chảy Điều giải thích tá dược CCS khơng dạng hình cầu (Hình 1.4) nên lưu tính so với DEX SDS Vì thế, phối hợp với tá dược MAL có kích thước khối lượng riêng nhỏ, lực tĩnh điện lực liên kết hạt tăng lên dẫn đến hỗn hợp bột A17, A18 không chảy qua phễu Khi phối hợp tá dược SDS MAL, tốc độ chảy công thức A19 A20 41,61 38,64 g/s Trong đó, cơng thức A19 (tỷ lệ CCS: MAL 9:1) có tốc độ chảy nhanh so với tốc độ chảy cơng thức A12 Điều MAL có kích thước hạt khối lượng riêng nhỏ, làm giảm chênh lệch khối lượng riêng thành phần công thức dẫn đến hỗn hợp bột chảy hơn, tốc độ chảy tốt Tuy nhiên, tăng dần tỷ lệ MAL, tốc độ chảy hỗn hợp bột giảm (Hình 3.12) tỷ lệ SDS: MAL 7:3 (A21), hỗn hợp bột khơng xác định tốc độ chảy góc nghỉ Góc nghỉ Cơng thức A16 – A18 A21 không chảy qua phễu nên không xác định góc nghỉ Cơng thức A13 – A15, A19 A20 chảy qua phễu có góc nghỉ mức tốt (A13 – A15 A19) mức (A20) Trong đó, cơng thức A14 (hỗn hợp tá dược độn DEX:MAL tỷ lệ 8:2) có góc nghỉ nhỏ (30,59o) So với công thức A19 (tỷ lệ SDS: MAL 9:1), công thức A14 (tỷ lệ DEX:MAL 8:2) có tỷ số Hausner, góc nghỉ nhỏ tốc độ chảy cao Điều giải thích tá dược DEX có khối lượng riêng trước gõ lớn (d = 0,67 ± 0,01 g/ml), cấu trúc hình cầu bề mặt gồ ghề (Hình 1.2) nên khả bắt giữ, lôi kéo hạt cao khô BT hỗn hợp bột tốt Tá dược SDS dạng hình cầu bề mặt trơn láng (Hình 1.5) khó bắt giữ hạt cao cấu trúc rỗng dẫn đến khối lượng riêng nhỏ (d = 0,56 ± 0,01 g/ml) 47 45 40 Góc nghỉ 35 30 25 20 15 10 Hình 3.13 Biểu đồ so sánh góc nghỉ công thức A3, A6, A9, A12, A13 – A21 (n = 3) Kết luận Như vậy, phối hợp 20% cao khô BT 80% hỗn hợp tá dược DEX:MAL tỷ lệ 8:2 (A14), tỷ số Hausner, số nén tốc độ chảy hỗn hợp bột cải thiện Vì vậy, hỗn hợp tá dược DEX: MAL với tỷ lệ 8:2 chọn làm tá dược độn để cải thiện lưu tính cao khơ BT 3.2.2.3 Ảnh hưởng tỷ lệ hỗn hợp tá dược DEX: MAL (8:2) lên lưu tính cao khơ BT Tiếp tục nghiên cứu khả cải thiện lưu tính hỗn hợp tá dược DEX: MAL (8:2) lên lưu tính cao khô BT với tỷ lệ cao khô BT tăng dần nhằm mục tiêu tăng tỷ lệ cao khô BT công thức thuốc bột BT Các số lưu tính cơng thức A14, A22 A23 thể Bảng 3.6 Cơng thức A22 có hỗn hợp bột chảy qua phễu với số nén (23,95 ± 0,93), tỷ số Hausner (1,32 ± 0,02) mức chảy được, góc nghỉ (35,31 ± 0,34o) mức tốt tốc độ chảy (23,34 ± 0,73 g/s) So với cơng thức A14, cơng thức A22 có lưu tính Cơng thức A22 có tỷ lệ cao khơ BT tăng đến 30% dẫn đến tăng tỷ lệ hạt có kích thước khối lượng riêng nhỏ nên lưu tính cơng thức A22 giảm 48 Bảng 3.6 So sánh số lưu tính cơng thức A14, A22 A23 (n = 3) Công thức A14 A22 A23 % Cao khô BT 20 30 40 % DEX 64 56 48 % MAL 16 14 32 0,61 ± 0,01 0,54 ± 0,01 0,45 ± 0,00 0,76 ± 0,01 0,70 ± 0,01 0,60 ± 0,01 Chỉ số nén (%) 19,72 ± 0,86 23,95 ± 0,93 23,98 ± 0,80 Tỷ số Hausner 1,25 ± 0,01 1,32 ± 0,02 1,32 ± 0,01 Tốc độ chảy (g/s) 45,63 ± 0,98 23,34 ± 0,73 - Góc nghỉ 30,59 ± 0,34 35,31 ± 0,34 - Khối lượng riêng trước gõ (g/ml) Khối lượng riêng sau gõ (g/ml) Công thức A23 (tỷ lệ cao khô BT 40%) không chảy qua phễu nên khơng xác định tốc độ chảy góc nghỉ Như vậy, tăng tỷ lệ cao khô BT lên 40% làm tăng tỷ lệ hạt có kích thước khối lượng riêng nhỏ dẫn đến lực tĩnh điện lực liên kết hạt hỗn hợp bột tăng làm hỗn hợp bột không chảy qua phễu Kết luận Công thức A22 phối hợp 30% cao khô BT 70% hỗn hợp tá dược, DEX: MAL (8:2) có thơng số lưu tính: tỷ số Hausner số nén mức chảy được, góc nghỉ mức tốt tốc độ chảy 23,34 ± 0,73 g/s Với mục tiêu cải thiện lưu tính cao khô BT, tăng tỷ lệ cao khô BT giảm lượng tá dược sản phẩm thuốc bột BT, công thức A22 chọn làm công thức thuốc bột BT Thành phần công thức thuốc bột BT thể Bảng 3.7 49 Bảng 3.7 Công thức thuốc bột BT chọn STT Thành phần Tỷ lệ (%) (kl/kl) Cơng thức cho gói (mg) Cao khô BT 30 2000 DEX 56 3733 MAL 14 933 Tổng khối lượng 6666 3.2.3 Quy trình bào chế thuốc bột BT quy mơ kg Điều kiện: nhiệt độ 25 ± oC, độ ẩm khơng q 50% Quy trình bào chế thuốc bột BT quy mơ kg trình bày Hình 3.14 Kiểm nguyên liệu đầu vào Cân riêng tá dược cao khô BT Rây MAL, DEX cao khô BT qua rây 0,5 mm Trộn tá dược MAL cao khô BT Trộn hỗn hợp bột với tá dược DEX Kiểm tra bán thành phẩm Đóng gói Kiểm tra thành phẩm Lưu mẫu Hình 3.14 Quy trình bào chế thuốc bột BT quy mô kg Chuẩn bị nguyên liệu, tá dược: - Kiểm nghiệm nguyên liệu đầu vào 50 - Cân riêng tá dược cao khô BT - Rây maltodextrin, dextrose cao khơ BT qua rây có mắt rây 0,5 mm Pha chế - Trộn theo nguyên tắc đồng lượng: trộn tá dược MAL với cao khơ BT, sau thêm tá dược DEX vào trộn đồng Đóng gói - Thiết bị: máy ép túi bột biên dạng cốc đong - Bao bì: màng PET12/PE20/Al7/LLDPE37 3.2.4 So sánh lưu tính thời gian hịa tan thuốc bột BT thuốc cốm BT 3.2.4.1 Bào chế thuốc cốm từ cao khô BT Tiến hành bào chế thuốc cốm từ cao khô BT sử dụng tá dược độn MAL (tá dược thường quy bào chế thuốc cốm hòa tan) so sánh với thuốc bột BT xây dựng cơng thức Hình 3.15 cho thấy, cốm BT B24, B25 màu nâu, mùi dược liệu B24 B25 Hình 3.15 Hình chụp cốm BT cơng thức B24, B25 3.2.4.2 Kích thước hạt lưu tính thuốc cốm BT Phân bố kích thước hạt thuốc cốm BT B24, B25 thể Bảng 3.8 Lưu tính thuốc bột A22 thuốc cốm BT B24, B25 trình bày Bảng 3.9 51 Bảng 3.8 Phân bố kích thước hạt thuốc cốm BT B24, B25 (n = 3) Tỷ lệ % (kl/kl) Công > 0,355 mm > 0,180 mm > 0,125 mm > mm B24 41,59 ± 2,06 48,56 ± 1,70 6,14 ± 0,25 3,06 ± 0,15 0,55 ± 0,02 B25 51,72 ± 2,19 35,13 ± 1,75 8,43 ± 0,41 3,86 ± 0,18 0,86 ± 0,03 thức > 0,710 mm Bảng 3.9 So sánh số lưu tính cơng thức A22, B24 B25 (n = 3) Công thức A22 B24 B35 % Cao khô BT 30 30 40 % DEX 56 0 % MAL 14 70 60 0,54 ± 0,01 0,62 ± 0,01 0,55 ± 0,01 0,70 ± 0,01 0,71 ± 0,02 0,61 ± 0,01 Chỉ số nén (%) 23,95 ± 0,93 12,59 ± 0,15 10,55 ± 0,97 Tỷ số Hausner 1,32 ± 0,02 1,14 ± 0,01 1,12 ± 0,01 Tốc độ chảy (g/s) 23,34 ± 0,73 69,20 ± 2,67 61,45 ± 1,69 Góc nghỉ 35,31 ± 0,34 25,10 ± 0,56 26,82 ± 1,34 Khối lượng riêng trước gõ (g/ml) Khối lượng riêng sau gõ (g/ml) Bảng 3.9 cho thấy, cơng thức cốm B24, cốm B25 có số nén, tỷ số Hausner mức tốt, góc nghỉ mức tốt So với thuốc bột BT công thức A22, thuốc cốm BT cơng thức B24, B25 có lưu tính tốt Nguyên nhân kích thước thuốc cốm BT B24, B25 (Bảng 3.8) lớn đáng kể so với kích thước thuốc bột BT A22 (20 – 220 µm) nên lực liên kết hạt thuốc cốm BT B24, B25 thuốc bột BT A22 dẫn đến lưu tính thuốc cốm BT B24, B25 tốt 3.2.4.3 So sánh thời gian hòa tan thuốc bột BT thuốc cốm BT Thời gian hòa tan thuốc bột BT A22, thuốc cốm BT B24, B25 thể Bảng 3.10 52 Bảng 3.10 Thời gian hòa tan thuốc bột BT A22 thuốc cốm BT B24, B25 (n = 3) Thời gian hòa tan (giây) A22 B24 B25 Lần 20,97 78,15 61,01 Lần 19,26 74,06 65,32 Lần 21,06 79,83 67,23 TB 20,43 77,35 64,52 SD 1,01 2,97 3,19 RSD (%) 4,96 3,84 4,94 Kết Bảng 3.10 cho thấy, điều kiện khảo sát, thời gian hòa tan thuốc bột A22 nhanh (20,43 ± 1,01 giây), thời gian hòa tan thuốc cốm B25 (64,52 ± 3,19 giây), thuốc cốm B24 (77,35 ± 2,97 giây) Kích thước hạt thuốc bột BT A22 (20 – 220 µm) nhỏ đáng kể so với kích thước hạt thuốc cốm B24, B25 (Bảng 3.8) nên diện tích bề mặt tiếp xúc với dung môi lớn dẫn đến thời gian hòa tan nhanh hơn52 Khi tăng tỷ lệ cao khơ BT thuốc cốm, thời gian hịa tan công thức B25 (40% cao khô BT) ngắn so với công thức B24 (30% cao khô BT) Kết luận: Thuốc bột BT A22 thuốc cốm BT B24, B25 có khả chảy qua phễu thuốc cốm BT B24, B25 có thời gian hịa tan lâu đáng kể so với thuốc bột A22 Như vậy, công thức thuốc bột BT A22 cho thấy ưu điểm tốc độ hòa tan phù hợp để phát triển sản phẩm tiện dụng từ cao khô BT 3.3 XÂY DỰNG TCCS CỦA THUỐC BỘT BT 3.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT 53 3.3.1.1 Xây dựng quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT  Khảo sát dung môi chuẩn bị mẫu thử Kết SKLM phân tích thành phần dịch chiết thuốc bột BT chuẩn bị mẫu thử 04 dung môi khác (nước, methanol, acetonitril, ethanol 96%) trình bày Hình 3.16 Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Hệ dung môi: Cloroform – methanol – nước (60:40:10, lớp dưới) Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC ACN : dịch chiết acetonitril Et : dịch chiết ethanol 96 % Me : dịch chiết methanol N : dịch chiết nước Asp : Chất đối chiếu acid asperulosidic Hình 3.16 SKLM phân tích mẫu thử thuốc bột BT chuẩn bị dung mơi khác Kết SKLM (Hình 3.16) cho thấy dung môi ethanol 96%, methanol nước chiết acid asperulosidic Acetonitril dung môi không chiết acid asperulosidic Methanol dung môi cho vết acid asperulosidic thành phần dịch chiết đậm nhất, chứng tỏ methanol dung môi chiết nhiều acid asperulosidic Vì vậy, methanol chọn làm dung mơi chiết xuất acid asperulosidic từ thuốc bột BT để điều chế mẫu thử  Khảo sát tỉ lệ khối lượng thuốc bột BT: thể tích dung mơi Kết khảo sát hàm lượng acid asperulosidic thuốc bột BT xác định với 02 tỷ lệ thuốc bột BT: methanol khác thể Bảng 3.11 Phân tích thống kê cho thấy, lượng acid asperulosidic chiết với 02 tỷ lệ khảo sát khác khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Như vậy, với lượng thuốc bột BT, tăng gấp đôi lượng dung môi methanol chiết, lượng acid asperulosidic chiết không tăng thêm Vậy, dung môi methanol với tỷ lệ thuốc bột BT: 54 methanol (300:25) chọn làm điều kiện chiết xuất acid asperulosidic phương pháp chuẩn bị mẫu thử định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Bảng 3.11 Hàm lượng acid asperulosidic thuốc bột BT với tỉ lệ khối lượng thuốc bột BT: thể tích methanol khảo sát khác Tỷ lệ thuốc bột BT : Hàm lượng acid asperulosidic methanol (mg/ml) thuốc bột BT (%) 0,0966 300:25 0,0971 0,0963 0,0959 300:50 0,0973 0,0955  Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Kết HPLC khảo sát chương trình pha động (Bảng 2.6) định lượng acid asperulosid mẫu thử thể Hình 3.17 Điều kiện II Điều kiện I Hình 3.17 Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thuốc bột BT với điều kiện sắc ký khảo sát Kết khảo sát chương trình pha động (Hình 3.17) cho thấy với điều kiện sắc ký I, pic acid asperulosidic sắc ký đồ khơng tách hồn tồn khỏi pic tạp Với điều kiện sắc ký II, pic acid asperulosidic sắc ký đồ tách khỏi pic tạp 55 đạt yêu cầu pic định lượng phương pháp phân tích HPLC Như vậy, điều kiện sắc ký II chọn để định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT  Quy trình định lượng acid asperulodic thuốc bột BT Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân xác khoảng mg acid asperulosidic chuẩn vào bình định mức 10 ml, thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 300 mg thuốc bột BT cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Điều kiện HPLC: Hệ thống sắc ký: Hệ thống Shimadzu LC-2030C 3D plus (Nhật Bản) Đầu dò: PDA Cột: C18 Shimpack GIST, 250 x 4,6 mm; µm Nhiệt độ cột: 30 0C Thể tích tiêm: 10 µl Tốc độ dịng: ml/phút Phát hiện: Bước sóng 236 nm Pha động: acetonitril dung dịch H3PO4 0,1% với tỷ lệ 9,5:90,5 Hàm lượng acid asperulosidic (%) thuốc bột BT tính theo cơng thức: X % = St ×C×25 ×100 Sc ×mt St , Sc :Diện tích pic acid asperulosidic mẫu thử mẫu chuẩn C : Nồng độ dung dịch acid asperulosidic chuẩn (mg/ml) mt : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) A : Hàm lượng acid asperulosidic chuẩn 3.3.1.2 Thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT  Tính tương thích hệ thống Kết khảo sát tính tương thích hệ thống phương pháp định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT trình bày Bảng 3.12 56 Độ lệch chuẩn tương đối (% RSD) thời gian lưu (tR), diện tích (S) pic acid asperulosidic nhỏ 2% Hệ số bất đối, độ phân giải, số đĩa lý thuyết đạt u cầu phân tích Kết luận: Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC đạt tính tương thích hệ thống Bảng 3.12 Tính tương thích hệ thống quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT STT tR (phút) S (mAU.s) Độ phân Độ phân Hệ số bất giải RS1 giải RS2 đối N 10,57 90853 1,71 1,67 0,99 8027 10,48 91126 1,71 1,64 0,99 8113 10,34 92709 1,72 1,68 0,98 7954 10,42 91011 1,69 1,66 0,95 8239 10,53 89532 1,70 1,68 1,00 8412 10,49 91665 1,72 1,64 1,00 8125 TB 10,47 91149,33 1,71 1,66 0,99 8145 SD 0,08 1041,32 - - - - % RSD 0,78 1,14  Độ đặc hiệu Kết phân tích mẫu trắng, mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu thử thêm chuẩn phương pháp HPLC trình bày Hình 3.18 Nhận xét: - Sắc ký đồ mẫu trắng khơng có pic thời gian lưu acid asperulosidic mẫu đối chiếu mẫu thử - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu acid asperulosidic mẫu đối chiếu Pic acid asperulosidic tách hoàn toàn mẫu đối chiếu mẫu thử - Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu có chiều cao diện tích pic acid asperulosidic tăng lên so với mẫu thử 57 - Độ tinh khiết pic acid asperulosidic mẫu chuẩn mẫu thử đạt yêu cầu kiểm tra độ tinh khiết Mẫu trắng Mẫu chuẩn Mẫu thử thêm chuẩn Mẫu thử Hình 3.18 Sắc ký đồ HPLC khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT (tR acid asperulosidic khoảng 10,5 phút) (a) (b) Hình 3.19 Độ tinh khiết pic acid asperulosidic (a) mẫu đối chiếu (b) mẫu thử Kết luận: Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC đạt tính đặc hiệu 58  Tính tuyến tính Kết khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng acid asperulosidic trình bày Bảng 3.13 Hình 3.20 Diện tích đỉnh Bảng 3.13 Tương quan diện tích pic nồng độ acid asperulosidic 800000 700000 600000 500000 400000 300000 200000 100000 0,00 Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh 7,6 64942 15,3 122115 27,3 233180 38,2 321569 54,5 445127 81,8 700516 y = 8515922,02x R² = 0,9987 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 Nồng độ mg/ml Hình 3.20 Tương quan diện tích pic nồng độ acid asperulosidic Sử dụng phần mềm Ms – Excel 2010 trắc nghiệm thống kê cho có tương quan tuyến tính diện tích pic nồng độ acid asperulosidic Kết xử lý thống kê trình bày Bảng 3.14 Nhận xét: Kết xử lý thống kê cho thấy - Giá trị F thực nghiệm lớn giá trị Significance F nên phương trình hồi quy tương thích - Giá trị P-value hệ số B0 nhỏ giá trị α nên hệ số B0 có ý nghĩa - Giá trị P-value hệ số B lớn giá trị α nên hệ số B khơng có có ý nghĩa 59 Vậy, phương trình hồi quy tuyến tính acid asperulosidic là: ŷ = 8515922,02x (R2 = 0,9987) Bảng 3.14 Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Thông số Acid asperulosidic R2 0,9987 Phương trình hồi quy ŷ = B0x + B ŷ = 8515922,0196x - 4409,3960 Hệ số B0 8515922,0196 Hệ số B - 4409,3960 α 0,05 F 3095,0355 Significance F 6,25 x 10-7 P-value B0 6,25 x 10-7 P-value B 0,5571 Khoảng nồng độ khảo sát (mg/ml) 0,0076-0,0818 Kết luận: Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC đạt tính tuyến tính  Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Kết xác định nồng độ giới hạn LOD thể Bảng 3.15 Bảng 3.15 Kết xác định nồng độ giới hạn LOD Nồng độ acid asperulosidic 40 10 0,4 0,08 340259 85076 14956 2837 786 0,008 (µg/ml) Diện tích pic Nhận xét: - Nồng độ 0,008 µg/ml khơng xuất tín hiệu acid asperulosidic Khơng có tín hiệu 60 - Nồng độ dung dịch chuẩn 0,08 µg/ml ghi nhận tín hiệu S/N = (đạt khoảng từ 2-3) Kết luận: Giới hạn phát (LOD) phương pháp 0,08 µg/ml Giới hạn định lượng (LOQ) = × LOD = 0,24 µg/ml  Độ lặp lại độ xác trung gian Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT trình bày Bảng 3.16 Bảng 3.16 Độ lặp lại quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Ngày Ngày Diện tích Hàm lượng acid Diện tích Hàm lượng acid đỉnh asperulosidic (%) đỉnh asperulosidic (%) 93125 0,0994 91509 0,0976 91245 0,0969 92156 0,0978 90448 0,0957 90237 0,0954 89973 0,0965 92285 0,0990 92162 0,0979 91937 0,0976 91125 0,0971 90264 0,0962 STT TB 0,0972 0,0973 SD 0,0013 0,0013 %RSD 1,2993 1,3073 Giá trị thống kê ngày TB 0,0973 SD 0,0012 %RSD 1,2430 Nhận xét: Hàm lượng trung bình acid asperulosidic thuốc bột BT 0,0973% RSD nhỏ 2% 61 Kết luận: Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC đạt yêu cầu độ lặp lại  Độ Kết khảo sát độ quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT trình bày Bảng 3.17 Bảng 3.17 Độ phương pháp định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Mức nồng độ Lượng chuẩn Lượng chuẩn Tỉ lệ hồi Giá trị trung thêm (%) cho vào (mg) tìm thấy (mg) phục (%) bình (%) 0,2081 94,58 0,2105 95,68 0,2007 91,22 0,2581 99,28 0,2468 94,94 0,2568 98,79 0,3192 99,76 0,3132 97,86 0,3074 96,05 80 0,22 100 0,26 120 0,32 TB = 93,83% RSD = 2,47% TB = 97,67% RSD = 2,44% TB = 97,89% RSD = 1,9% Nhận xét: Kết Bảng 3.17 cho thấy hàm lượng trung bình acid asperulosidic thuốc bột BT 0,0973% Theo yêu cầu độ hồi phục RSD tương ứng với nồng độ chất phân tích (Bảng 2.8), tỷ lệ phục hồi cho phép phương pháp định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT nằm khoảng 90 - 107 % RSD < 5,3%49 Kết luận: Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC đạt yêu cầu độ 62  Kết luận Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC thẩm định đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ xác trung gian độ 3.3.2 Xây dựng TCCS thuốc bột BT 3.3.2.1 Kiểm nghiệm 03 lô thuốc bột BT 03 lô thuốc bột BT kiểm nghiệm với tiêu cảm quan, độ ẩm, độ đồng khối lượng, tro tồn phần, tro khơng tan acid, giới hạn kim loại nặng, giới hạn vi sinh vật, định tính định lượng  Cảm quan Hình chụp 03 lơ thuốc bột BT trình bày Hình 3.21 Lơ Lơ Lơ Hình 3.21 Hình chụp 03 lơ thuốc bột BT Thuốc bột BT dạng bột mịn, khô tơi, đồng nhất, màu nâu, mùi dược liệu  Độ ẩm Kết độ ẩm 03 lơ thuốc bột BT trình bày Bảng 3.18 Độ ẩm thuốc bột BT nhỏ 9,0% Vậy, thuốc bột BT đạt yêu cầu độ ẩm thuốc bột theo DĐVN V Dựa vào kết độ ẩm, mức giới hạn chọn tiêu độ ẩm thuốc bột BT là: Không 9,0% 63 Bảng 3.18 Độ ẩm 03 lô thuốc bột BT Độ ẩm (%) Lô 8,16 Lô 8,25 Lô 8,47 Trung bình 8,30 ± 0,14  Giới hạn vi sinh vật Kết xác định giới hạn vi sinh vật 03 lô thuốc bột BT thể Bảng 3.19 Bảng 3.19 Giới hạn nhiễm khuẩn 03 lô thuốc bột BT Vi khuẩn Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) Lơ Lơ Lơ 2790 2050 3200 Nấm men (CFU/g) Không phát Vi khuẩn Gram âm dung nạp mật (CFU/g) Không phát Salmonella enterica Không phát Escherichia coli Không phát Staphylococcus aureus Không phát Giới hạn vi sinh vật 03 lô thuốc bột BT đạt yêu cầu DĐVN V  Độ đồng khối lượng Kết độ đồng khối lượng 03 lô thuốc bột BT trình bày Bảng 3.20 Kết Bảng 3.20 cho thấy 03 lô thuốc bột BT có khối lượng trung bình 6,6687g (lơ 1), 6,6734g (lô 2) 6,6755g (lô 3) gói vượt giới hạn 7,5% so với khối lượng gói trung bình Vậy, 03 lơ thuốc bột BT đạt tiêu chuẩn độ đồng khối lượng thuốc bột theo DĐVN V 64 Bảng 3.20 Độ đồng khối lượng 03 lô thuốc bột BT Gói Khối lượng gói (g) Lơ Lơ Lô 6,6798 6,7051 6,6705 6,6445 6,7218 6,7453 6,6846 6,6906 6,6595 6,7327 6,6720 6,7007 6,7173 6,6104 6,6014 6,6467 6,6734 6,6190 6,7623 6,6671 6,7498 6,6848 6,6770 6,7252 6,7098 6,7149 6,7365 10 6,7035 6,6393 6,5336 11 6,6785 6,7094 6,5971 12 6,6001 6,6719 6,5810 13 6,6057 6,5735 6,8272 14 6,6081 6,6608 6,6655 15 6,5630 6,6687 6,7304 16 6,6834 6,8072 6,8211 17 6,6487 6,5502 6,7264 18 6,5885 6,6066 6,5275 19 6,6257 6,7854 6,6735 20 6,8060 6,6621 6,6197 KLTB 6,6687 6,6734 6,6755 Giới hạn 6,1685 6,1729 6,1749 Giới hạn 7,1688 7,1739 7,1762  Định tính Kết định tính thuốc bột BT phương pháp SKLM trình bày Hình 3.22, Hình 3.23 Hình 3.24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 Định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng Dung môi khai triển: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1, lớp trên) Thuốc thử phát hiện: dung dịch acid sulfuric 10% ethanol TB: thuốc bột BT; Asp: Chất đối chiếu acid asperulosidic N: Dược liệu Nhàu; ĐL: Dược liệu Đinh lăng AO: Chất đối chiếu 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--Dglucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester TB N ĐL Asp AO Hình 3.22 SKLM định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng thuốc bột BT Định tính dược liệu Râu mèo Dung mơi khai triển: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) Điều kiện phát hiện: ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm TB: thuốc bột BT; Sine: Chất đối chiếu sinensetin RM: Dược liệu Râu mèo TB RM Sine Hình 3.23 SKLM định tính dược liệu Râu mèo thuốc bột BT Định tính dược liệu Mía dị Dung mơi khai triển: Cloroform – methanol – nước (65:35:10, lớp dưới) Thuốc thử phát hiện: dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT) TB: thuốc bột BT MD: Dược liệu Mía dị TB MD Hình 3.24 SKLM định tính dược liệu Mía dị thuốc bột BT Sắc ký đồ SKLM thuốc bột BT có vết màu giá trị Rf với vết tương ứng với chuẩn acid asperulosidic, sinensetin, 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 66 glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester dược liệu đối chiếu Mía dò  Định lượng Kết định lượng acid asperulosidic 03 lơ thuốc bột BT trình bày Bảng 3.21 Bảng 3.21 Hàm lượng acid asperulosidic 03 lô thuốc bột BT Hàm lượng acid asperulosidic (%) Khối lượng acid asperulosidic 01 gói (mg) Lơ 0,0978 6,52 Lô 0,0990 6,61 Lô 0,0994 6,64 Trung bình 0,0987 6,59 % RSD 0,8365 0,95 Hàm lượng acid asperulosidic thấp thuốc bột BT 0,0978% (lô 01) Đề xuất tiêu chí định lượng thuốc bột BT: Hàm lượng acid asperulosidic không thấp 0,06% thuốc bột BT (tương ứng với 4,0 mg acid asperulosidic 01 gói) 3.3.2.2 Dự thảo TCCS thuốc bột BT Từ kết kiểm nghiệm 03 lô thuốc bột BT, đề xuất TCCS thuốc bột BT Bảng 3.22 Phụ lục 3.4 SƠ BỘ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC BỘT BT Thuốc bột BT đóng gói với bao bì cấp 01 trình bày Hình 3.25 Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn (nhiệt độ 30 ± oC độ ẩm 75 ± 5%) ĐKBQ cấp tốc (nhiệt độ 40 ± oC độ ẩm 75 ± 5%) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 67 Bảng 3.22 Dự thảo TCCS thuốc bột BT STT Chỉ tiêu Cảm quan Độ ẩm Độ đồng khối lượng Giới hạn nhiễm khuẩn Định tính Định lượng Phương pháp Đánh giá cảm quan Tiến hành theo DĐVN V, PL 9.6 Tiến hành theo DĐVN V, PL 11.3 Mức chất lượng Bột mịn, khô tơi, màu nâu, mùi dược liệu Khơng q 9% Khối lượng trung bình ± 7,5% Tiến hành theo Tổng số vi sinh vật hiếu khí: Khơng DĐVN V, PL 13.6 104 CFU/g Tổng số nấm men – mốc: Không 102 CFU/g Tổng số vi khuẩn gram âm không dung nạp mật: Không 102 CFU/g Escherichia coli, Staphylococcus aureus: Khơng có g Salmonella: Khơng có 10 g SKLM Sắc ký đồ SKLM thuốc bột BT có vết màu giá trị Rf với vết tương ứng với chuẩn acid asperulosidic, sinensetin, 3-O--D-glucopyranosyl(14)--D glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O--Dglucopyranosyl ester dược liệu đối chiếu Mía dị HPLC Hàm lượng acid asperulosidic không thấp 0,06% (tương ứng với 4,0 mg acid asperulosidic 01 gói) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 68 A B Hình 3.25 Mặt trước (A) mặt sau (B) bao bì cấp thuốc bột BT 3.4.1 Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc 3.4.1.1 Cảm quan Cảm quan thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc trình bày Hình 3.26 Tháng Tháng Tháng Hình 3.26 Thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc Nhận xét: ĐKBQ cấp tốc sau 03 tháng không ảnh hưởng đến cảm quan thuốc bột BT Thuốc bột BT mịn, khô tơi, màu nâu, mùi dược liệu 3.4.1.2 Độ ẩm Kết độ ẩm thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc trình bày Bảng 3.23 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 Bảng 3.23 Độ ẩm thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc Độ ẩm (%) Tháng Tháng Tháng Lô 8,16 8,42 8,67 Lô 8,25 8,37 8,63 Lơ 8,47 8,38 8,72 Trung bình 8,30 ± 0,15 8,39 ± 0,03 8,67 ± 0,04 Nhận xét: Sau 03 tháng ĐKBQ cấp tốc, độ ẩm thuốc bột BT tăng nhẹ đạt TCCS đề 3.4.1.3 Định tính Kết định tính thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc trình bày Hình 3.27, Hình 3.28 Hình 3.29 Định tính dược liệu Râu mèo TB RM Sine TB Tháng RM Sine TB Tháng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 RM Sine Tháng Phát hiện: UV 365 nm Hệ dung môi: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) TB: thuốc bột BT; Sine: Chất đối chiếu sinensetin RM: Dược liệu Râu mèo Hình 3.27 Kết định tính dược liệu Râu mèo thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 70 Định tính dược liệu Mía dị TB MD TB Tháng MD TB Tháng MD Tháng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC Hệ dung môi: Cloroform – methanol – nước (65:35:10) TB: Thuốc bột BT; MD: Dược liệu đối chiếu Mía dị Hình 3.28 Kết định tính dược liệu Mía dị thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc Định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng TB N ĐL Asp AO Tháng TB N ĐL Asp AO TB Tháng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 N ĐL Asp AO Tháng Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC Hệ dung môi: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1) TB: thuốc bột BT; Asp: Chất đối chiếu acid asperulosidic N: Dược liệu Nhàu; ĐL: Dược liệu Đinh lăng AO: Chất đối chiếu 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D-glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester Hình 3.29 Kết định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 71 Nhận xét: Sau 03 tháng ĐKBQ cấp tốc, kết định tính thuốc bột BT đạt TCCS đề 3.4.1.4 Định lượng Kết định lượng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc trình bày Bảng 3.24 Bảng 3.24 Kết định lượng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ cấp tốc Hàm lượng acid asperulosidic (%) Tháng Tháng Tháng Lô 0,0978 0,0976 0,0973 Lô 0,0990 0,0980 0,0961 Lơ 0,0994 0,0990 0,0976 Trung bình 0,0987 0,0982 0,0970 % RSD 0,8365 0,7241 0,7953 Nhận xét: Hàm lượng acid asperulosidic ĐKBQ cấp tốc giảm nhẹ 03 tháng đạt TCCS đề 3.4.2 Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn 3.4.2.1 Cảm quan Cảm quan thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn trình bày Hình 3.30 Tháng Tháng Tháng Hình 3.30 Hình chụp thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 72 Nhận xét: ĐKBQ dài hạn sau 03 tháng không ảnh hưởng đến cảm quan thuốc bột BT Thuốc bột BT mịn, khô tơi, màu nâu, mùi dược liệu 3.4.2.2 Độ ẩm Kết độ ẩm thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn trình bày Bảng 3.25 Bảng 3.25 Độ ẩm thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn Độ ẩm (%) Tháng Tháng 8,16 8,19 Lần Tháng 8,48 Lần 8,25 8,26 8,40 Lần 8,47 8,38 8,67 Trung bình 8,30 ± 0,15 8,28 ± 0,09 8,52 ± 0,14 Nhận xét: Độ ẩm thuốc bột BT sau 03 tháng ĐKBQ dài hạn đạt TCCS thuốc bột BT 3.4.2.3 Định tính Kết định tính thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn trình bày Hình 3.31, Hình 3.32 Hình 3.33 Định tính dược liệu Râu mèo TB RM Sine TB Tháng RM Sine Tháng TB RM Sine Tháng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Phát hiện: UV 365 nm Hệ dung môi: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) TB: thuốc bột BT; Sine: Chất đối chiếu sinensetin RM: Dược liệu Râu mèo Hình 3.31 Kết định tính dược liệu Râu mèo thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 73 Định tính dược liệu Mía dị TB MD TB Tháng MD TB Tháng MD Tháng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC Hệ dung môi: Cloroform – methanol – nước (65:35:10) TB: thuốc bột BT; MD: Dược liệu đối chiếu Mía dị Hình 3.32 Kết định tính dược liệu Mía dị thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn Định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng TB N ĐL Asp AO Tháng TB N ĐL Asp AO TB Tháng Bản mỏng: Silica gel 60 F254 N ĐL Asp AO Tháng Phát hiện: H2SO4 10%/EtOH sấy 105 oC Hệ dung môi: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1) TB: thuốc bột BT; Asp: Chất đối chiếu acid asperulosidic N: Dược liệu Nhàu; ĐL: Dược liệu Đinh lăng AO: Chất đối chiếu 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D-glucuronopyranosyloleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester Hình 3.33 Kết định tính dược liệu Nhàu Đinh lăng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 Nhận xét: Kết định tính thuốc bột BT sau 03 tháng ĐKBQ dài hạn đạt TCCS thuốc bột BT 3.4.2.4 Định lượng Kết định lượng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn trình bày Bảng 3.26 Bảng 3.26 Kết định lượng thuốc bột BT sau 0, 1, tháng ĐKBQ dài hạn Hàm lượng acid asperulosidic (%) Tháng Tháng Tháng Lần 0,0978 0,0985 0,0968 Lần 0,0990 0,0982 0,0986 Lần 0,0994 0,0989 0,0984 Trung bình 0,0987 0,0985 0,0979 % RSD 0,8365 0,5201 0,9900 Nhận xét: Hàm lượng acid asperulosidic ĐKBQ dài hạn giảm nhẹ 03 tháng đạt TCCS đề Kết tóm tắt khảo sát sơ độ ổn định thuốc bột BT 02 ĐKBQ dài hạn ĐKBQ cấp tốc trình bày Bảng 3.28 3.4.3 Ước tính tuổi thọ thuốc bột BT Ước tính tuổi thọ thuốc (t90) ĐKBQ nhiệt độ 30oC độ ẩm 75% Bảng 3.27 Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc Tháng Hàm lượng hoạt chất (D%) Ln (D%) 0,0987 -2,3157 0,0982 -2,3207 0,0970 -2,3330 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 75 Bảng 3.28 Kết sơ nghiên cứu độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn ĐKBQ cấp tốc 03 tháng Thời Điều kiện bảo quản gian (tháng) Cảm quan Dạng bột mịn, khô tơi, đồng nhất, màu nâu trắng, mùi dược liệu Độ ẩm (%) ≤ 9,00 Định tính Dược liệu Nhàu, Đinh lăng, Râu mèo, Mía dị Hàm lượng acid asperulosidic (%) 0,0600 Ban đầu Đạt 8,30 Đạt 0,0987 Nhiệt độ 30 ± 2oC Đạt 8,28 Đạt 0,0985 Độ ẩm tương đối 70 ± 5% Đạt 8,52 Đạt 0,0979 Nhiệt độ 40 ± 2oC Đạt 8,39 Đạt 0,0982 Độ ẩm tương đối 70 ± 5% Đạt 8,67 Đạt 0,0970 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 76 -2,315 y = -0,0058x - 2,3154 Ln [D%] -2,32 R² = 0,9976 -2,325 -2,33 -2,335 0,5 1,5 2,5 3,5 Thời gian (tháng) Hình 3.34 Đường biểu diễn Ln[D%] theo thời gian Bảng 3.29 Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính Ln[D%] theo thời gian Thơng số Acid asperulosidic R2 0,9976 Phương trình hồi quy ŷ = B0x + B ŷ = -0,0058x – 2,3154 Hệ số B0 -0,0058 Hệ số B -2,3154 α 0,05 F 487,9407 Significance F 0,0311 P-value B0 0,0311 P-value B 0,0001 Nhận xét: Kết xử lý thống kê (Bảng 3.29) cho thấy - Giá trị F thực nghiệm lớn giá trị Significance F nên phương trình hồi quy tương thích - Giá trị P-value hệ số B0 nhỏ giá trị α nên hệ số B0 có ý nghĩa - Giá trị P-value hệ số B nhỏ giá trị α nên hệ số B có ý nghĩa Vậy, phương trình hồi quy tuyến tính Ln[D%] là: Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 ŷ = -0,0058x – 2,3154 (R2 = 0,9976) Theo cơng thức van’t Hoff ta có: k = 0,0058 Tuổi thọ thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc là: t90(40 oC) = 0,1053 k = 0,1053 0,0058 = 18,16 tháng Tuổi thọ thuốc bột BT ĐKBQ dài hạn là: C = K x C* = 2Δt/10 x C* = x 18,1551 = 36,31 tháng Kết luận: Tuổi thọ thuốc bột BT ĐKBQ thường 36 tháng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 78 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 KIỂM NGHIỆM CAO KHƠ BT Các mẫu cao khơ BT sử dụng nghiên cứu kiểm soát chất lượng theo TCCS nhằm đảm bảo tính ổn định nghiên cứu áp dụng vào sản xuất thực tế sau Kết cho thấy mẫu cao khô BT đạt yêu cầu chất lượng theo TCCS cảm quan, độ ẩm, giới hạn kim loại nặng, giới hạn vi sinh vật, định tính, định lượng giới hạn thuốc bảo vệ thực vật Các mẫu cao khô BT đạt TCCS để tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc bột BT 4.2 XÂY DỰNG CƠNG THỨC VÀ QUY TRÌNH BÀO CHẾ THUỐC BỘT BT 4.2.1 Tính chất cao khơ BT Bằng phương pháp chụp hình SEM, mẫu cao khơ BT xác định hình dạng kích thước hạt Kết cho thấy, mẫu cao khơ BT có ưu điểm hình dạng (tiểu phân hình cầu gần cầu) Tuy nhiên, điểm bất lợi cao khô BT kích thước hạt cao nằm khoảng mịn16 (khoảng 20 – 50 μm), bề mặt cao gồ ghề, dẫn đến diện tích bề mặt lớn làm tăng lực Val der Waals, lực tĩnh điện hạt với nhau, làm giảm lưu tính cao khơ BT Ngồi ra, cao khơ BT cịn có cấu trúc rỗng dẫn đến khối lượng riêng nhỏ làm giảm khả trơn chảy5 Kết khảo sát lưu tính cao khơ BT cho thấy, cao khơ BT có tỷ số Hausner số nén mức rất Bên cạnh đó, cao khơ BT khơng thể chảy tự qua phễu nên không xác định tốc độ chảy góc nghỉ Điều giải thích kích thước hạt cao khơ BT nhỏ, hạt mịn nên diện tích bề mặt tiếp xúc tiểu phân lớn dẫn đến lực tương tác hạt cao lớn nên lưu tính cao khơ BT mức rất kém16,29 Ngồi ra, bề mặt cao khơ BT cịn gồ ghề làm tăng diện tích bề mặt nên dù có dạng hình cầu lợi lực liên kết hạt lớn nên làm giảm lưu tính cao khơ BT50 Vì vậy, lưu tính cao khô BT không đạt yêu cầu để đưa vào quy trình đóng gói thuốc bột Nhằm cải thiện lưu tính cao khơ BT, số phương pháp áp dụng như: thay đổi phân bố kích thước hạt (tăng lượng hạt thơ giảm lượng hạt mịn), Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 79 giảm điện tích, lực liên kết giữ hạt, tăng lực rung máy, thêm tác nhân tăng khả chảy (tá dược trơn chảy)50… 4.2.2 Ảnh hưởng tá dược độn lên lưu tính cao khô BT Khả chảy bột bị ảnh hưởng yếu tố: kích thước hạt, hình dạng hạt, lực liên kết hạt hạt với bề mặt phễu, độ ẩm… Khi phối hợp với tá dược độn riêng lẻ, lưu tính cao khơ BT cải thiện đáng kể Khi phối hợp cao khô BT với tá dược độn MAL tỷ lệ khác nhau, hỗn hợp bột có số nén, tỷ số Hausner mức không xác định tốc độ chảy, góc nghỉ Điều tá dược MAL có kích thước nhỏ nên diện tích bề mặt tiếp xúc tiểu phân lớn dẫn đến lực tương tác hạt lớn16,29, làm giảm lưu tính hỗn hợp bột Khi phối hợp cao khơ BT với tá dược DEX, CCS, SDS (tỷ lệ 4:6 tỷ lệ 3:7), hỗn hợp bột có số nén, tỷ số Hausner mức chảy tự qua phễu Điều tỷ lệ cao khô BT hỗn hợp lớn dẫn đến hạt có kích thước khối lượng riêng nhỏ có tỷ lệ lớn, làm giảm lưu tính hỗn hợp bột Khi phối hợp cao khơ BT với tá dược độn SDS (tỷ lệ 2:8), hỗn hợp bột có số nén, tỷ số Hausner mức chảy được, góc nghỉ mức tốt Khi phối hợp cao khô BT với tá dược độn DEX CCS (tỷ lệ 2:8), số nén, tỷ số Hausner mức chảy được, góc nghỉ mức tốt Điều giải thích tá dược DEX, CCS, SDS có kích thước khối lượng riêng lớn, chiếm tỷ lệ lớn hỗn hợp bột dẫn đến giảm lực liên kết hạt với nhau, cải thiện lưu tính MAL tá dược cải thiện lưu tính so với tá dược DEX, CCS, SDS MAL sử dụng lượng nhỏ cơng thức khảo sát kích thước hạt tá dược MAL nhỏ so với tá dược DEX, CCS, SDS nên phối hợp MAL vào công thức làm giảm xu hướng tách lớp hỗn hợp bột thuốc Ngoài ra, tá dược MAL cịn có vị giá thành rẻ, tiết kiệm chi phí sản xuất Khi phối hợp 20% cao khô BT 80% hỗn hợp tá dược DEX: MAL (8:2), thuốc bột BT có tỷ số Hausner số nén mức khá, góc nghỉ mức tốt Các số lưu tính hỗn hợp bột cải thiện đáng kể so với phối hợp cao khô BT với hỗn hợp tá Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 80 dược khác Vì vậy, hỗn hợp tá dược DEX:MAL tỷ lệ 8:2 chọn để cải thiện lưu tính cao khơ BT Nhằm nâng tỷ lệ cao khô BT thuốc bột BT, hỗn hợp tá dược DEX MAL (8:2) phối hợp với 30% cao khô BT Kết cho thấy số nén, tỷ số Hausner mức chảy được, góc nghỉ mức tốt chảy tốt qua phễu Vì vậy, hỗn hợp tá dược DEX MAL (8:2) lựa chọn để phối hợp với 30% cao khô BT công thức thuốc bột BT Khi xát hạt cao khô BT với tá dược MAL tỷ lệ khác nhau, công thức thuốc cốm BT có khả cải thiện lưu tính tốt có thời gian hịa tan lâu thuốc bột BT Điều giải thích kích thước hạt thuốc bột BT nhỏ đáng kể so với kích thước hạt thuốc cốm BT nên diện tích bề mặt tiếp xúc với dung mơi lớn dẫn đến thời gian hịa tan nhanh Vì vậy, thuốc bột BT chọn để tiếp tục nghiên cứu 4.3 XÂY DỰNG TCCS THUỐC BỘT BT 4.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Acid asperulosidic chất điểm BT, phân lập từ dược liệu Nhàu (vị “Quân” BT) có tác dụng kháng viêm với chế giảm sản xuất oxid nitric (NO), prostaglandin E2 (PGE2), yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) ức chế synthase oxid cảm ứng (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2)13 Acid asperulosidic sử dụng để kiểm nghiệm tiêu chí định tính định lượng TCCS thuốc bột BT7,8,12 Acid asperulosidic thuốc bột BT định lượng phương pháp HPLC kế thừa có điều chỉnh để phù hợp với mẫu thử thuốc bột BT từ quy trình định lượng acid asperulosidic cao khơ BT Phạm Ngọc Thạc cộng sự8 Với thành phần phức tạp 13 dược liệu cao khô BT phối hợp với hỗn hợp tá dược độn DEX: MAL (8:2), quy trình điều chế mẫu thử điều kiện pha động nghiên cứu lựa chọn kết tách pic acid asperulosidic tốt Kết cho thấy, methanol chọn dung môi chuẩn bị mẫu thử methanol chiết acid Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 81 asperulosidic hiệu Tỷ lệ thuốc bột BT: methanol (300: 25 (mg/ml)) chọn để chuẩn bị mẫu thử chiết acid asperulosidic tốt với lượng dung môi thấp Pha động với acetonitril dung dịch H3PO4 0,1% (tỷ lệ 9,5:90,5) cho kết pic acid asperulosidic tách tốt Kết thẩm định quy trình cho thấy tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng, độ lặp lại, độ xác trung gian (RSD=1,24%) độ phương pháp định lượng (trong khoảng 91,22-99,76%) đạt yêu cầu Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT đáp ứng yêu cầu thẩm định áp dụng để xây dựng TCCS theo dõi chất lượng thuốc bột BT 4.3.2 Dự thảo TCCS thuốc bột BT Từ kết kiểm nghiệm 03 lô thuốc bột BT, dự thảo TCCS cho thuốc bột BT đề xuất với tiêu: cảm quan, độ ẩm, độ đồng khối lượng, giới hạn vi sinh vật, định tính, định lượng mức chất lượng phù hợp ứng dụng sản xuất, góp phần ổn định chất lượng thuốc bột BT Đặc biệt quy trình định tính SKLM định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT chưa có DĐVN V tài liệu cơng bố Vì vậy, việc xây dựng TCCS có ý nghĩa thực tiễn cho việc kiểm soát chất lượng thuốc bột BT trình sản xuất độ ổn định trình bảo quản 4.4 SƠ BỘ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH THUỐC BỘT BT Kết sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc (nhiệt độ 40 ± oC, độ ẩm tương đối RH 75 ± 5%) ĐKBQ dài hạn (nhiệt độ 30 ± oC, độ ẩm tương đối RH 75 ± 5%) cho thấy thuốc bột BT khơng có biến đổi đáng kể ảnh hưởng đến độ ổn định Thuốc bột BT có thay đổi độ ẩm định lượng đạt TCCS đề Từ kết ĐKBQ cấp tốc thuốc bột BT sau 03 tháng, tuổi thọ thuốc bột BT ĐKBQ thường ước tính khoảng 36 tháng, phù hợp để tiếp tục phát triển sản phẩm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 82 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài thực mục tiêu đề với nội dung sau: - Xây dựng công thức quy trình bào chế thuốc bột BT quy mơ kg: + Khảo sát tính chất cao khơ BT (hình dạng hạt, kích thước hạt, phân bố kích thước hạt lưu tính) + Khảo sát lưu tính thuốc bột BT phối hợp với tá dược riêng lẻ hỗn hợp tá độn + Điều chế thuốc cốm BT, so sánh lưu tính thời gian hòa tan thuốc bột BT thuốc cốm BT + - Xây dựng công thức quy trình bào chế thuốc bột BT quy mơ kg Xây dựng TCCS thuốc bột BT + Xây dựng thẩm định quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại độ + TCCS thuốc bột BT xây dựng với tiêu chí: cảm quan, độ ẩm, độ đồng khối lượng, giới hạn nhiễm khuẩn, định tính (dược liệu Nhàu, dược liệu Đinh lăng xẻ, dược liệu Râu mèo, dược liệu Mía dị) định lượng acid asperulosidic - Sơ khảo sát độ ổn định thuốc bột BT ĐKBQ cấp tốc (nhiệt độ 40 ± oC, độ ẩm tương đối RH 75 ± 5%) ĐKBQ dài hạn (nhiệt độ 30 ± oC, độ ẩm tương đối RH 75 ± 5%) với tiêu chí cảm quan, độ ẩm, định tính (dược liệu Nhàu, dược liệu Đinh lăng xẻ, dược liệu Râu mèo, dược liệu Mía dị), định lượng acid asperulosidic KIẾN NGHỊ Đề tài kiến nghị tiếp tục với nội dung sau: - Tiếp tục khảo sát độ ổn định thuốc bột BT - Đánh giá tác dụng dược lý thuốc bột BT Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 83 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Hữu Mai Lynh, Phạm Ngọc Thạc, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Võ Thanh Hóa, Phan Thanh Dũng, Nguyễn Đức Hạnh, Xây dựng quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột từ thuốc hỗ trợ điều trị thối hóa cột sống lương y Nguyễn Thiện Chung phương pháp HPLC Bản B Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Việt Nam 2022;64(9) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO Khan MSA, Ahmad I Herbal medicine: current trends and future prospects New look to phytomedicine Elsevier; 2019:3-13 Gunjan M, Naing TW, Saini RS, Ahmad A, Naidu JR, Kumar I Marketing trends & future prospects of herbal medicine in the treatment of various disease World Journal of Pharmaceutical Research 2015;4(9):132-155 Nguyễn Cao Sang, Nguyễn Lê Thanh Tuyền, Nguyễn Thị Kim Oanh, Nguyễn Đức Hạnh, Đỗ Thị Hồng Tươi Khảo sát độc tính cấp tác động giảm đau, kháng viêm thuốc Lương y Nguyễn Thiện Chung, tỉnh An Giang Tạp chí dược học 2020;529:84-88 Phạm Ngọc Thạc Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn sở cao khô sấy phun thuốc hỗ trợ điều trị thối hóa cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung 2021; Parikh DM Handbook of pharmaceutical granulation technology Drugs and the pharmaceutical sciences 2005;81 Kumadoh D, Ofori-Kwakye K Dosage forms of herbal medicinal products and their stability considerations-an overview J Crit Rev 2017;4(4):1-8 Phạm Ngọc Thạc, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Võ Thanh Hóa, Nguyễn Đức Hạnh Xây dựng phương pháp định tính số dược liệu cao chiết từ thuốc hỗ trợ điều trị thối hóa cột sống lương y Nguyễn Thiện Chung Tạp chí Y dược học 2021;(17):83-90 Phạm Ngọc Thạc, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Võ Thanh Hóa, Nguyễn Đức Hạnh Xây dựng quy trình định lượng acid asperulosidic cao chiết từ thuốc thoái hóa cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung phương pháp HPLC Tạp chí Y dược học 2020;6:83-89 Koster R Acetic acid for analgesic screening 1959:412 10 Winter CA, Risley EA, Nuss GW Carrageenin-induced edema in hind paw of the rat as an assay for antiinflammatory drugs Proceedings of the society for experimental biology and medicine 1962;111(3):544-547 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 85 11 Vogel HG, Vogel W Drug discovery and evaluation Biomedicine & Pharmacotherapy 1998;52(1):47-47 12 Phạm Ngọc Thạc, Huỳnh Trần Quốc Dũng, Võ Thanh Hóa, Hạnh NĐ Phân lập acid asperulosidic định tính dược liệu nhàu thuốc hỗ trợ điều trị thối hóa cột sống Lương y Nguyễn Thiện Chung Tạp chí Y dược học 2021;20:9096 13 He J, Lu X, Wei T, et al Asperuloside and asperulosidic acid exert an antiinflammatory effect via suppression of the NF-κB and MAPK signaling pathways in LPS-induced RAW 264.7 macrophages International journal of molecular sciences 2018;19(7):2027 14 Bộ Y Tế Dược Điển Việt Nam V Nhà xuất Hà Nội; 2017 15 Strickley RG, Iwata Q, Wu S, Dahl TC Pediatric drugs—a review of commercially available oral formulations Journal of pharmaceutical sciences 2008;97(5):1731-1774 16 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hoá Bào chế sinh dược học Nhà xuất Y học; 2013 17 Đặng Thị Yến, Đặng Quốc Tiến Nghiên cứu quy trình sản xuất trà bụt giấm hịa tan Tạp chí khoa học công nghệ thực phẩm 2020;15(1):95 18 Đỗ Thị Ngọc Mai, Huỳnh Thị Kim Trinh, Bùi Thanh Tùng, Phạm Đoàn Mẫn, Nguyễn Thị Lệ Thủy Nghiên cứu quy trình chế biến hoạt tính sinh học trà hịa tan từ sung (Ficus racemosa Linn) Tạp chí khoa học Đại học mở thành phố Hồ Chí Minh-kỹ thuật công nghệ 2019;14(1):108-121 19 Nguyễn Quốc Thịnh, Phạm Thùy Linh, Đồng Quang Huy Nghiên cứu bào chế trà tan từ Hòe hoa Thảo minh hỗ trợ điều trị tăng huyết áp TNU Journal of Science and Technology 2020;225(01):101-106 20 Tülek Z, Alaşalvar H, Başyiğit B, et al Extraction optimization and microencapsulation of phenolic antioxidant compounds from lemon balm (Melissa officinalis L.): Instant soluble tea production Journal of Food Processing and Preservation 2021;45(1):e14995 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 21 de Souza TP, Martínez-Pacheco R, Gómez-Amoza JL, Petrovick PR Eudragit E as excipient for production of granules and tablets from Phyllanthus niruri L spray-dried extract AAPS PharmSciTech 2007;8(2):E54-E60 22 Vanhoorne V, Peeters E, Van Snick B, Remon JP, Vervaet C Crystal coating via spray drying to improve powder tabletability European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics 2014;88(3):939-944 23 Etti C, Yusof YA, Chin N, Tahir SM Effects of formulation on flowability of selected herbal powders using compendial methods and powder flow analyser International Food Research Journal 2016;23:S225 24 Krantz M, Zhang H, Zhu J Characterization of powder flow: Static and dynamic testing Powder Technology 2009;194(3):239-245 25 Prescott JK, Barnum RA On powder flowability Pharmaceutical technology 2000;24(10):60-85 26 Stavrou AG, Hare C, Hassanpour A, Wu C-Y Investigation of powder flowability at low stresses: Influence of particle size and size distribution Powder Technology 2020;364:98-114 27 Valverde JM, Castellanos A, Watson PK The effect of particle size on interparticle adhesive forces for small loads Powder technology 2001;118(3):236-241 28 Podczeck F, Mia Y The influence of particle size and shape on the angle of internal friction and the flow factor of unlubricated and lubricated powders International Journal of Pharmaceutics 1996;144(2):187-194 29 Li Q, Rudolph V, Weigl B, Earl A Interparticle van der Waals force in powder flowability and compactibility International journal of pharmaceutics 2004;280(1-2):77-93 30 Teunou E, Fitzpatrick J Effect of relative humidity and temperature on food powder flowability Journal of Food Engineering 1999;42(2):109-116 31 Crouter A, Briens L The effect of moisture on the flowability of pharmaceutical excipients Aaps PharmSciTech 2014;15(1):65-74 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 87 32 Trần Tử An Kiểm Nghiệm Dược Phẩm Nhà Xuất Bản Y Học 2005 33 Yoshioka S, Stella VJ Stability of drugs and dosage forms Springer Science & Business Media; 2000 34 Ahlneck C, Zografi G The molecular basis of moisture effects on the physical and chemical stability of drugs in the solid state International journal of pharmaceutics 1990;62(2-3):87-95 35 Waterman KC, MacDonald BC Package selection for moisture protection for solid, oral drug products Journal of pharmaceutical sciences 2010;99(11):44374452 36 Unit WHOP WHO guidelines on stability testing of pharmaceutical products containing well-established drug substances in conventional dosage forms 1994 37 Asean Guideline on Stability Study of Drug Product 2013; 38 Bott R, Labuza T, Oliveira W Stability testing of spray-and spouted bed–dried extracts of Passiflora alata Drying Technology 2010;28(11):1255-1265 39 Yatsu FK, Borghetti GS, Bassani VL Technological characterization and stability of Ilex paraguariensis St Hil Aquifoliaceae (Maté) spray-dried powder Journal of medicinal food 2011;14(4):413-419 40 Jayani NIE, Hean MR, Krisnayanthi NLA, Islamie R, Rani KC, Parfati N Evaluation of stability and quality characteristics of moringa (Moringa oleifera) herbal tea during storage Food Research 2022;6(4):399-406 41 Rowe RC, Sheskey P, Quinn M Handbook of Pharmaceutical Excipients 2009 42 Gohel M, Jogani PD A review of co-processed directly compressible excipients J Pharm Pharm Sci 2005;8(1):76-93 43 Pharma J EMDEX® Brochure 2020; 44 Rouquette GLUCIDEX® Ngày truy cập 10/10, 2022 https://www.roquette.com/pharma-and-nutraceuticals-maize-maltodextrin-ii 45 Domino Food I Innovative sugars for pharmaceutical applications 2015; 46 Al-Zoubi N, Gharaibeh S, Aljaberi A, Nikolakakis I Spray drying for direct compression of pharmaceuticals Processes 2021;9(2):267 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 88 47 Tereos COMPRESSUC Ngày truy cập 10/10, 2022 https://www.signetexcipients.com/product.aspx?prdid=1035 48 Convention USP Powder Flow United States Pharmacopeia 2016 49 Huber L Validation and qualification in analytical laboratories Informa healthcare; 2007 50 Aulton ME, Taylor K Powder flow Churchill Livingstone (Elsevier) Edinburgh, Scotland; 2013 51 Bodhmage AK Correlation between physical properties and flowability indicators for fine powders Citeseer; 2006 52 Alderborn G Pharmaceutics: The science of Dosage Form Design Churchil Livingstone; 2002 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - PHỤ LỤC Phụ lục 1.  Tiêu chuẩn sở cao khô BT PL - 2  Phụ lục 2.  Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT PL - 6  Phụ lục 3.  Tiêu chuẩn sở thuốc bột BT .PL - 7  Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Phụ lục Tiêu chuẩn sở cao khô BT YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG Cảm quan: Cao dạng bột mịn, đồng nhất, màu nâu, mùi dược liệu, dễ hút ẩm Độ ẩm: Không 5% (kl/kl) Giới hạn kim loại nặng: Không 20 ppm Định tính: Trên sắc ký đồ SKLM mẫu thử phải có vết có màu giá trị Rf với vết sắc ký đồ chất đối chiếu acid asperulosidic, sinensetin, 3-O--Dglucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D- glucopyranosyl ester dược liệu đối chiếu Mía dị Định lượng: Hàm lượng acid asperulosidic không thấp 0,20% Giới hạn vi sinh vật: - Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g): khơng q 104 - Tổng số nấm (CFU/g): Không 102 - Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật (CFU/g): Khơng q 102 - Khơng có Salmonella 10 g - Khơng có Escherichia coli g Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Không phát dư lượng thuốc bảo vệ thực vật QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cảm quan: Kiểm tra cảm quan (thể chất, màu sắc, mùi ), cao khô BT phải đạt yêu cầu nêu Độ ẩm: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.6 Kim loại nặng: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.4.8, phương pháp Giới hạn vi sinh vật: Tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 13.6 Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Tiến hành theo phương pháp BS EN 15662:2017 sử dụng (GC-MS), thực Eurofins Sắc Ký Hải Đăng Định tính Phương pháp SKLM  Dược liệu Nhàu Đinh lăng xẻ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1, lớp trên) Dung dịch thử: Cân 200 mg cao khơ BT vào bình định mức 10 ml Thêm ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Dung dịch đối chiếu: Hịa tan chất đối chiếu acid asperulosidic 3-O--Dglucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D glucopyranosyl ester methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Mẫu dược liệu Nhàu: Cân 500 mg bột dược liệu Nhàu vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hịa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Mẫu dược liệu Đinh lăng xẻ: Cân 500 mg bột dược liệu Đinh lăng vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chất đối chiếu acid asperulosidic, 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester, dược liệu Nhàu dược liệu Đinh lăng xẻ  Dược liệu Râu mèo Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Dung dịch thử: Cân g cao khơ BT vào bình định mức 10 ml Thêm ml cloroform, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung cloroform đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Dung dịch đối chiếu: Hịa tan chất đối chiếu sinensetin methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Mẫu dược liệu Râu mèo: Cân 200 mg bột dược liệu Râu mèo vào bình định mức 10 ml Thêm ml cloroform, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung cloroform đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng Quan sát mỏng ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chất đối chiếu sinensetin dược liệu Râu mèo  Dược liệu Mía dị Bản mỏng: Silica gel F254 Dung mơi khai triển: Cloroform – methanol – nước (65:35:10, lớp dưới) Dung dịch thử: Cân 30 mg cao khô BT phân tán ml H2O (siêu âm phút) làm dung dịch mẫu nạp lên cột SPE C18 Lần lượt cho qua cột 30 ml dung môi H2O, MeOH 50% MeOH 60%, gom dịch rửa giải 60% cô đến cắn Thêm ml MeOH vào chén sứ để hịa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Mẫu dược liệu Mía dị: Cân 500 mg bột dược liệu Mía dị vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml MeOH, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Cân 30 mg cao Mía dị phân tán ml H2O (siêu âm phút) làm dung dịch mẫu nạp lên cột SPE C18 Lần lượt cho qua cột 30 ml dung môi H2O, MeOH 50% MeOH 60%, gom dịch rửa giải 60% cô đến cắn Thêm ml MeOH vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,22 µm Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Các vết có Rf tương ứng với dược liệu đối chiếu Mía dị tách riêng biệt với vết khác mẫu thử Định lượng Tiến hành phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký: Cột: C18 (250 mm ×4,6 mm, µm) Bước sóng phát hiện: 236 nm Tốc độ dịng: ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: Acetonitril (10%) – dung dịch acid H3PO4 0,1% nước (90%) Dung dịch chuẩn: Cân xác khoảng mg acid asperulosidic chuẩn vào bình định mức 10 ml, thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Dung dịch thử: Cân xác khoảng 500 mg cao khơ BT cho vào bình định mức 25 ml Thêm 20 ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn nồng độ acid asperulosidic dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) acid asperulosidic cao khô BT theo công thức: 𝑋 % St, Sc C mt a 𝑆 𝑆 𝐶 𝑚 25 1000 a 100 : Diện tích pic acid asperulosidic mẫu thử mẫu chuẩn : Nồng độ dung dịch acid asperulosidic chuẩn (µg/ml) : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) : Hàm lượng acid asperulosidic chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Phụ lục Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT Quy trình định lượng acid asperulosidic thuốc bột BT phương pháp HPLC Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân xác khoảng mg acid asperulosidic chuẩn vào bình định mức 10 ml, thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 300 mg thuốc bột BT cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Điều kiện HPLC: Hệ thống sắc ký: Hệ thống Shimadzu LC-2030C 3D plus Đầu dò: PDA Cột: C18 Shimpack GIST, 250 x 4,6 mm, µm Nhiệt độ cột: 30 0C Thể tích tiêm: 10 µl Tốc độ dịng: ml/phút Phát hiện: Bước sóng 236 nm Pha động: acetonitril dung dịch H3PO4 0,1% với tỷ lệ 9,5:90,5 Hàm lượng acid asperulosidic (%) thuốc bột BT tính theo công thức: 𝑋 % 𝑆 𝐶 𝑆 25 𝑚 𝑎 100 St , Sc: Diện tích pic acid asperulosidic mẫu thử mẫu chuẩn C : Nồng độ dung dịch acid asperulosidic chuẩn (mg/ml) mt : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) A : Hàm lượng acid asperulosidic chuẩn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Phụ lục Tiêu chuẩn sở thuốc bột BT SỞ Y TẾ… TIÊU CHUẨN THÀNH PHẨM CÔNG TY … THUỐC BỘT BÀI THUỐC HỖ TRỢ Trang: Tiêu chuẩn: TCCS ĐIỀU TRỊ THOÁI HOÁ CỘT SỐNG CỦA Mã số: LƯỢNG Y NGUYỄN THIỆN CHUNG Có hiệu lực từ: Bộ phận: Ban hành theo định số: … ngày… tháng năm A TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG Cảm quan: bột mịn, đồng nhất, màu nâu, mùi dược liệu Độ ẩm: không 9,0% Độ đồng khối lượng: chênh lệch không 7,5% Giới hạn nhiễm khuẩn - Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g): khơng - Tổng số nấm (CFU/g): Không - Tổng số vi khuẩn gram âm dung nạp mật (CFU/g): Không q - Khơng có Salmonella g - Khơng có Escherichia coli g Định tính: sắc ký đồ SKLM thuốc bột BT có vết màu giá trị Rf với vết tương ứng với chuẩn acid asperulosidic, sinensetin, 3-O--Dglucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D- glucopyranosyl ester dược liệu đối chiếu Mía dị Định lượng: - Hàm lượng acid asperulosidic khơng 0,06% (tương ứng với 4,0 mg acid asperulosidic 01 gói) B QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Cảm quan: kiểm tra cảm quan (thể chất, màu sắc, mùi ), thuốc bột BT phải đạt yêu cầu nêu Độ ẩm: tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.6, trang PL-203 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - Độ đồng khối lượng: tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 9.8 Giới hạn nhiễm khuẩn: tiến hành theo DĐVN V, phụ lục 13.6 Định tính Định tính thuốc bột BT theo phương pháp SKLM  Dược liệu Nhàu Đinh lăng xẻ Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-butanol – nước – acid acetic (4:5:1, lớp trên) Dung dịch thử: Cân 667 mg thuốc bột BT vào bình định mức 10 ml Thêm ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hịa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu acid asperulosidic 3-O--Dglucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D glucopyranosyl ester methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Mẫu dược liệu Nhàu: Cân 500 mg bột dược liệu Nhàu vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu dược liệu Đinh lăng xẻ: Cân 500 mg bột dược liệu Đinh lăng vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml n-butanol, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung n-butanol đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phịng Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chất đối chiếu acid asperulosidic, 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O--D-glucopyranosyl ester, dược liệu Nhàu dược liệu Đinh lăng xẻ  Dược liệu Râu mèo Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-hexan – ethyl acetat – acid formic (5:4:1) Dung dịch thử: Cân 6,67 g thuốc bột BT vào bình định mức 10 ml Thêm ml cloroform, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung cloroform đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất đối chiếu sinensetin methanol (TT) để dung dịch có nồng độ khoảng 0,1 mg/ml Mẫu dược liệu Râu mèo: Cân 200 mg bột dược liệu Râu mèo vào bình định mức 10 ml Thêm ml cloroform, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung cloroform đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, cô đến cắn Thêm ml methanol vào chén sứ để hịa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Quan sát mỏng ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm Yêu cầu: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải có vết màu sắc giá trị Rf với vết chất đối chiếu sinensetin dược liệu Râu mèo  Dược liệu Mía dị Bản mỏng: Silica gel F254 Dung môi khai triển: Cloroform – methanol – nước (65:35:10, lớp dưới) Dung dịch thử: Cân 100 mg thuốc bột BT phân tán ml H2O (siêu âm phút) làm dung dịch mẫu nạp lên cột SPE C18 Lần lượt cho qua cột 30 ml dung môi H2O, MeOH 50% MeOH 60%, gom dịch rửa giải 60% cô đến cắn Thêm ml MeOH vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Mẫu dược liệu Mía dị: Cân 500 mg bột dược liệu Mía dị vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml MeOH, siêu âm 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 10 đến vạch Lọc dịch chiết cho vào chén sứ, đến cắn Cân 30 mg cao Mía dò phân tán ml H2O (siêu âm phút) làm dung dịch mẫu nạp lên cột SPE C18 Lần lượt cho qua cột 30 ml dung môi H2O, MeOH 50% MeOH 60%, gom dịch rửa giải cô đến cắn Thêm ml MeOH vào chén sứ để hòa tan cắn, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch Tiến hành triển khai sắc ký đến dung môi khoảng 10 cm Lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng Sau phun dung dịch acid sulfuric 10% ethanol (TT), sấy khô 105 oC rõ vết Yêu cầu: Các vết có Rf tương ứng với dược liệu đối chiếu Mía dị tách riêng biệt với vết khác mẫu thử Định lượng Tiến hành phương pháp HPLC Điều kiện sắc ký: Ct: C18 (250 mm ì4,6 mm, àm) Bc súng phát hiện: 236 nm Tốc độ dòng: ml/phút Thể tích tiêm: 10 µl Pha động: Acetonitril dung dịch H3PO4 0,1% với tỷ lệ 9,5:90,5 Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân xác khoảng mg acid asperulosidic chuẩn vào bình định mức 10 ml, thêm ml methanol, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 300 mg thuốc bột BT cho vào bình định mức 25 ml Thêm 23 ml methanol, siêu âm 30 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung methanol đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,22 μm Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn, dung dịch thử Dựa vào diện tích pic thu dung dịch thử, dung dịch chuẩn nồng độ acid asperulosidic dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) acid asperulosidic thuốc bột BT theo cơng thức: Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL - 11 𝑋 % 𝐶 𝑆 𝑆 25 𝑚 a 100 St, Sc : Diện tích pic acid asperulosidic mẫu thử mẫu chuẩn C : Nồng độ dung dịch acid asperulosidic chuẩn (µg/ml) mt : Khối lượng cân mẫu thử (đã trừ độ ẩm) (mg) a : Hàm lượng acid asperulosidic chuẩn C ĐĨNG GĨI – GHI NHÃN – BẢO QUẢN Đóng gói: đóng gói 6,67 g bao bì kín Ghi nhãn: nhãn rõ ràng, qui chế Bảo quản: nơi khơ ráo, thống mát, tránh ánh nắng ………, ngày …… tháng …… năm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn