BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ QUỐC PHÒNG
ĐÈ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC
BAO CAO TONG HOP
KET QUA KHOA HOC CONG NGHE DE TAI
NGHIEN CUU QUI TRINH NUOI CAY, BIET HOA TE BAO GOC SINH TINH DE DIEU TRI VO SINH
NAM GIỚI
MÃ SỐ: ĐTĐL2009T/27
Cơ quan chủ trì dé tài: Học viện Quản y - Bộ Quốc phòng, Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Nguyễn Đình Tảo
Trang 2BỘ QUỐC PHÒNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM HỌC VIỆN QUÂN Y Độc lập — Tự do ~ Hạnh phúc
BÁO CÁO THÓNG KÊ
KET QUA THUC HIEN DE TAI KHOA HOC VA CONG NGHE CAP NHA NUOC
I THONG TIN CHUNG
1 Tên và mã số để tài:
- Nghiên cứu qui trình nuôi cấy, biệt hoá tế bào gốc sinh tỉnh để điều trị
vô sinh nam giới - Mã số: ĐTĐL2009T/27 - Thời gian thực hiện: tháng 1/2009 đến tháng 12 /2011 2 Cơ quan chủ trì đề t
lọc viện Quân y - Bộ Quốc phòng,
104 đường Phùng Hưng — Phúc La - Hà Đông — Hà Nội
Điện thoại: 069.566100/069.566101
Cơ quan phối hợp: Trung tâm Y học sinh sản và Nam hoc - Đại học Munster — CHLB Đức, Bệnh viện Phụ sản Trung ơng
3 Chủ nhiệm để tài: PGS.TS Nguyễn Đình Tảo
Địa chỉ : Trung tâm Công nghệ phôi - Học viện Quân y
Trang 3Fax: 33 545 034 E-mail: ndtao@yahoo.com
4 Thư ký khoa học: TS Trịnh Thế Sơn
Địa chỉ : Trung tôm Công nghệ phôi — Học viện Quân y
Điện thoại: NE: 04.33541653 E-mail: hangsontrinhthe: Di động: 0902150873 ahoo.co.in TI TÌNH HÌNH THỰC HIỆN 1 Thời gian thực hiện nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng đã ký kết: 36 tháng từ tháng 1/2009 đến tháng 12 /2011 - Thực tế thực hiện từ: 1/2009 đến tháng 12 /2011 2 Kinh phí và sử dụng kinh phí: a Tổng kinh phí thực hiện: 4.417,273 triệu đồng - Kinh phí hỗ trợ từ SNKH: 4.170 triệu đồng
- Kinh phí từ nguồn tự có của tổ chức: 112 triệu đồng, - Kinh phí từ nguồn khác: 135,273 triệu đồng b Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn NSKH
Theo kế hoạch Thực tế đạt được hi chú
Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đÊ nghị
(Tháng, | (Triệu đồng) | (Tháng năm | (Triệu đồng | Pde)
năm)
20092011 | 4417273 | 20092011 | 4417273 4417273
Trang 4c Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chỉ:
SỐ TT| Nội dụng Theo kế hoạch Thực té dat được
Trang 53 Các văn bản chúnh trong quá trình thực hiện dé tai: SỐ, thời gian ban hành văn bản 6 TT Tên văn bản 1 |QĐsố1412/QĐ-BKH CN ngày 09 tháng 7 năm 2008
Quyết định về việc phê duyệt tổ chức và cá nhân chủ trì đề tài, dự án sản xuất thử nghiệm đốc lập cấp nhà nước thực hiện trong kế hoạch năm 2009 2 | Hợp đồng số 12/2009/HĐ-ĐT DL ngày 17/2/2009 Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ 4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài:
S6 TT | Tên tỖ chức đăng |_ Tên td chute đấ Mội dụng Sản phẩn | Ghi ky theo thuyết tham gia thyc | tham gia chi: | chit yéu dat | chi
minh hiện yếu được
Trang 6Tràng Thi -Hà | Thi - Hà Nội -
Nội - Việt Nam | Việt Nam GS.TS Stefan |- Đào tạo cán | Đào fạo01 Schlat, Đại học | bd cán bộ Munster, CHLB | _ anh giữ Nắm được Đức mot sé chi | KỸ thuật
tiêu tếbào — | Chuyên môn gốc dnh nh | về nuôi cấy
tế bào gốc 5 Cá nhân tham gia thực hiện nhiệm vụ:
a Thành viên chính
1 | PGS.TS Nguyén Dinh Tảo | Chủ nhiệm đề tài
2 | TS Trịnh Thế Sơn Thu ký đề tài
3 |PGS.TS Quản HoàngLâm | Trung tâm CNP- Học viện Quân y 4 |PGS.TS Nguyễn ViếtTiến | Bệnh viện Phụ sản TW
5 | TS Lé Thi Hường Cục Phòng chống HIV/AIDS, BO YT 6 | TS Nguyễn Viết Trung Khoa sản - BV 103
7 _ | TS Nguyễn Thanh Tùng Trung tim CNP — Hoc viện Quân y 8 | ThS Trịnh Quốc Thành Trung tim CNP — Hoc viện Quân y 9 | ThS Dương Đình Hiếu Trung tim CNP — Hoc viện Quân y 10 | TS Trần Hồng Sơn Trung tim CNP — Hoc viện Quân y 11 | Th§ Đồn Thị Hằng "Trung tâm CNP - Học viện Quân y
Trang 7
b, Cán bộ tham gia 1 |Nguyễn Thị Thục Anh Trung tâm CNP - Học viện Quân y 2 | Lê Thị Thanh Huyền Trung tâm CNP - Học viện Quân y 3 | Nguyễn Minh Lượng Trung tâm CNP - Học viện Quân y 4 | Chu Thanh Ta Trung tim CNP - Học viện Quân y 5 | Nguyễn Thị Hà Trung tâm CNP - Học viện Quân y 6 | Phạm Văn Đạt Trung tâm CNP - Học viện Quân y 7| Hà Thị Dung Trung tâm CNP - Học viện Quân y 8 |Lê Hả Yến Trung tâm CNP - Học viện Quân y 9 | Nguyễn Thị Thu Trang Trung tâm CNP - Học viện Quân y 10 | Phùng Thị Thu Hiền Trung tâm CNP - Học viện Quân y 6 Tink hình hợp tác quốc Kế: Số Theo KẾ hoạch
IT! (Mội dung, thời gian, kính phí, địa điểm, tên tÔ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia)
Thục lẾ đạt được
(Nội dụng, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tỗ chức hợp tác, số đoàn,
36 lượng người tham gia)
A |Đoànra
1 |Năm2009
Nội đung; Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy các TB gốc sinh tỉnh
Năm 2009
Nội dung: Nghiên cứu phân lập và nuôi cầy các tế bào gốc sinh tinh
Trang 8Thời gian: 02 tháng,
Kinh phí: theo thuyết minh
Tén té chức tiếp nhận:
Dai hoc Seoul, Hàn Quốc 'Tên cán bộ Việt Nam: "ThS Dương Đình Hiếu Thời gian: 02 tháng Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: Dai hoc Seoul, Hàn Quốc 'Tên cán bộ Việt Nam: "ThS Dương Đình Hiếu Nam 2010 Nội dung Nghiên cứu nuôi cấy, đánh giá và xác định các tế bào gốc sinh tinh và các phương pháp thu mẫu mơ tỉnh hồn Thời gian: 02 tháng, Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức 'Tên cán bộ Việt Nam: 'TS Trịnh Thế Sơn Nam 2010 Nội dung: Nghiên cứu nuôi cấy, đánh giá và xác định các tế bào gốc sinh tỉnh và các phương pháp thu mẫu mô tỉnh hoàn Thời gian: 02 tháng Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức 'Tên cán bộ Việt Nam: TS Trịnh Thế Sơn Năm 2010
Nội dung: Bảo quản mơ tỉnh hồn và các tế bào gốc sinh tỉnh
Thời gian: 8 ngày Năm 2010
Nội đung: Bảo quản mô tỉnh hoàn và các tế bào gốc sinh tỉnh
Thời gian: 8 ngày
Trang 9Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức 'Tên cán bộ Việt Nam: PGS.TS Vũ Huy Nùng, PGS.TS Nguyễn Đình Tảo, 'TS Nguyễn Viết Trung
Kinh phí: theo thuyết minh Tên tổ chức tiếp nhận: GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức 'Tên cán bộ Việt Nam: PGS.TS Vũ Huy Nùng, PGS.TS Nguyễn Đình Tảo, TS Nguyễn Viết Trung Đoàn vào Năm 2011
Nội dung: Chuyển giao kỹ thuật phân lập, nuôi cấy, bảo quản mơ tỉnh hồn và các tế bào gốc sinh tỉnh
Thời gian: 8 ngày Kinh phí: Nguồn khác
'Tên cán bộ nước ngoài:
GS.TS Stefan Schlatt, Đại học Munster, CHLB Đức
Trang 107 Tình hình tổ chức thảo, hội nghị: SỐ TT Theo kế hoạch Thực tế Đạt được 1 |Nội dung: Hội thảo khoa học tổng kết kết quả thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 10/2011
Địa điểm: Trung tâm Công, nghệ phổi - Học viện Quân y
Thanh viên: các cán bộ khoa
học tham gia đề tài và những người quan tâm
Nội dung: Hội thảo khoa học tổng kết kết quả thực hiện nhiệm vụ Thời gian: 10/10/2011
Dia điểm: Phòng họp, Trung tâm Công nghệ phôi ~ Học viện Quân y Thanh vién: Chi trì hội thảo
PGS.TS Nguyễn Đình Tảo cùng
các cán bộ khoa học tham gia đề tài và những người quan tâm
8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 1 5 của thuyết minh, không bao gôm: Hội thảo khoa học, điểu tra
khảo sắt trong nước và ngoài nước) „ | Các nội đung, công việc Cá nhân, Số ca Thời gian ; chủ yếu cần được thực hiện tổ chức TT (Các mắc đánh giá chủ yếu) | Theo kế |_ Thực tế thực hiện hoạch | đạt được
1 | Xây dụng đề cương nghiên | 8/2008 - | 8/2008- | PGS.TS Nguyễn cứu chỉ tiết 10/2008 | 10/2008 Đình Tảo,
PGS.TS Quản
Trang 11
Hoàng Lâm và nhóm nghiên cứu "Nội dung 1
- Xét nghiệm tinh địch bệnh | 1/2009- | 1/2009- | PGS Nguyễn nhân azoospermia để chọn | 12/2010 | 12/2010 | Đình Tảo, ThS
được các bệnh nhân Trịnh Quốc azoospermia Thanh, ThS.Duong Đình Hiéu, TS Nguyễn Thanh Tùng
- Làm các xét nghiệm nhiễm | 1/2009- | 1/2009- | TS Nguyễn
sắc thể của các bệnh nhân | 12/2010 | 12/2010 | Thanh Tùng,
azoospermia để xác định và ThS.Duong Đình lựa chọn các bệnh nhân có Hiếu, Th§ Đoàn nhiễm sắc thể bình thường Thi Hing
- Tiến hành thăm khám tinh | 1/2009- | 1/2009- | PGS.TS Nguyén
hoàn, mào tinh, ống dan tinh | 12/2010 | 12/2010 Đình Tảo,
và làm các kỹ thuật MESA PGS.TS Nguyễn
hoặc PESA để xác định bệnh 'Viết Tiền, TS
nhân không có tỉnh trùng do Nguyễn Viết
tắc hay không do tắc Trung, TS Trinh
Trang 12
'Thê Sơn, ThS Trịnh Quốc Thanh, ThS.Duong Dinh Hiếu
- Sinh thiết tỉnh hoàn và làm |1/2009- |1/2009- |PGS.TS Nguyễn
tiêu bản cấu trúc và siêu cấu |12/2010 |12/2010 | Đình Tảo, TS
trúc các mẫu mơ tinh hồn để Nguyễn Viết
thu được các tiêu bản cấu Trung, TS Trinh
trúc và siêu cấu trúc 'Thế Son, Ths
Trinh Quéc Thanh
- Đọc tiêu bản cấu trúc và 1/2009- |1/⁄2009- |PGS.TS Nguyễn siêu cấu trúc tỉnh hoàn, đánh |12/2011 |12/2011 | Đình Tảo,
giá cấu trúc ống sinh tỉnh và PGSTS Quản
cấu trúc các tế bào dong tinh Hoàng Lâm, TS
Nguyễn Thanh
Tùng Nội dung 2
- Nghiên cứu xây dựng quy | 1/2009- |1/2009- | PGS.TS Nguyén trình phân lập tế bào gốc sinh | 6/2011 | 6/2011 Đình Tảo,
tỉnh từ mào tỉnh hoàn và ống, PGS.TS Quản
sinh tỉnh Hoang Lam, TS
Neuyén Thanh Ting,
Trang 13
"Nội đăng 3
- Nghiên cứu xây dựng qui |1⁄2009- |1/2009- |PGS.TS.Nguyễn trình nuôi cấy, biệt hoá tế bào |6/2011 |6/2011 Đình Tảo, gốc sinh tỉnh PGS.TS Nguyễn Viết Tiến, PGS.TS Quản Hoàng Lâm, TS ‘Trinh Thé Son N6i dung 4
- Đánh giá chất lượng,tiêu | 1/2009- |1/2009- | PGS.TS Nguyén chuẩn các tế bào sau nuôi cấy |6/2011 | 6/2011 Đình Tảo
bao gồm: hình thái, số lượng, PGS.TS Quản chất lượng, nhiễm sắc thể, Hoàng Lâm,
một số gen và khả năng thụ PGS.TS Nguyễn tỉnh và chất lượng phôi được Viết Tiền, TS
Trang 14PGS.TS Quản Hoàng Lâm # | Báo cáo nghiệm thu đề tài 12/2011 |12/2011 |PGS.TS Nguyễn Đình Tảo, PGS.TS Quản Hoàng Lâm IIL SAN PHAN KH CN CUA DE TAT 1 Sản phẩm KH CN đã tạo ra a Sản phẩm dang I:
Số Tên sản phẩm và chỉ tiêu | Đơn vị đo | SỐ lượng | Theo kế | Thực tẾ
#ữ chất lượng chủ yếu hoạch | đạt được
1 | Tỉnh trùng được ni cấy, Mẫu 50 50 50
biệt hố từ tế bào gốc có nguồn gốc từ ống sinh tỉnh
Trang 15b Sản phẩm dạng II:
Số Yêu câu khoa học cân đạt Ghi chú
TT Tên sản phẩm ‘Theo ké Thuc té dat
hoach được
1 Qui trình: Thu gom, phân Đủ về số
lập tế bào gốc sinh tỉnh từ 01 01 lượng
ống sinh tỉnh
2 Qui trình: Thu gom, phân Da ve s6
lập tế bào dòng tỉnh từ mào 01 01 lượng
tỉnh
3 Qui trình: Nuôi cấy, biệt Đủ về số
hóa tế bào gốc sinh tỉnh từ 01 01 lượng
ống sinh tỉnh
Qui trình: Nuôi cây, biệt Đủ về số
4 hóa tế bào dòng tỉnh từ mào 01 01 lượng
tỉnh
5 Tiéu chuẩn đánh giá tế bào Da ve s6
gốc sinh tỉnh và tỉnh trùng, 01 01 lượng
sau nuối cấy
6 Qui trình: Qui trình bảo Da ve s6
quản các tế bào gốc sinh 01 01 lượng
tỉnh
Trang 16
c Sản phẩm dang IIL Yêu câu khoa học cân đạt _ | SỐ lượng, nơi Số ; "Theo kế "Thực tế đạt công bố Tên sản phẩm TT hoạch được | (Tạp chí, nhà xuất bản)
* | Bai báo trong nước 02 9
1 | Kết quả điều tị vô Tạp chí Y
sinh nam do không Dược học
có tỉnh trùng trong Quân sự,
dịch tại Trung tâm 2010, 35(3),
Công Nghệ Phôi- tr 183-186
HVQY
2 _| Nghiên cứu siêu cầu Tap chi Y
tric té bao Sertoli Dược học
của bệnh nhân Quân sự,
không có tỉnh trùng 2010, 35(5),
trong tinh dich tr 45-49
3| Đánh giá khả năng Tap chi ¥
tiệt hóa của tỉnh tử Dược học QS
Trang 17Trung tâm Công N7/2011 nghệ Phôi, Học viện tr40-42 Quân y Đánh giá mất đoạn Tap chi Y nhỏ NST Y ở269 Dược học Bệnh nhân vô sinh Quân sự, nam do không có 9(6)-2011 tinh tring bằng kỹ tr 125-130 thudt Multiplex PCR Phát hiện vi đút Tap chi Y đoạn NST Y ở bệnh Dược học QS nhân vô sinh nam số 8(6)-2011 do không có tỉnh tr110-115 trùng bằng kỹ thuật Multiplex PCR
Nghiên cứu hình Tap chi Y
Trang 18đ Kết quả đào tạo:
8 Gấp đào tạo, Chuyên KẾt quả SỐ lượng, nơi công bố
Trang 19
vụ mang lại:
a Hiệu quả về khoa học công nghệ:
- Xác định được các đặc điểm cầu trúc và siêu cấu trúc ống sinh tỉnh của các bệnh nhân không có tỉnh trùng trong tỉnh dich (azoospermia) bao gém ca azoospermia do tắc và không do tắc - Xác định được qui trình phân lập các tế bào gốc sinh tỉnh từ ống sinh tỉnh và các tế bào dòng tỉnh từ mào tỉnh - Xác định sự biến đổi của các tế bào đòng tỉnh trong môi trường nuôi gây
- Xác định khả năng thụ tỉnh của tỉnh trùng và tỉnh tử trưởng thành sau nuôi cấy và hiệu quả của việc nuôi cấy các té bao dong tinh trong điều trị vô
sinh,
- Trên cơ sở đó đề xuất các biện pháp điều trị Kết quả nuôi cấy các tế bào dòng tỉnh không chỉ được áp dụng trong điều trị cho các bệnh nhân azoospermia mà còn được áp dụng cho các bệnh nhân sau điều trị hóa chất, tỉa xạ, áp dụng trong quá trình bảo vệ các loài vật quí hiểm
b Hiệu quả về kinh tế xã hội:
- Người được hưởng lợi trực tiếp là các cặp vợ chồng vô sinh, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc Qua đó đề tài có đóng góp hết sức
to lớn về mặt nhân văn và kinh tế xã
¡ cho Việt Nam
- Mở ra hướng điều trị mới cho các bệnh nhân không có tỉnh trùng, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc Qui trình khoa học còn được áp dụng trong giải quyết vấn đề sinh sản cho các bệnh nhân nam sau tỉa xạ, hóa chất
Trang 203 Tình hình thực hiện chế áo cáo, kiếm tra của để tài: SỐ
TT Noi dung Thời gian
thực hiện (Tom tắt kết quả, kết luận Ghi chit chính, người chủ trì) Báo cáo định kỳ Lân 1 15/9/2009 Đã thực hiện đủ nội dung đặt ra theo tiến độ và hợp any, Lan2 15/03/2010 Đã thực hiện đủ i dang đặt ra theo tiến độ và hợp đồng, Lân 3 15/9/2010 Đã thực hiện đủ nội dung đặt ra theo tiến độ và hợp Hồng, Lân 4 15/03/2011 Đã thực hiện đủ nội dung đặt ra theo tiến độ và hợp động, Lân 5 7/7/2011 Đã thực hiện đủ nội dung Hit ra theo tiến độ và hợp đồng, Kiểm tra định ky
Lân 1 15/9/2009 Kết luận của đoàn kiểm tra: các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng
Lân 2 15/03/2010 Kết luận của đoàn kiểm tra:
các nội dung hoàn thành
Trang 21
theo đúng hợp đồng
Lân 3 15/9/2010 | Két luận của đoàn kiếm tra:
các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng
Lân 4 15/03/2011 | Kết luận của đoàn kiểm tra: các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng
Lần 5 7/7/2011 | Kết luận của đoàn kiểm tra: các nội dung hoàn thành theo đúng hợp đồng
I | Nghiém thu Quy trình 4/11/2011 | Đạt yêu câu 5/5 = 100%
TV |Nghiệm thu cơ sở 30/11/2011 | Đạt yêu cầu 7/7 = 100%
Chủ nhiệm dé tai Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Ho tén, chit ký) (Ho tén, chit ky va ding déu)
PGS TS Nguyén Dinh Tao
Trang 22MỤC LỤC Nội đung Trang CHUONG I MG DAU CHƯƠNG IL TONG QUAN TAILIEU 2.1 Tổng quan về phân lập tế bào dòng tỉnh 2.2 Tổng quan về tế bào nuôi cáy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh 2.3 Về tiêu chuẩn đánh giá tế bào gốc sinh tinh trong quá trình nuôi cấy
2.4 Về bảo quản tế bào dòng tỉnh
CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu: 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.3 Trang bị, hóa chất
CHƯƠNG IV KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1 Nghiên cứu về phân lập tế bào dòng tỉnh từ mào tỉnh
4.2 Nghiên cứu về phân lập tế bào gốc sinh tinh từ ống sinh tỉnh 4.3 Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào dòng tỉnh 4.3.1 Đặc điểm bệnh nhân 4.3.2 Đặc điểm cấu trúc ống sinh tỉnh của các bệnh nhân azoospermia
4.3.5 Đánh giá tế bào gốc sinh tinh bing GPF 4.3.6 Đánh giá tế bào dòng tỉnh bằng kỹ thuật FISH
4.3.7 Đánh giá tế bào dòng tỉnh bằng kính hiễn vi điện tử
4.3.8 Đánh giá khả năng thụ tỉnh của các tế bào sau nuối cấy bằng kỹ thuật TCSI trên thực nghiệm (n = 100 noãn): .126
Trang 234.3.9 Đánh giá khả năng thụ tỉnh của các tế bào sau nuôi cấy bằng kỹ thuật TCSI trên lâm sằng (n = 125 noãn)
4.4 Kết quả nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tinh 129
4.4.1 Đặc điểm bệnh nhân nghiên ctu .130
4.4.2 Thể tích tỉnh hoàn 130
4.4.3 Kết quả nghiên cứu trữ lạnh tỉnh trùng thu nhận từ mào tỉnh 131 4.4.4 Kết quả nghiên cứu trữ lạnh mơ tỉnh hồn 132 4.5 Các qui trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tỉnh 138
CHƯƠNG V BÀN LUẬN 157
5.1 Về lựa chọn bệnh nhân qua xét nghiệm mắt đoạn nhỏ ở vùng AZF trên NST
điêu 157
5.2 Vé qua trinh phan lap té bao géc sinh tinh 163 3.3 Nuôi cấy các tế bào dòng tỉnh thu được từ mào tỉnh
3.4 Nuôi cấy các tế bào gốc sinh tỉnh 3.5 Vai trò của tế bào Serfoli rong nu:
5.6 Phuong pháp nuôi cấy
3.7 Ý nghĩa của phương pháp nu:
3.8 Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu bảo quản tế bào gốc sinh tỉnh 3.9 Thể tích tỉnh hoàn và tế bào gốc sinh tỉnh lập
3.10 Trữ lạnh các tế bào đòng tỉnh thu nhận từ mào tỉnh
3.11 Trữ lạnh tế bào gốc sinh tỉnh trong mơ fỉnh hồn của bệnh nhân KET LUAN
KIÊN NGHỊ
TAI LIEU THAM KHẢO PHY LUC
- Danh sách bệnh nhân PESA, MESA
- Danh sách bệnh nhân trữ lạnh tỉnh trùng từ mào tỉnh và mô tỉnh hoàn
Trang 24
DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT ART AID CSF DMSO IVF ICSI NOA MESA OA PESA sc TESE TTTON WHO
Assisted Reproductive Technology (Ky thudt hé trợ sinh sản) Artificial insemination by donor (Thy tinh nhén tao bing tinh tring cia ngudi cho)
Cryoprotective agents: Cac chat bảo vệ tế trong quá trình đông lạnh Azoospermic factor Cộng sự Cryosurvival factor: chi số sống sau trữ lạnh của tỉnh trùng, Dimethyl sulphoxide Glycerol
Phương pháp nhuộm tiêu bản bằng Hematoxylin- Eosin In Vitro Fertilization (Thu tinh trong ống nghiệm)
Intracytoplasmic Sperm Injection (Tiém tinh trimg vao trong bao tương trứng) Non-Obstructive Azoospermia Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration Obstructive Azoospermia Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration Stem Cell
Testicular Sperm Extraction
‘Transmission electron microscopy: Kinh hién vi dién tir truyén qua Thu tinh trong ống nghiệm
World Health Organization (T6 chite ¥ té thé gidi )
Trang 25DANH MỤC BẰNG Nội dung Bảng 4.1 Tuổi và thời gian vô sinh trung bình của các nhóm bệnh nhân Bang 4.2 Néng d6 mét sé hormone ciia bệnh nhân Bang 4.3 Ké qua thu gom, phan lap cac té bao dong tinh
Bang 4.4 Tuổi và thời gian vô sinh của bệnh nhân nghiên cứu
Bảng 4.5 Tỷ lệ đi động của tỉnh trùng và tỉnh tử tại mào tỉnh qua các thời điểm nuôi cấy trong môi trường không bổ sung các hormone 113 Bảng 4.6 Tỷ lệ đi động của tỉnh trùng và tỉnh tử tại mào tỉnh qua các thời điểm 114
môi cấy trong môi trường có bổ sung các hơmmone
Bang 4.7 So sánh kết quả nuôi cấy các tế bào ở mào tinh trong mdi trường nuôi
cấy có bổ sung và không bổ sung céc hormone .114
Bang 4.8 Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh chuột trong môi tường nuôi cấy 116 Bang 4.9 Biến đổi số lượng các tế bào dòng tinh người trong môi trường nuôi cấy 118 126 126 127 127 128 129 Bảng 4.16 Tuổi, thời gian vô sinh của bệnh nhân 130 Bang 4.17 Dac diém thé tich tinh hoàn của bệnh nhân nghiên cứu 130 Bang 4.18 Két quả độ đi động của tỉnh trùng thu nhận từ mào tỉnh trước, sau tữ
Bảng 4.10 Khả năng thụ tinh của tỉnh tử chuột sau nuối cấy
Bảng 4.11 Sự phát triển phôi chuột ngày 2 với tỉnh tử sau nuôi cấy
Bang 4.12 Sự phát triển phôi chuột ngày 3 với tỉnh tử sau nuôi cấy
Bang 4.13 Khả năng thu tinh của tỉnh tử sau nuôi cấy
Bang 4.14 Sự phát triển phôi ngày 2 với tinh tử sau nuôi cấy
Trang 26Bảng 420 Hình thái tỉnh tring trước và sau rã đông
Bảng 4.21 Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh nhóm sử dụng chất bảo quản
Glycerol (Sperm freeze) 133
Bang 4.22 Kết quả sau trữ lạnh mơ tỉnh hồn sty dung Gtycerol (Spam Freeze) 133 Bang 4.23 Đặc điểm mô tinh hoàn trước trữ lạnh ở nhóm sử dụng chất bảo quản
DMSO 135
Bang 4.24 Kết quả sau trữ lạnh mơ tinh hồn sử dụng DMSO .135 Bảng 4.25 Biến đổi số lượng các tế bào đòng tinh trong môi trường trước và
sau bảo quản bằng DMSO „137
Bảng 5.1 Kết quả độ đi động, tỉ lệ sống của tỉnh trùng thu nhận từ mào tỉnh
trước và sau trữ lạnh của các tác giả
„172
Trang 27
DANH MỤC HÌNH
Nội đung Trang
Hình 2.1 Sơ đồ quá trình sinh tỉnh trùng,
Hình 2.2 Sơ đồ cấu trúc một phần ống sinh tinh của người bình thường Hình 2.3 Cấu trúc ống sinh tinh của người bình thường (600)
Hình 2.4 Cấu trúc ống sinh tinh BN do tắc (nhuộm HE, X600) Hình 2.5 Cầu trúc 6ng sinh tinh BN không do tắc (nhuộm HE, x600) Hình 2.6 Các tế bào dòng tỉnh từ bệnh nhân azoospemnia không do tắc
Hình 2.7 Hình ảnh ống sinh tỉnh và các tế bào thu được khi tách từ Ống
sinh tỉnh 69
Hình 2.8 Các tế bào đòng tinh nuôi cấy 70
Hình 2.9 Các tế bào gốc sinh tỉnh nuôi cấy đang phân chia giảm phân chụp dưới kính hiển vi điện tử -.71
Tình 4.1 Mẫu mơ tỉnh hồn sau thu hồi „ 107
Hinh 4.2 Ong sinh tinh bénh nhân azoospermia cit ngang (HE, x400) 107 Hinh 4.3 Cac té bao sau phan lap bang cach 1 (soi ndi, x100) „ 108 Hình 4.4 Các tế bào sau phân lập bằng cách 3 (soi nỗi, x100) „ 109 Hinh 4.5 Các tế bào góc sinh tinh thu từ môi trường nuôi cấy „ 109 Hinh 4.6 Hé thống phân lập tế bào dựa vào lực từ tính (MACS) „110 Hinh 4.7 Ong sinh tinh bénh nhan azoospermia do tic (HE, x600) 111 Hinh 4.8 Ong sinh tinh bệnh nhân azoospermia không do tắc (HE, x600) 112 Hình 4.9 Các tỉnh tử được phân lập (x600) „115 Hình 4.10 Tinh hoàn chuột 8 ngày tuổi x100
Hình 4.11 Tinh hoàn chuột 8 ngày tuổi x400
Trang 28Hình 4.14 Hình 4.15 Hình 4.16 Hình 4.17 Hình 4.18 Hình 4.19 Hình 4.20 Hình 4.21 Hình 4.22 Hình 4.23 Hình 4.24
Các tế bào dòng tinh sau 20 ngày nuôi cí
Hình ảnh các tế bào gốc sinh tỉnh nuôi cấy với GEP x400 Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X va NSTY Hình ảnh nhuộm FISH NST 18, NST X va NST Y Hinh anh tinh tir tron di kinh hién vi dién tử x5000 Hình ảnh tỉnh tử đã kéo dai x3000
'Tĩnh trùng trong nhuộm Papanicolaou (x1000) - Mơ tỉnh hồn tốn thương nặng sau trữ lạnh bằng Glycerol (x200) 134 M6 tinh hoan sau rd đông sử dụng chất bảo quan Glycerol (x400) 134 M6 tinh hoan sau ra đông sử dụng chất bảo quản DMSO (x400) 136 Siêu vi thể đầu tinh trùng sau trữ lạnh sử dụng DMSO x5000 136
Trang 29CHUONGI
MỞ ĐẦU
Theo các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam, thì tỷ lệ võ sinh chung từ 5 - 13%, trong đó vô sinh nam chiếm khoảng 40% [4] Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam Trong đó nguyên nhãn không có tỉnh trùng trong, tinh dich (azoospermia) chiém Khoảng 10-20% và là nguyên nhân khó điều trị nhất
Ở Việt Nam, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đá được áp dụng một cách có hiệu quả và đá mang lại hạnh phúc cho hàng ngàn cặp vợ chồng võ sinh Cùng với sự phát triển chung của lĩnh vực hỗ trợ sinh sản của thế giới, các kỹ thuật mới đã được triển khai và điều trị cho vô sinh nam và vô sinh nữ như các kỹ thuật TVE, ICSI, các kỹ thuật thu tỉnh trùng cho các bệnh nhân không có tỉnh trùng trong tinh dich (azoospermia)
Trong điều trị vô sinh nam, mặc dù có nhiều tiến bộ, nhưng đối với các bệnh nhân azoospermia, đặc biệt là các bệnh nhân azoospermia không do tắc thì hầu như phải xin tỉnh trùng Xuất phát từ những cơ sở khoa học trên, chúng tôi đã tiền hành nghiên cứu phân lập, nuôi cấy và biệt hoá tế bào gốc sinh tỉnh để điều sinh tỉnh là một bước quan trọng, là cơ sở cho những bước tiề Trong đó phân lập các tế bào gốc i v6 sinh nam gi theo Đã có
nhiều tài liệu công bó về nhiều phương pháp phân lập các té bao dong tinh khác nhau Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm khác nhau
ới các thành tựu trong lĩnh vực hỗ trợ sinh sản, các bệnh
Ngày nay, vị
nhân azoospermia có thể có cơn của chính mình bằng tỉnh trùng thu được từ mào tỉnh hay ống sinh tỉnh Tuy nhiên, các trường hợp không có tỉnh trùng trong ống sinh tỉnh và mào tỉnh vẫn chờ đợi và gặp nhiều khó khăn để có đứa
Trang 30cơn của chính mình Trước sự phát triển của khoa học và công nghệ trên thế giới, đã biến những cái không thể thành có thể, nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu phân lập và nuối cấy tế bào đòng tỉnh Từ đó nhờ kỹ thuật thụ tỉnh trong ống nghiệm-tiêm tỉnh trùng vào bào tương noãn (TVE-ICSI) đã hé mở những hy vọng mới cho những trường hợp không có tỉnh trùng không do tắc
(non-obstructive azoospermia)
Nuôi cấy các tế bào đòng tinh (In Vitro culture of Spermatogenesis cells): là phương pháp điều trị có nhiều triển vọng trong tương lai cho các bệnh nhãn không có tỉnh trùng trong tỉnh địch không do tắc NOA (Non Obstructive Azoospemia) Hiện nay trên thế giới một số tác giả đã tiến hành nuôi cấy và đá có được một số thành công bước đầu Để nâng cao hiệu quả, tính an toàn của phương pháp này, chúng tối tiến hành phân lập, nuôi cấy tế bào gốc sinh tỉnh Kết quả bước đầu cho thấy tế bào gốc sinh tỉnh phát triển trong môi trường nuôi cấy, phân chia giảm nhiễm tạo thành các tỉnh tử tròn, tinh tử đang kéo dài và tỉnh tử đá kéo dài Tuy nhiên chất lượng tế bào này như thế nào là ván đề còn tiếp tục được nghiên cứu
Trữ lạnh các tế bào dòng tỉnh nói chung và tế bào gốc sinh tỉnh nói riêng giúp cho việc bảo tổn khả năng sinh sản cho nam giới trước khi điều trị các bệnh ác tính bằng phẫu thuật, hoá chất, tia xạ cũng như một số bệnh lý mạn tính như tiểu đường, rồi loạn miễn dịch Ngoài ra trữ lạnh tỉnh trùng lấy từ mào tỉnh và mơ tỉnh hồn giúp cho tránh khỏi sinh thiết tỉnh hoàn nhiều lần để gây ra các biến chứng và tạo áp lực lớn về tâm lý cho bệnh nhân [26] Việc trữ lạnh tỉnh trùng đã trở thành thường qui trong các trung tâm hỗ trợ sinh sản, tuy nhiên việc trữ lạnh tế bào gốc sinh tinh còn nhiều vấn đề còn tiếp tục nghiên cứu
Đây là một nghiên cứu có khoa học, tính nhân văn Kết hợp với quá trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc sinh tỉnh, mở ra triển vọng
cho những bệnh nhân không có tỉnh trùng trong tỉnh dịch có thể có cơ hội có
Trang 31những đứa con của chính mình Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến
hành nghiên cứu đề tài với 3 mục tiêu như sau:
3 Xây dựng qui trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ Ống sinh tình và các tê bào đòng tỉnh từ mào tính ở bệnh nhân nam giới vô sinh do không có tỉnh
trùng,
2 Xây dựng quả trình bảo quản, nuôi cấy và biệt hoá tế bào sốc sinh tỉnh từ
ống sinh tỉnh và các tế bào dòng tính từ mào tính thành tình trùng,
3 Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá tê bào gốc sinh tỉnh và tinh tring được biệt
hoá từ tẾ bào góc sinh tình
Mục tiêu cụ thể là xây đựng các quả trình và tiêu chí đánh giá tẾ bào nh Sưu:
Trang 32CHUONG I
TONG QUAN TAI LIEU
2.1 Tổng quan về phân lập tế bào dong tinh
2.1.1 Vô sinh
V6 sinh 18 tình trạng một cặp vợ chồng không có khả năng có thai sau 1 năm quan hệ vợ chồng thường xuyên và không dùng các biện pháp tránh thai
'Từ năm 1982-1985 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã tiến hành nghiên cứu và xác định: trong số bệnh nhân võ sinh có 20% nguyên nhãn do nam giới, 38% do nữ giới và 27% do cả nam và nữ, 159% không rõ nguyên nhân Như vậy, trên thế giới có hàng triệu bệnh nhân có nhu cầu điều trị vô sinh, trong số đó vô sinh nam chiếm một tỷ lệ rất lớn Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến vô sinh nam Trong đó, vô sinh đo không có tỉnh trùng trong tỉnh dich (azoospermia) là một nguyên nhân võ sinh nam trầm trọng và khó điều trị nhất Theo các thống kê cho thấy gần 20% các cặp vợ chồng ở Mỹ vô sinh, gần 25% các cặp vô sinh bị thiểu năng tinh trùng Khoảng 2% các cặp vợ chồng vô sinh có chổng là azoospermia Như vậy azoospermia chiếm khoảng 8% bệnh nhân vô sinh nam
"Thông thường người ta chia azoospermia làm 2 loại là azoospermia do tic (obstructive azoospermia) và azoospermia không do tắc (non-obstructive
azoospermia)
Azoospermia do tắc: nhóm bệnh nhân này bao gồm bệnh nhân thất ống, dẫn tinh, không có ống dẫn tỉnh, biến chứng tắc ống dẫn tỉnh sau các phẫu thuật, tắc hệ thống dẫn tinh sau các viêm nhiễm Ở các bệnh nhân này, trong, tinh hoàn vẫn xảy ra quá trình sinh tỉnh bình thường
Azoospermia không do tắc: là nhóm bệnh nhân mà không thể thu được tinh trùng từ mào tinh Ở các bệnh nhân này, trong tỉnh hồn khơng xảy ra
quá trình sinh tỉnh bình thường [4]
Trang 33Ngày nay, đối với các bệnh nhân azoospermia do tic (obstructive azoospermia), bénh nhan cé thé thu tinh trùng từ mào tinh hoặc tỉnh hoàn để tiến hành làm phương pháp tiêm tỉnh trùng vào bào tương noãn (intracytoplasmic sperm injection- ICSI) Ky thudt ICSI duge thy hién thành công trên thế giới vào năm 1992 [17] Hiện nay, kỹ thuat ICSI cé thể áp dụng cho tắt cả trường hợp vô sinh do nam giới, trừ những trường hợp hồn tồn khơng có tỉnh trùng trong ống sinh tỉnh ICSI có thể thực hiện với tỉnh trùng, từ tỉnh địch, tỉnh trùng hút từ mào tỉnh hay tỉnh trùng sinh thiết từ tinh hoàn Hiện nay, ICST được xem là phương pháp điề
tỉ lệ có thai của một chủ kỳ điều trị thường trên 30%
{ v6 sinh nam hiệu quả nhất,
Đối với các bệnh nhân azoospermia không do tic (non-obstructive azoospermia), mét số ít bệnh nhân vẫn có thể thu được tỉnh trùng từ ống sinh tinh nhờ phương pháp TESE hoặc micro-TESE Các bệnh nhân còn lại phải xin tinh trùng, lượng bệnh nhân loại này rất lớn
Bên cạnh đó, hàng năm có rất nhiều bệnh nhân nam giới bị ung thư các loại khác nhau, đặc biệt là giai đoạn trước tuổi đậy thì, các bệnh nhân này không thể có tỉnh trùng để lưu trữ giống như các bệnh nhân trưởng thành Sau quá trình điều trị hóa chất và phóng xạ, các bệnh nhân này sẽ trở thành vô sinh thứ phát, không có khả năng có con sau này Việc phân lập tế bào gốc sinh tỉnh từ ống sinh tỉnh của các bệnh nhãn này và lưu trữ các tế bào gốc sinh tinh có ý nghĩa rất quan trọng không chỉ đối với các bệnh nhân azoospermia không do tắc và còn rất quan trọng đối với các bệnh nhân nam giới trước tuổi
dậy thì sau quá trình điều trị ung thư, mở ra hy vọng có con cho họ sau này 2.4.2 Ong sink tink
Ông sinh tỉnh có đường kính khodng 150 - 250m tuy theo céc tac gid khác nhau và dài từ 30 đến 70cm [1], [5], [53]
- Ông sinh tỉnh gồm các thành phản sau:
Trang 34+ Lớp áo xơ bao phủ ống sinh tỉnh gồm vài lớp nguyên bào sợi và nguyên bào sợi - cơ
+ Thành ống tạo nên bởi 2 loại tế bào: tế bào Sertoli và các tế bào đòng, tinh, các tế bào dòng tỉnh xếp thành 4 - 8 lớp kể từ màng đáy cho đến lòng ống sinh tỉnh, bao gồm: tỉnh nguyên bào, tỉnh bào J, tỉnh bào II, tỉnh tử và tỉnh trùng
* Cúc tẾ bào đồng tỉ:
Tĩnh nguyên bào nằm thành một lớp trên màng đáy, đó là tế bào tương, đối nhỏ, kích thước khoảng 12 kưn và nhân có nhiều hạt nhiễm sắc Trong bào tương có bộ máy Golgi nhỏ, các ty thể hình cầu và rất nhiều Ribosom tự do Trong thời kỳ trưởng thành các tỉnh nguyên bào trải qua một loạt quá trình gián phân Kết quả, chúng tạo thành các tế bào giống như các tế bào ban đầu gọi là tỉnh nguyên bào nhóm A, đây là nguồn duy trì tiếp tục của tỉnh nguyên bào Chúng cũng có thể phân chia và phát triển thành tế bào lớn hơn tỉnh nguyên bào lúc đầu gọi là tỉnh nguyên bào nhóm B, các tế bào này tiếp tục phát triển trở thành tỉnh bào I
Ngay sau khi được tạo thành, các tinh nguyên bào nhóm B bước vào kỳ đầu lần phân chia thứ nhát của quá trình giảm phân, lúc này các tỉnh bào I có 46 nhiễm sắc thể Quá trình phát triển của tỉnh bào I kéo dài đến hết lần 1 của giảm phân, đài 22 ngày Tỉnh bào I có kích thước lớn nhát trong các tế bào dong tinh va dic trưng bởi sự có mặt của các nhiễm sắc thể ở các giai đoạn khác nhau của quá trình xoắn bên trong nhân tế bào
Qua lần giảm phân đầu tiên, tinh bào I trở thành các tế bào nhỏ hơn, gọi là tỉnh bào II Tỉnh bào II có 23 nhiễm sắc thé Tinh bao II rất khó quan sát trên tiêu bản tỉnh hoàn vì chúng tồn tại trong thời gian rất ngắn, rồi tham gia
quá trình giảm phân thứ hai
Trang 35Kết quả của quá trình phân chia tỉnh bào II tạo ra tiền tỉnh trùng Đó là các tế bào có kích thước nhỏ, đường kính 7 — 8 _un, có một hạt nhân với vùng nhiễm
sắc thể dày đặc Vị trí của tiền tinh trùng là ở gần lòng ống sinh tỉnh
Tién tinh trùng phải trải qua một quá trình biệt hoá phức tạp gọi là quá trình tạo tỉnh trùng, bao gồm các quá írình như sau:
- Bất hoạt bộ gen để bảo toàn sự hoạt động của toàn bộ gen sau này - Nhiễm sắc thể đóng xoắn lại, thuận lợi cho quá trình đi chuyển và làm nhân nhỏ lại Cụ thể trong quá trình này, histone ở nhân được thay thế bằng, protamine, đây là chất giúp sắp xếp lại chuỗi ADN ở nhân gọn hơn Nhân tế bào tỉnh tử nhỏ lại và nằm sau thể cực đầu Sau khi thụ tỉnh, các protamine ở nhân tỉnh trùng lại được thay thé bằng histone Tesarik và CS (2000) cho rằng: sự thiếu hụt protamine sẽ cản trở quá trình hoàn thiện nhân trong giai
đoạn này [113]
- Sự hình thành các bộ phận làm thuận lợi cho sự tự vận động của tỉnh trùng như đuôi được hình thành, đồng thời loại bót bào tương, một trung thể sẽ đến gắn vào 1 cực của nhân tinh trùng, đối điện với cực có cực đầu, đễ hình thành sợi trục Các ty thể sẽ biệt hóa thành những cấu trúc hình ống, xếp dọc theo sợi trục, đóng vai trò là cơ quan tạo năng lượng cho hoạt động của đuôi tinh tring
- Biệt hoá các cấu trúc giúp tỉnh trùng nhận điện được noãn và có khả năng thụ tinh được với noãn như hình thành cực đầu Kết thúc quá trình này, tinh trùng được hình thành có hình dạng và cấu trúc đặc thù ở mức độ biệt hoá
cao và được giải phóng vào lòng ống sinh tinh
Khoảng thời gian của quá trình từ tỉnh nguyên bào biệt hoá thành tỉnh trùng là 72 ngày Tuy nhiên để trưởng thành hoàn toàn về mặt chức năng, tỉnh trùng phải trải qua một giai đoạn cuối cùng tại mào tỉnh khoảng 12 - 21 ngày Quá trình sinh tỉnh xảy ra không đồng thời cũng không đồng bộ ở các ống
Trang 36sinh tỉnh Điều này giải thích tại sao có thể gặp tỉnh trùng ở một số nơi của ống sinh tỉnh, trong khi đó lại gặp tiền tỉnh trùng ở chỗ khác [1]
* Té bio Sertoli
Té bao Sertoli 1a một trong 2 loại tế bào cầu tao nên biểu mô ống sinh tinh Hiện nay, tế bào Sertoli được xác định có vai trò quan trọng trong quá trình biệt hoá cơ quan sinh dục trong giai đoạn phôi thai Đặc biệt, tế bào
Sertoli có vai trò rất lớn quyết định đến quá trình sinh tỉnh của tỉnh hoàn 2.13 Qué trink sinh tink
Quá trình sinh tỉnh trải qua 3 giai đoạn sau:
+ Sinh tỉnh bào: là quá trình tỉnh nguyên bào phân chia, tạo ra tỉnh bào tinh trùng hay còn gọi là tỉnh tử + Tạo tỉnh trùng: là quá trình biệt hoá tiền tỉnh trùng thành tỉnh trùng
2.1.4 Các i€ bio géc sink tink
+ Giảm phân: sản xuất ra các tế bào
'Tế bào gốc (stem cell) là quản thể các tế bào có khả năng tự phân chia và tự đổi mới vơ hạn định, ngồi ra còn có khả năng biệt hoá thành nhiều
đạng tế bào của các mô khác nhau
Các tế bào gốc phôi, có ở phôi vào khoảng từ 3 đến 5 ngày sau thụ tỉnh Các tế bào này có khả năng tăng sinh vô hạn định và có thể tự biệt hoá thành tất cả các dạng mô trong cơ thể Vì vậy, các tế bào này được gọi là tế bào gốc vạn năng (có khả năng biệt hoá thành dạng mô bắt kỳ - pluripotent stem cell) [20]
Các tế bào gốc trưởng thành thì có tính đặc hiệu mô hơn, khả năng phân chia và biệt hóa ít hơn Do đó, các tế bào này được gọi là tế bào gốc đa năng (chỉ có khả năng biệt hoá thành một số dạng mô cụ thễ với sỐ lượng hạn ché — multipotent stem cell) [18]
Tính “thường biến” của tế bào gốc phôi và tế bào gốc trưởng thành là do các tế bào này có khả năng biệt hoá thành nhiều mô khác biệt với nguồn gốc ban đầu của chúng Vì vậy có khả năng phát triển qua lớp mắm phối Khả năng tự tái tạo của tế bào góc là đặc điểm rất quan trọng của chúng Do đó các
Trang 37tế bào gốc là nguồn tế bào chưa biệt hoá sơ khai Ngược lại, hầu hết tế bào sinh đưỡng có khả năng tự tái tạo hạn chế do đoạn cuối (telomere) của thể nhiễm sắc bị co ngắn lại [35]
Hiện nay chúng ta có thể thu được tế bào gốc từ nhiều nguồn khác nhau Khả năng tạo ra nhiều chuỗi thế hệ của tế bào gốc phổi và tế bào gốc trưởng thành đã được nghiên cứu và mô tả kỹ lưỡng qua nhiều nghiên cứu khoa học Cho dù tiềm năng của tế bào gốc phối là vô cùng to lớn, nhưng việc sử dụng các tế bào này gây ra nhiều vấn đề đạo đức đang còn tranh cãi Do vậy, đã có nhiều đề xuất dùng các tế bào gốc không phải từ phối mà được lấy từ chất đệm tuỷ xương, mô mỡ, bì, máu dây rốn và đặc biệt là trong các ống, sinh tỉnh làm nguồn tế bào có nhiều ứng dụng Những tế bào này có thể biệt hoá thành tế bào sụn, tế bào tạo mỡ, tế bào tạo xương, nguyên bào cơ, tế bào cơ tim, tế bào thân kinh đệm hình sao, tế bào gân và tỉnh tử, thậm chí tỉnh trùng trong điều kiện in vitro và trải qua quá trình biệt hoá in vivo và điều đó làm cho các tế bào gốc này được coi là những nguồn tế bào đầy triển vọng cho việc sửa chữa khuyết tật ở trung phôi bì và phòng ngừa bệnh tật Đặc biệt việc phân lập và nuôi cấy các tế bào gốc sinh tinh sẽ mở ra hy vọng mới cho các bệnh nhân azoospermia không do tắc và các bệnh nhân ung thư nam trẻ tuổi sau điều trị hóa chất và tia xạ
Ở người và động vật nhóm linh trưởng, Tinh nguyên bào có 2 loại là tinh nguyên bào A và tỉnh nguyên bào B Tỉnh nguyên bào A phân chia để tạo thành tỉnh nguyên bào A,a„ và tỉnh nguyên bào A,z„ Tỉnh nguyên bào A;a, lại tiếp tục phân chia, ở người tế bào này cứ 16 ngày lại phân chia 1 lần Tỉnh nguyên bào Az:ø là nguồn dự trữ tế bào gốc Một nghiên cứu về tỉnh nguyên bào, khi cho khỉ rhesus chiều xạ, người ta nhận tháy số lượng tinh nguyên bào Agate gidm sau 9 ngày chiếu xạ, trong khi đó số lượng tỉnh nguyên bào Aus„ không đổi Điều này cho thấy được sự Khác nhau giữa khả năng phân chia tế bào của các tế bào này Vì tia xạ chỉ phá hủy các tế bào đang phân chia Khi
Trang 38có sự thiếu hụt tế bào, tỉnh nguyên bào Asœ mới biến thành tinh nguyên bào As„ và tiếp tục phân chia Như vậy sự nằm im, không phân chia của tỉnh nguyên bào A;„„ có chức năng giữ cho AND không bị tổn thương (khác với
động vật không phải linh trưởng) [3]
Vì vậy việc phân lập tốt các tế bào này rất quyết định đến khả năng thành công sau nuôi cấy và cấy ghép sau này [17]
Các tế bào gốc sinh tỉnh là các tế bào nằm sát với màng đáy của ống sinh tỉnh Tế bào có nhân hình oval, hạt nhân nằm sát với màng nhân Bào tương sẫm màu với bộ máy Golgi nhỏ, ít ty thể và nhiều Ribosom tự do Ngày nay các nghiên cứu cho thay CD24 va CD9 (CD9 cén có ở các tế bào gốc ở vị trí khác) có ở tế bào góc sinh tinh, không có CD34 [25]
"Theo Shosei Yoshida, 2010 tỷ lệ các tế bào gốc sinh tỉnh của biểu mô
ống sinh tỉnh rất ít chỉ chiếm < 19% tổng số tế bào Hiện nay người ta đã nghiên cứu và nhận thấy có rất nhiều gen quyết định quá trình sinh tỉnh như gen Plzf, một gen ức chế (franscripfi onal repressor) Nếu chuột mất gen này thì quá trình sinh tinh khơng bình thường Ngồi ra gen Bcl6b cũng giúp cho việc duy trì sự tổn tại các stem cell Ngoài ra các gen khác khi bị biến đổi cũng làm thay đổi như Taf4b, Ufp14b Nhưng gen Efv5 ngoài tác động lên tế bao stem cell còn tác động đến tế bào Sertoli Gần đây người ta nhận thấy gen nanos2 có vai trò then chốt trong việc duy trì và phát triển của stem cell [122]
Ở người tỉnh nguyên bào Az¿„ được biết đến là tế bào có chức năng dự trữ, rất ít phân chia trong điều kiện bình thường Tỉnh nguyên bào A;„, có
chức năng sinh ra các tế bào tiếp theo đó là tỉnh nguyên bào B; để sau đó thành tỉnh bào [8]
Tanaka Atsushi, 2003 cho rang tiéu chuan chon tinh bào: đó là các tế bào hình tròn, đường kính từ 12-15um Mito Kanatsu-Shinohara, 2004 cho rằng CD9 chính là marker bề mặt để phát hiện các tỉnh nguyên bào ở chuột
[22], [104]
Trang 392.1.5 Mao tinh
Ong mio tinh là
ống này cùng mô liên kết xung quanh và mạch máu tạo nên thân và đuổi của
ống đơn, cong queo, độ dài khoảng 4 - 6m Chính
mào tỉnh hồn Biểu mơ của mào tỉnh hoàn là biểu mô trụ cao giả tầng, gồm có các tế bào đáy hình tròn và tế bào chính hình trụ Các tế bào này nằm trên màng đáy và bao quanh bên ngoài màng đáy là các tế bào cơ trơn và mô liên kết lỏng lẻo giàu mạch máu Sự co bóp của tế bào cơ trơn giúp tỉnh trùng di chuyển đọc theo chiều đài của ống Bề mặt của tế bào chính có các vi nhung mao đài, không đều gợi là stereocilia Các vi nhung mao này không có cả thể gốc lẫn cầu trúc vi ống ở bên trong, trái lại, lông chuyển bình thường thì lại có cả hai cấu trúc trên Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, trong bào tương của tế bào chính, lưới nội bào có hạt phát triển phong phú và bộ Golgi lớn nằm bao quanh nhân không có hạt chế tiết trong bào tương Các tế bào chính tiết glycerophosphocholine, chất có thể ức chế quá trình tạo chất (Capacitation), một quá trình chuẩn bị cho tỉnh trùng để thụ tỉnh Đông thời các tế bào này cũng sản xuất ra glycoprotein, mà glycoprofein này gắn chặt vào màng bào tương của tỉnh trùng nhưng chức năng của hiện tượng này chưa rõ Biểu mô của ống mào tỉnh tham gia vào quá trình hấp thu và tiêu hoá các chất thải được bài tiết ra trong quá trình sinh tỉnh Các tế bào đáy nhìn chung là không được biệt hoá và có thể là tiền thân của tế bào chính Bao xung quanh biểu mô là lớp tế bào cơ trơn, mà càng về cuối ống mào tỉnh thì càng trở nên dày hơn Sự co bóp của tế bào cơ trơn có tác dụng đẩy tỉnh trùng ra ngoài ống mào tỉnh Chính vì vậy tại ống mào tinh không có các tế bào gốc
sinh tinh [1], [4], [14]
2.1.6 Các phuong phdp phan lap té bite géc sink tink
'Việc nghiên cứu phân lập các tế bào gốc sinh tỉnh đã có từ thập kỷ 60 của thế kỷ XX [47] Cho đến nay đã có nhiều phương pháp phân lập tỉnh nguyên bào khác nhau, với kết quả cũng rất khả quan
Trang 402.1.6.1, Phương pháp Percoll
- Được các tác giả Bucci và C5, 1986; Morena và CS, 1996, Koh và CS, 2004 thực hiện theo nguyên lý các tế bào có kích thước khác nhau sẽ bị giữ lại khi đi qua lớp Percoll có nồng độ khác nhau [19] Theo phương pháp này, tỉ lệ làm giầu tỉnh nguyên bào có thể lên đến trên 80% Tuy đây là phương pháp có hiệu quả chưa cao, nhưng dễ áp dụng
2.1.6.2 Phương pháp STAPUT
- Được Dirami và CS thực hiện 1999 Đây là phương pháp phân lập tinh nguyên bào có đùng các enzyme EDTA-trypsin và DNase I để tách rời các tế bào ở biểu mô ống sinh tỉnh Sau đó, các tế bào được đưa vào buồng phân tách tế bào (Staput chamber) với nguyên lý hoạt động dựa vào trọng lượng khác nhau của các loại tế bào Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp Không cao [19]
2.1.6.3 Phương pháp dùng kháng thé bé mat FACS
- Phuong phip FACS (Fluorecence activated cell sorting) được Shinohara va CS, 2000; Fujita va CS, 2005; Guan va CS, 2006; Geens M và CS tiến hành năm 2007; Mucksová J, 2009 Ti 1é lam giau tinh nguyén bao theo phương pháp này lên đến 97%, tuy nhiên giá thành đắt đỏ đo trang bị máy móc và hóa chất cao phức tạp [91]
2.1.6.4, Phương pháp sử dụng màng nên (mang day — laminin)
Phương pháp này được Pasi P tiến hành vào năm 1985, theo nguyên lý các tỉnh bào và tế bào Sertoli bám vào màng đáy khi nuôi cấy còn các tỉnh nguyên bào thì không bám vào màng đáy, do đó nỗi lên trên Theo một số tác giả hiệu quả của phương pháp này có thể đạt 80 — 95%, do vậy đây là phương, pháp phân lập tế bào gốc sinh tỉnh khá hiệu quả và dễ thực hiện [92]
2.1.6.5 Phương pháp dùng lực tie tinh MACS
Phương pháp MACS (Magnetic cell sorting) do Von Schonfeldt và CS thực hiện 1999; Vander Wee và CS thực hiện 2001; Buageaw và CS thực hiện