Nghiên cứu qui tình phân lập nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc tủy xương hướng đến ghép điều trị bệnh lý tổn thương xương

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐHYK PHẠM NGỌC THẠCH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO NGHIỆM THU KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ (NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH PHÂN LẬP, NI CẤY, BIỆT HĨA TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG, HƯỚNG ĐẾN GHÉP ĐIỀU TRỊ BỆNH LÝ TỔN THƯƠNG XƯƠNG) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: TRƯỜNG ĐHYK PHẠM NGỌC THẠCH Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS.TS TRẦN CÔNG TOẠI THS PHAN KIM NGỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục đồ thị PHẦN MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KỸ NGHỆ MÔ 1.2 NGUỒN TẾ BÀO SỬ DỤNG TRONG KỸ NGHỆ MÔ XƯƠNG 1.2.1 Tế bào gốc trung mô 1.2.2 Nguồn gốc xác định tế bào gốc trung mô 1.2.3 Nguồn thu nhận tế bào gốc trung mô 1.2.4 Phân lập trì tế bào gốc trung mô 1.2.5 Đặc điểm định danh tế bào gốc trung mô 1.2.6 Số lượng tế bào gốc trung mô 10 1.2.7 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương 11 1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ THU NHẬN TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 12 1.3.1 Tiềm tạo xương 13 1.3.2 Tiềm biệt hóa thành nguyên bào xương 14 1.3.3 Các marker định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 14 1.3.3.1 CD105 15 1.3.3.2 CD90 15 1.3.3.3 CD73 16 1.3.4 Các marker nguyên bào xương 17 1.3.4.1 Marker tăng trưởng tế bào 18 1.3.4.2 Marker protein chất ngoại bào 18 1.3.4.3 Marker q trình khống hóa chất 19 1.4 GIÁ THỂ 20 1.5 CÁC YẾU TỐ HOẠT HÓA SINH HỌC 21 1.6 SỬ DỤNG SAN HÔ LÀM VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG 22 1.6.1 Sử dụng san hô Porites để tạo vật liệu ghép thay xương 23 1.6.1.1 Thành phần cấu tạo san hô Porites 23 1.6.1.2 Cấu trúc độ xốp san hô 24 1.6.1.3 Đặc điểm học 25 1.6.1.4 Đặc tính cảm ứng tạo xương 26 1.6.1.5 Đặc tính kích ứng tạo xương 26 1.6.1.6 Khả tạo xương 27 1.6.1.7 Tính tương hợp sinh học 28 1.6.1.8 Đặc tính thối biến sinh học 28 1.6.1.9 Kiểm soát chất lượng mảnh ghép san hô 31 1.6.2 Nguyên tắc xử lý, chế tạo san hô thành vật liệu ghép thay xương 31 1.7 MƠ HÌNH ĐỘNG VẬT TRONG ĐÁNH GIÁ VẬT LIỆU GHÉP THAY XƯƠNG 32 1.7.1 Tiêu chuẩn lựa chọn mơ hình động vật 32 1.7.2 Mơ hình động vật thỏ để đánh giá vật liệu ghép thay xương 34 1.8 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ QUÁ TRÌNH LIỀN XƯƠNG 36 1.8.1 Dựa hình ảnh X-Quang 36 1.8.2 Dựa đo độ hấp thu tia X hai nguồn lượng chụp cắt lớp 36 1.8.3 Dựa hình thái mô xương 37 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 2.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 40 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.3.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô từ thu nhận từ tủy xương người 40 2.3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người 40 2.3.1.2 Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 42 2.3.1.3 Đánh giá tính tồn vẹn tế bào qua nhiễm sắc thể đồ 46 2.3.2 Tạo mảnh ghép thay xương từ kết hợp tế bào gốc trung mô từ tủy xương người khung san hô 48 2.3.3 Ghép mảnh ghép san hô mang nguyên bào xương trường hợp khuyết xương thỏ 49 2.3.3.1 Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương thỏ 50 2.3.3.2 Biệt hóa tế bào gốc tủy xương thỏ thành nguyên bào xương 51 2.3.3.3 Tạo mảnh ghép từ khung san hô tế bào gốc trung mô 51 2.3.3.4 Ghép mảnh ghép phần thân xương đùi thỏ 52 2.3.3.4 Ghép mảnh ghép bệnh nhân tình nguyện 53 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 54 3.1 PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TỦY XƯƠNG NGƯỜI 54 3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ tủy xương người 54 3.1.2 Kết nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ tủy xương người 61 3.1.3 Kết định danh tế bào gốc trung mô 67 3.1.4 Định danh nguyên bào xương 74 3.1.5 Đánh giá tính tồn vẹn tế bào qua nhiễm sắc thể đồ 82 3.2 TẠO MẢNH GHÉP TỪ SỰ KẾT HỢP CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ VÀ KHUNG SAN HÔ 84 3.2.1 Đánh giá tăng trưởng tế bào mảnh ghép 86 3.2.2 Đánh giá đặc điểm cấu trúc mảnh ghép 88 3.2.3 Đánh giá khả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương giá thể san hô 92 3.3 XÂY DỰNG MƠ HÌNH GHÉP ĐOẠN XƯƠNG ĐÙI TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ KHUNG SAN HÔ VÀ NGUYÊN BÀO XƯƠNG TỰ THÂN 94 3.3.1 Phân lập, nuôi cấy nhân khối tế bào tủy xương thỏ 94 3.3.2 Cảm ứng biệt hóa tạo nguyên bào xương từ tế bào gốc tủy xương thỏ 101 3.3.3 Tạo mảnh ghép từ giá thể san hô tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xương thỏ 103 3.3.4 Quy trình ghép mảnh ghép đoạn xương đùi thỏ 106 3.3.5 Đánh giá kết sau ghép 109 3.3.5.1 Mảnh ghép thời điểm tháng 109 3.3.5.2 Mảnh ghép thời điểm tháng 113 3.3.5.3 Mảnh ghép thời điểm tháng 115 3.4 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GHÉP TRÊN LÂM SÀNG ĐỐI VỚI MỘT SỐ TRƯỜNG HỢP BỆNH NHÂN ĐƯỢC GHÉP MẢNH GHÉP 121 3.4.1 Ghép mảnh ghép để điều trị trường hợp khuyết xương 121 3.4.1.1 Trường hợp gãy khuyết xương đùi 121 3.4.1.2 Trường hợp gãy khuyết xương ngón tay 123 3.4.1.3 Trường hợp tổn thương hoại tử chỏm xương đùi 126 KẾT LUẬN 129 KIẾN NGHỊ 130 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN PHỤ LỤC NGHIÊN CỨU DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT ADSCs Adipose-Derived Stem Cells Tế bào gốc từ mô mỡ ALP Alkaline Phosphatase Enzyme Alkaline Phosphatase BMSC Bone Marrow Stem Cell Tế bào gốc tủy xương BTE Bone Tissue Engineering Kỹ nghệ mô xương CFU-Fs Colony Forming Units - Fibroblasts Đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi Cộng CS FBS Fetal Bovine Serum Huyết thai bò H&E Hematoxylin&Eosin Nhuộm Hematoxylin Eosin HA Hydroxyapatite Hydroxyapatite ISCT International Society for Cellular Hội liệu pháp Tế bào Quốc tế Therapy MSC Mesenchymal Stem Cell Tế bào gốc trung mô NBF Neutral Buffered Formalin Dung dịch formalin đệm trung tính Nhiễm sắc thể NST OB Osteoblast Nguyên bào xương OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm phosphate SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét Tế bào gốc TBG UCMSCs Umbilical Cord MSCs Tế bào gốc trung mô cuống rốn vQCT volumetric Quantitative Computed Chụp cắt lớp định lượng thể Tomography tích DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số yếu tố tăng trưởng sử dụng phổ biến kỹ nghệ mô xương 21 Bảng 1.2 Đặc trưng rỗng san hô Porites lutea 24 Bảng 3.3 Kết phân lập tế bào gốc tủy xương số CFU-Fs 54 Bảng 3.4 So sánh mật độ tế bào đơn nhân thu nhận từ tủy xương người 57 Bảng 3.5 So sánh số CFU-Fs thu nhận từ tủy xương người 59 Bảng 3.6 Mật độ tế bào đếm lần cấy chuyền thứ ba 64 Bảng 3.7 Khung CD Panel kết phân tích Flow Cytometry 69 Bảng 3.8 Giá trị đo mật độ quang hai nhóm mẫu tế bào gốc trung mô nguyên bào xương 87 Bảng 3.9 Tóm tắt số đặc điểm thỏ trình nghiên cứu 96 Bảng 3.10 Một số đặc điểm tương đồng tế bào gốc trung mô từ tủy xương người thỏ 99 Bảng 3.11 Mật độ tế bào từ tủy xương thỏ lần cấy chuyền thứ ba 100 Bảng 3.12 Thỏ bị hủy ghép 107 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào gốc trung mơ thu nhận từ tủy xương 12 Hình 1.2 Các yếu tố phiên mã có liên quan q trình biệt hóa tạo ngun bào xương từ tế bào gốc trung mô 18 Hình 3.3 Kết ni cấy tế bào từ tủy xương người 61 Hình 3.4 So sánh hình thái tế bào gốc trung mơ số nhóm nghiên cứu 62 Hình 3.5 Hình thái tế bào sau tiến hành nhân khối 63 Hình 3.6 Hình thái tế bào q trình ni cấy in vitro 68 Hình 3.7 Kết thực Flow Cytometry 70 Hình 3.8 Kết biệt hóa tế bào gốc trung mơ in vitro 72 Hình 3.9 Kết nghiên cứu tác giả Yaling Shi 73 Hình 3.10 Con đường truyền tín hiệu BMP-9 75 Hình 3.11 Sơ đồ mơ tả giai đoạn biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành nguyên bào xương 76 Hình 3.12 Nhuộm hóa mơ miễn dịch huỳnh quang để xác định diện Osterix Runx2 77 Hình 3.13 Kết đánh giá biểu Alkaline Phosphatase 78 Hình 3.14 Sự biểu Alkaline Phosphatase so với nhóm nghiên cứu khác 79 Hình 3.15 Kết đánh giá biểu gien Osteocalcin Osteopontin 81 Hình 3.16 Khảo sát nhiễm sắc thể tế bào trước sau biệt hóa thành nguyên bào xương 83 Hình 3.17 Nhiễm sắc thể đồ tế bào gốc trung mô theo tác giả Jeon Chang Ra cộng 84 Hình 3.18 Đánh giá cấu trúc mảnh ghép mơ xương nhuộm Giemsa H&E 89 Hình 3.19 Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch huỳnh quang khối san hô mang nguyên bào xương 90 Hình 3.20 Ảnh SEM nguyên bào xương nuôi giá thể san hô 91 Hình 3.21 Đánh giá biểu enzyme Alkaline phosphaste nguyên bào xương nuôi giá thể san hô 92 Hình 3.22 Quy trình thu nhận tủy xương thỏ 95 Hình 3.23 Kết nhuộm Giemsa để đếm số lượng CFU-Fs 97 Hình 3.24 Kết nuôi cấy tế bào gốc thu nhận từ tủy xương thỏ 98 Hình 3.25 Kết định danh nguyên bào xương biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ tủy xương thỏ 102 Hình 3.26 Kết đánh giá mảnh ghép nhuộm Giemsa H&E 104 Hình 3.27 Kết đánh giá biệt hóa tế bào gốc trung mô thành nguyên bào xương khung san hô 105 Hình 3.28 Nguyên nhân ghép thất bại thỏ 107 Hình 3.29 Quy trình phẫu thuật ghép san hô xương đùi thỏ 108 Hình 3.30 Kết ghép thỏ thời điểm tháng 110 Hình 3.31 Kết đánh giá mơ học mảnh ghép có mang nguyên bào xương tự thân thời điểm tháng 111 Hình 3.32 Kết đánh giá mơ học mảnh ghép khơng có mang ngun bào xương tự thân thời điểm tháng 112 Hình 3.33 Kết ghép thỏ thời điểm ba tháng 113 Hình 3.34 Kết ghép thỏ thời điểm sáu tháng 115 Hình 3.35 Mảnh ghép tạo thành từ khung san hô tế bào từ người bệnh 121 Hình 3.36 Kết ghép bệnh nhân gãy khuyết xương đùi sau tháng ghép 122 Hình 3.37 Mảnh ghép dùng để ghép bảo tồn đốt ngón tay 123 Hình 3.38 Kết ghép bệnh nhân khuyết xương đốt ngón tay tháng sau ghép 124 Hình 3.39 Kết theo dõi ghép bệnh nhân khuyết xương đốt ngón tay 125 Hình 3.40 Kết ghép mảnh ghép cho bệnh nhân hoại tử chỏm xương đùi 126 Hình 3.41 Kết ghép sau tháng cho bệnh nhân hoại tử chỏm xương đùi 127 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1 Đường cong tăng trưởng tế bào (F3) xây dựng theo mật độ tế bào 66 Đồ thị 3.2 So sánh đường cong tăng trưởng hai dòng tế bào gốc trung mô nguyên bào xương nuôi khung san hô 87 Đồ thị 3.3 Đường cong tăng trưởng tế bào từ tủy xương thỏ 100 67 Garbuz D, Morsi E, Mohamed N, Gross A.E (1996), Classification and reconstruction in revision acetabular arthroplasty with bone stock deficiency, Clinical Orthopaedics and Related Research, 323:98-107 68 Gaurav Luther et al (2011), BMP-9 Induced Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells: Molecular Mechanism and Therapeutic Potential, Current Gene Therapy, 11:1-12 69 Gay CG, Muller WJ (1974), Carbonic anhydrase and osteoclast, Science, 183:432-434 70 Genant HK, Jiang Y (2006), Advanced imaging assessment of bone quality, Ann NY Acad Sci, 1068:410–428 71 Gerber I, and Gwynn I (2002), Differentiation of rat osteoblast-like cells in monolayer and micromass cultures, European cells and materials, 3:19–30 72 Gimble JM, Katz AJ, Bunnell BA (2007), Adipose-derived stem cells for regenerative medicine, Circulation Research, 100:1249–1260 73 Gravel M, Gross T, Vago R, Tabrizian M (2006), Responses of mesenchymal stem cell to chitosan-coralline composites microstructured using coralline as gas forming agent, Biomaterials, 27:1899–1906 74 Guigui P, Plais PY, Flautre B, Viguier E, Blary MC, Chopin D, Lavaste F, Hardouin P (1994), Experimental model of posteriolateral spinal arthrodesis in sheep, part 2, application of the model: evaluation of vertebral fasion obtained with coral (porites) or with biphasic ceramic (friosite), Spine, 19(24): 2793-2803 75 Guillemin G, Patat J-L, Fournie J, Chétail M (1987a), The use of coral as a bone graft substitute, Journal of Biomedical Materials Research Part B, 21:557567 76 H Ohgushi, V.M Goldberg and A.I Caplan (1989), Heterotopic osteogenesis in porous ceramics induced by marrow cells, Journal of Orthopaedic Research, 7:568–578 77 Hanada K, Dennis JE, Caplan AI (1997), Stimulatory effects of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein-2 on osteogenic 138 differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells, Journal of Bone and Mineral Research, 12:1606–1614 78 Hashikawa T, Takedachi M, Terakura M, Saho T, Yamada S, Thompson LF, Shimabukuro Y, Murakami S (2003), Involvement of cd73 (ecto-5'-nucleotidase) in adenosine generation by human gingival osteoblasts, Journal of Dental Research, 82:888–892 79 Haynesworth SE, Baber MA, Caplan AI (1992), Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies, Bone, 13:69–80 80 Haynesworth, S.E, Goshima, J, Goldberg, V.M, and Caplan, A.I (1992), Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow, Bone, 13(1):81-88 81 Hazzard DG, Bronson RT, McClearn GE, Strong R (1992), Selection of an appropriate animal model to study aging processes with special emphasis on the use of rat strains, J Gerontol, 47:B63-B64 82 Heng BC, Cao T, Stanton LW, et al (2004), Strategies for directing the differentiation of stem cells into the osteogenic lineage in vitro, Journal of Bone and Mineral Research, 19:1379–1394 83 Hernigou P, Poignard A, Beaujean F, Rouard H (2005), Pecutaneous autologus bone marrow grafting for nonunion Influence of the number and concentration of progenitor cells, The Journal of Bone & Joint Surgery, 87A(7):1430-1437 84 Hockin, H.K.X, Zhao, L, Detamore, M.S, Takagi, S, and Chow, L.C (2010), Umbilical cord stem cell seeding on fast-resorbable calcium phosphate bone cement, Tissue Engineering Part A, 16(9):2743-2753 85 Holmes R (1979), Bone regeneration within a coralline hydroxyapatite implant, Plastic and Reconstructive Surgery, 63:626-633 86 Hou, R, Chen, F, Yang, Y, Cheng, X, Gao, Z, Yang, H O, Wu, W and Mao, T (2007), Comparative study between coral-mesenchymal stem cells-rhBMP-2 139 composite and auto-bone-graft in rabbit critical-sized cranial defect model, Journal of Biomedical Materials Research Part B, 80A:85–93 87 Huang, Shuo; Xu, Liangliang; Sun, Yuxin; Wu, Tianyi; Wang, Kuixing; Li, Gang (2015), An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow, Journal of Orthopaedic Translation, 3(1):26-33 88 Hye Jin Jin, Yun Kyung Bae, Miyeon Kim, Soon-Jae Kwon, Hong Bae Jeon, Soo Jin Choi, Seong Who Kim, Yoon Sun Yang, Wonil Oh and Jong Wook Chang (2013), Comparative Analysis of Human Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue, and Umbilical Cord Blood as Sources of Cell Therapy, International Journal of Molecular Sciences, 14:17986-18001 89 In’t Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der KC, Noort WA, Claas FH, Willemze R et al (2003), Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for therapeutic transplantation, Blood, 102:1548–1549 90 International Standard ISO 10993-6 (1994), Biological evaluation of medical devices - Part 1-11 91 Itoman M (1992), Development and present status of tissue banking in Japan with report from kitasato Bone Bank IAEA/RCA Project Radiation Sterilization of Tissue Grafts, Project Formulation Meeting, Manila, Philippines, 3-7 August 1992 92 J Vuola, H Göransson, T Böhling and S Asko-Seljavaara (1996), Bone marrow induced osteogenesis in hydroxyapatite and calcium carbonate implants, Biomaterials, 17:1761–1766 93 J.A Chamberlain (1978), Mechanical properties of coral skeleton: compressive strength and its adaptive significance, Paleobiology, 4:419–435 94 J.C Fricain, R Bareille, F Ulysse, B Dupuy and J Amedee (1998), Evaluation of proliferation and protein expression of human bone marrow cells cultured on coral crystallized in the aragonite or calcite form, Journal of Biomedical Materials Research Part B, 42:96–102 140 95 J.Ch Fricain, M Roudier, F Rouais, B Basse-Cathalinat and B Dupuy (1996), Influence of the structure of three corals on their resorption kinetics, Journal of Periodontal Research, 31:463–469 96 J.Ch Fricain, Ch Baquey and B Dupuy (1995), Resorption of corals implanted in diffusion chambers, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 6:680–684 97 J.Ch Fricain, R Bareille, F Rouais, B Basse-Cathalinat and B Dupuy (1998), “In vitro” dissolution of coral in peritoneal or fibroblast cell cultures, Journal of Dental Research, 77:406–411 98 J.L Irigaray, H Oudadesse and G Blondiaux (1990), Quantitative study of the coral transformations ‘in vivo’ by several physical analytical methods, Biomaterials, 110:73–74 99 J.L Irigaray, T Sauvage, H Oudadesse et al (1993), Study of the mineralization of coral implanted in vivo by radioactive tracers, Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, 174:93–102 100 J.-L Patat, J.C Pouliquen and G Guillemin (1992), Le corail naturel utilisé comme substitut de greffon osseux Son rôle dans les économies de sang dans la chirurgie du rachis, Acta Orthop Belg, 58:115–121 101 J.M Sautier, J.R Nefussi, H Boulekbache and N Forest (1990), In vitro bone formation on coral granules In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal, 26:1079–1085 102 J.P Ouhayoun, A.H.M Shabana, S Issahakian et al evaluation of natural coral skeleton as a grafting (1992), Histological material in miniature swine mandible, Journal of Materials Science, 3:222–228 103 Jaber S, Klein BY, Leicher I, Ben Bassat H, Gal I, Liebergall M, Segal D (1995), Tibial implant mineralization in rats is inversely related to serum osteogenic acity, Bone, 16(1):81-84 141 104 Jäger M, Feser T, Denck H, et al (2005), Proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells cultured onto three different polymers in vitro, Annals of Biomedical Engineering, 33(10):1319–1332 105 Jaiswal RK, Jaiswal N, Bruder SP, Mbalaviele G, Marshak DR, Pittenger MF (2000), Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase, Journal of Biological Chemistry, 275(13):9645–9652 106 Jammet P, Souyris F, Baldet P, Bonnel F, Hugnet M (1994), The effect of different porosities in coral implants: an experimental study, Journal of Craniomaxillofacial Surgery, 22(2): 103-108 107 Javazon EH, Beggs KJ, Flake AW (2004), Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging, Experimental Hematology, 32:414–425 108 Jeon Chang Ra, Seob Shin, Sang Han Kim, Sung Keun Kang, Byeong Cheol Kang, Hang Young Lee, Youn Joung Kim, Jung Youn Jo, Eun Ji Yoon, Hyung Jun Choi, and Euna Kwon (2011), Safety of Intravenous Infusion of Human Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells in Animals and Humans, STEM CELLS AND DEVELOPMENT, 20(8): 1297-1308 109 Jung, R E, Glauser, R, Scharer, P, Hammerle, C H F, Sailer, H F, Weber, F E (2003), Effect of rhBMP-2 on guided bone regeneration in humans – A randomized, controlled clinical and histomorphometric study, Clinical Oral Implants Research, 14:556–568 110 Karin Stenderup, Jeannette Justesen, Erik F Eriksen, Suresh I S Rattan and Moustapha Kassem (2001), Number and Proliferative Capacity of Osteogenic Stem Cells Are Maintained During Aging and in Patients with Osteoporosis, Journal of Bone and Mineral Research, 16(6):1120-1129 111 Kolambkar, Y.M, Peister, A, Ekaputra, A.K, Hutmacher, D.W, and Guldberg, R.E (2010), Colonization and osteogenic differentiation of different stem cell sources on electrospun nanofiber meshes, Tissue Engineering Part A, 16(10):321930 142 112 Kotobuki N, Hirose M, Machida H, Katou Y, Muraki K, Takakura Y, Ohgushi H (2005), Viability and osteogenic potential of cryopreserved human bone marrowderived mesenchymal cells Tissue Engineering, 11(5-6):663–673 113 Kreklau, M Sittinger, M.B Mensing et al (1999), Tissue engineering of biphasic joint cartilage transplants, Biomaterials, 20:1743–1749 114 Kuhn NZ, Tuan RS (2010), Regulation of stemness and stem cell niche of mesenchymal stem cells: implications in tumorigenesis and metastasis, Journal of Cellular Physiology, 222(2):268-77 115 Kuhne JH, Bart R, Frisch B, Hammer C, Jansson V, Zimmer M (1994), Bone formation in coralline hydroxyapatite, effects of pore size studied in rabbits, Acta Orthopaedica Scandinavica, 65(3):246-252 116 Leboy PS, Beresford JN, Devlin C, Owen ME (1991), Dexamethasone induction of osteoblast mRNAs in rat marrow stromal cell cultures, Journal of Cellular Physiology, 146:370–378 117 Lian JB, Stein GS (1992), Concepts of osteoblast growth and differentiation: basis for modulation of bone cell development and tissue formation, Critical reviews in oral biology and medicine, 3(3):269-305 118 Lieberman JR, et al (1998), Regional gene therapy with a BMP-2-producing murine stromal cell line induces heterotopic and orthotopic bone formation in rodents, Journal of Orthopaedic Research, 16:330–339 119 Lisa G Shaffer, Marilyn L.Slovak, Lynda J Campell (2009), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature S Karger AG (Switzerland) 120 M F Pittenger, A M Mackay, S C Beck et al (1999), Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, Science, 284(5411):143–147 121 M Koide, Y Murase, K Yamato, T Noguchi, N Okahashi and T Nishihara (1999), Bone morphogenetic protein-2 enhances osteoclast formation mediated by interleukin-1 alpha through upregulation of osteoclast differentiation factor and cyclooxygenase 2, Biochemical and Biophysical Research Communications, 259:97–102 143 122 M Richard, E Aguado, M Cottrel and G Daculsi (1998), Ultrastructural and electron diffraction of the bone-ceramic interfacial zone in coral and biophasic CaP implants, Calcified Tissue International, 62:437–442 123 M Roudier, C Bouchon, J.L Rouvillain et al (1995), The resorption of bone- implanted corals varies with porosity but also with the host reaction, Journal of Biomedical Materials Research, 29:909–915 124 M.J Doherty, G Schlag, N Schwarz, R.A.B Mollan, P.C Nolan and D.J Wilson (1994), Biocompatibility of xenogeneic bone, commercially available coral, a bioceramic and tissue sealant for human osteoblasts, Biomaterials, 15:601–608 125 Ma, T Mao, B Liu et al (2000), Vascular osteomuscular autograft prefabrication using coral, type I collagen and recombinant human bone morphogenetic protein-2, Journal of the British Association of Oral and Maxillofacial Surgeons, 38:561–564 126 Maitane Pérez-Ilzarbe et al (2009), Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy, Transfusion, 49:1901-1910 127 Major A.K, Boehm C.A, Nitto H, Midura R.J, Muschler G.F (1997), Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation, Orthopaedic Research, 15(4), 546-557 128 Malone JD, Teitelbaum SL, Griffin GL, Senior RM, Kahn AJ (1982), Recruitment of osteoclast precursors by purified bone matrix constituents, J Cell Biol, 92:227–230 129 Marchac D, Sandor G (1994), Use of coral granules in the craniofacial skeleton, J Craniofac Surg, 5(4) :213-217 130 Martin Braddock, Parul Houston, Callum Campbell, Patrick Ashcroft (2001), Born again bone: Tissue engineering for bone repair, Physiology, 16(5):208-213 131 Martin, I., Quarto, R., Dozin, B & Cancedda, R (1997), Producing prefabricated tissues and organs via tissue engineering, IEEE Eng Med BioLMag, 16:73-80 144 132 Martiniakova M, Omelka R, Chrenek P, Ryban L, Parkanyi V, Grosskopf B, Vondrakova M, Bauerova M (2005), Changes of femoral bone tissue microstructure in transgenic rabbits, Folia Biol (Praha), 51:140-144 133 Masoud Soleimani, Samad Nadri (2009), A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow, Nature Protocols, 4(1):102106 134 Mauney JR, Volloch V, Kaplan DL (2005), Role of adult mesenchymal stem cells in bone tissue engineering applications: current status and future prospects, Tissue Engineering, 11(5-6):787–802 135 Maureen Beederman et al (2013), BMP signaling in mesenchymal stem cell differentiation and bone formation, J Biomedical Science and Engineering, 6:3252 136 Maya Fakhry, Eva Hamade, Bassam Badran, René Buchet, David Magne (2013) Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts, World J Stem Cells, 5(4):136-148 137 McIntosh, K., Zvonic, S., Garrett, S., Mitchell, J.B., Floyd, Z.E., Hammill, L., et al (2006) The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro, Stem Cells, 24(5):1246-1253 138 Mercier J, Piot B, Gueguen P, Cantaloube D, Blanc JL, Bontault F Cariou JL, Davauchelle B, Pellerin Ph, Peri G, Ricbourg B, Stricker M, Wilk A (1996) Le plancher orbitaire en corail Son intérêt en traumatologie, resultats d’une étude multicentrique portant sur 83 cas, Revue de Stomatologie et de Chirugie Maxillofaciale, 97(6):324-231 139 Minguell JJ, Erices A, Conget P (2001), Mesenchymal stem cells, Experimental Biology and Medicine, 226:507-520 140 Mitchell, J.B., McIntosh, K., Zvonic, S., Garretta, S., Floyd, Z.E., Kloster, A., et al (2006) Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers Stem Cells, 24(2):376-385 145 141 Mora F, Ouhayoun JP (1995) Clinical evaluation of natural coral and porous hydroxyapatite implants in periodontal bone lesions, results of one year follow-up, J Clin Periodontal, 22(11):877-884 142 Muraglia, A., Cancedda, R., and Quarto, R (2000), Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model, Journal of Cell Science, 113(7):1161-1166 143 N L M Chan, A Bourdeau, S Vera et al (2004), Umbilical vein and placental vessels from newborns with hereditary haemorrhagic telangiectasia type genotype are normal despite reduced expression of endoglin, Placenta, 25(23):208–217 144 N.N Bou-Abboud, J.-L Patat, G Guillemin, S Issahakian, N Forest and J.-P Ouhayoun (1994), Evaluation of the osteogenic potential of biomaterials implanted in the palatal connective tissue of miniature pigs using undecalcified sections, Biomaterials, 15:201–207 145 Nassiri F, Cusimano MD, Scheithauer BW, Rotondo F, Fazio A, Yousef GM, Syro LV, Kovacs K, Lloyd RV (2011), Endoglin (cd105): A review of its role in angiogenesis and tumor diagnosis, progression and therapy, Anticancer Research, 31:2283–2290 146 National Institutes of Health resource for stem cell research (2008) The stem cell information Stem Cell Basics page Available at: http://stemcells.nih.gov/info/basics/defaultpage.asp 147 Newman et al, 199 Newman E, Turner AS, Wark JD (1995), The potential of sheep for the study of osteopenia: current status and comparison with other animal models, Bone, 16:277S-284S 148 Neyt JG, Buckwalter JA, Carroll NC (1998) Use of animal models in musculoskeletal research Iowa Orthop J 18:118-123 149 Nuttall, M E, Patton, A J, Olivera, D L, Nadeau, D P, and Gowen, M (1998), Human trabecular bone cells are able to express both osteoblastic and 146 adipocytic phenotype: Implications for osteopenic disorders, Journal of Bone and Mineral Research, 13:371–382 150 Ohgushi, M Okumura, T Yoshikawa et al (1992), Bone formation process in porous calcium carbonate and hydroxyapatite, Journal of Biomedical Materials Research, 26:885–895 151 Oldberg A, Franzen A, Heinegard D (1988a), The primary structure of a cell- binding bone sialoprotein, The Journal of biological chemistry, 263(36):19430– 19432 152 Oswald J, Boxberger S, Jørgensen B, Feldmann S, Ehninger G, Bornhäuser M, Werner C (2004), Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro, Stem Cells, 22(3):377-84 153 Owen, M and Friedenstein, A J (1988), Stromal stem cells - marrow-derived osteogenic precursors, Ciba Foundation Symposia, 136:42–60 154 Papacharalambous SK, Anastasff KI (1993), Natural coral skeleton use as only graft for contour augmentation of the face, a preliminary report, International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 22(5): 260-264 155 Park, S R, Oreffo, R O C, and Triffitt, J T (1999), Interconversion potential of cloned human marrow adipocytes in vitro, Bone, 24:549–554 156 Patel, A., Honnart, F., Guillemin, G and Patat, J L (1980), Utilisation de fragments de squelette de coraux madréporaires en chirurgie orthopédique et réparatrice Chirurgie, 106(3):199-205 157 Phinney DG, Kopen G, Righter W, Webster S, Tremain N, Prockop DJ (1999), Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells, Journal of Cellular Biochemistry, 75:424–436 158 Ponche A, Bigerelle M, Anselme K (2010), Relative influence of surface topography and surface chemistry on cell response to bone implant materials Part 1: physico-chemical effects, Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers Part H, 224:1471-1486 147 159 Ralf Hass, Cornelia Kasper, Stefanie Böhm, and Roland Jacobs (2011), Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC, Cell Communication and Signaling, 9:12 160 Rege TA, Hagood JS (2006), Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis, The FASEB Journal, 20:1045–1054 161 Reichert, J.C, Woodruff, M.A, Friis, T, Quent, V.M.C, Gronthos, S, Duda, G.N, Schuătz, M.A, and Hutmacher, D.W (2010), Ovine bone - and marrow derived progenitor cells and their potential for scaffold-based BTE applications in vitro and in vivo Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4(7):565-776 162 Risteli J, Elomaa I, Niemi S, Novamo A, Risteli L (1993), Radioimmunoassay for the pyridinoline cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type I collagen: a new serum marker of bone collagen degradation, Clinical Chemistry, 39(4):635– 640 163 Roach HI (1994), Why does bone matrix contain non-collagenous proteins? The possible roles of osteocalcin, osteonectin, osteopontin, and bone sialoprotein in bone mineralization and resorption, Cell Biology International, 18:617–628 164 Roudier M, Bouchon C, Rouvilain JL, Amedee I, Bareille R Rouais F, Fricain JC, Dupuy B, Rien P, Jeandot R et al (1995) The resorption of bone implanted corals varies with porosity but also with the host reaction, Journal of Biomedical Materials Research, 29(8): 909-9153 165 Rouvillian JL, Bouchon C, Catonne Y (1990), Résultats de l’utilization de corail dans le comblement des pertes de substances osseuse en Maritinique Rev Chi Orthop Repar Appareil Moteur, 76(1):154-155 166 S Louisia, M Stromboni, A Meunier, L Sedel and H Petite (1999), Coral grafting supplemented with bone marrow, The Bone & Joint Journal, 81:719–724 148 167 S.D Boden, J.H.chimandle, W.C Hutton et al (1997), In vivo evaluation of resorbable osteoinductive composite as a graft substitute for lumbar spinal fusion Journal of Spinal Disorders, 10:1–11 168 Saifeddin Alsalameh, Rayya Amin, Takefumi Gemba, and Martin Lotz (2004), Identification of Mesenchymal Progenitor Cells in Normal and Osteoarthritic Human Articular Cartilage, Arthritis and Rheumarism, 50(5):1522– 1532 169 Salasznyk R.M, Williams W.A, Boskey A, Batorsky A, Plopper E (2004) Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells, Journal Of Biomedicine And Biotechnology, 2004:24–34 170 Salgado AJ, Coutinho OP, Reis RL (2004), Bone tissue engineering: state of the art and future trends, Macromolecular Bioscience, 4:743-765 171 Schimandle JH, Boden SD (1994), Spine update The use of animal models to study spinal fusion, Spine, 19:1998-2006 172 Seebach C, Henrich D, Tewksbury R, Wilhelm K, Mrzi I (2007), Number and proliferative capacity of human mesenchymal stem cells are modulated positively in multiple trauma patients and negatively in atrophic nonunions, Calcif Tissue Int, 80(4), 294-300 173 Sekiya I, Larson BL, Smith JR, Pochampally R, Cui JG, Prockop DJ (2002), Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality, Stem Cells, 20:530–541 174 Shenaq, D S, Rastegar, F, Petkovic, D et al (2010), Mesenchymal progenitor cells and their orthopedic applications: Forging a path towards clinical trials, Stem Cells International Online DOI:10.4061/2010/519028 175 Soleimani, Masoud; Nadri, Samad (2009), A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow, Nature Protocols, 4(1):102106 149 176 StemPro®Chondrogenesis Differentiation Kit, Publication Number MAN0000696, Rev 2.00, www.lifetechnologies.com 177 Stute N, Holtz K, Bubenheim M, Lange C, Blake F, Zander AR (2004), Autologous serum for isolation and expansion of human mesenchymal stem cells for clinical use, Experimental Hematology, 32:1212–1225 178 T Turunen, J Peltola, H Helenius et al (1997), Bioactive glass and calcium carbonate granules as filler material around titanium and bioactive glass implants in the medullar space of the rabbit tibia, Clin Oral Implants Res, 8:96–102 179 T.-J Gao, T.K Tuominen, T.S Lindholm et al (1997), Morphological and biomechanical difference in healing in segmental tibial defects implanted with Biocoral® or tricalcium phosphate cylinders, Biomaterials, 18:219–223 180 Takagi K, Urist MR (1982), The reaction of the dura to bone morphogenetic protein (BMP) in repair of skull defects, Annals of Surgery, 196:100-109 181 Tamajusuku AS, Carrillo-Sepulveda MA, Braganhol E, Wink MR, Sarkis JJ, Barreto-Chaves ML, Battastini AM (2006), Activity and expression of ecto-5'nucleotidase/cd73 are increased by thyroid hormones in vascular smooth muscle cells, Molecular and Cellular Biochemistry, 289:65–72 182 Thorwarth M, Schultze-Mosgau S, Kessler P, Wiltfang J, Schlegel KA (2005), Bone regeneration in osseous defects using a resorbable nanoparticular hydroxyapatite, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 63:1626–1633 183 Tran Cong Toai, Ciro Gargiulo, Huynh Duy Thao, Huynh Minh Tuan and Luis Filgueira, et al (2011), Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells, Cell and Tissue Banking, 12:247-261 184 Tran Cong Toai, Huynh Duy Thao, Nguyen Phuong Thao, Ciro Gargiulo and Phan Kim Ngoc, et al (2010), In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood Cell and Tissue Banking, 11:269-280 185 Tsuji K, Ito Y, Noda M (1998), Expression of the PEBP2alphaA/AML3/CBFA1 gene is regulated by BMP4/7 heterodimer and its 150 overexpression suppresses type I collagen and osteocalcin gene expression in osteoblastic and nonosteoblastic mesenchymal cells, Bone, 22(2):87-92 186 Turner CH, Burr DB (1993), Basic biomechanical measurements of bone: A tutorial, Bone, 14:595–608 187 Varma MJ, Breuls RG, Schouten TE, Jurgens WJ, Bontkes HJ, Schuurhuis GJ, van Ham SM, van Milligen FJ (2007), Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells, Stem Cells and Development, 16:91–104 188 Wang, H.S, Hung, S.C, Peng, S.T, Huang, C.C, Wei, H.M, Guo, Y.J et al (2004), Mesenchymal SCs in the Wharton’s jelly of the human umbilical cord, Stem Cells, 22:1330-1337 189 Wei L, Lei GH, Yi HW, Sheng Py (2014), Bone formation in rabbit's leg muscle after autologous transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells expressing human bone morphogenic protein-2 Indian Journal of Orthopaedics, 48:347-53 190 Weiss S, Zimmerman MC, Harten RD, Alberta FG, Meunier A (1998), The acoustic and structural properties of the human femur, J Biomech Eng, 120:71–76 191 Weissman I.L., Anderson, D.J., and Gage, F (2001), Stem and progenitor cells: Origins, phenotypes, lineage commitments, and transdifferentiations, Annual Review of Cell and Developmental Biology, 17: 387-403 192 Xinlong Yan, Lixin Shi, Guangfu Chen, Xu Zhang, Bing Liu, Wen Yue, Xuetao Pei, Shengkun Sun (2012), Mesenchymal stem cell-like cells in classic renal angiomyolipoma, Oncology, 4(3):398-402 193 Y Levet and G Jost (1983), Utilisation de squelettes de coraux madréporaires en chirurgie réparatrice Ann Chir Plast Esthet, 28:180–181 194 Yaling Shi; Jerry R Niedzinski; Adrian Samaniego; Simon Bogdansky; and Brent L Atkinson (2012), Adipose-derived stem cell combined with a Demineralized Cancellous Bone Substrate for bone regeneration, Tissue Engineering Part A, 8(13):1313-1321 151 195 Yoshimura K, Shigeura T, Matsumoto D, Sato T, Takaki Y, Aiba-Kojima E, Sato K, Inoue K, Nagase T, Koshima I, Gonda K (2006), Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates, Journal of Cellular Physiology, 208:64–76 196 Yu-Chun Wu, Tzer-Min Lee, Kuo-Hsun Chiu, Shyh-Yu Shaw, Chyun-Yu Yang (2009), A comparative study of the physical and mechanical properties of three natural corals based on the criteria for bone–tissue engineering scaffolds, The Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 20:1273–1280 197 Yves Cirotteau (2003), The behavior of natural coral in a context of diaphyseal atrophic pseudarthrosis, The European Journal of Orthopaedic Surgery & Traumatology, 14: 89–98 198 Zhang W, Zhang F, Shi H, et al (2014), Comparisons of rabbit bone marrow mesenchymal stem cell isolation and culture methods in vitro, Plos One, 9(2):e88794 doi: 10.1371/journal.pone.0088794 152