Nghiên cứu phân lập nuôi cấy và biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu sao việt nam cervus nippon pseudaxis

Nghiệm thu đề tài Vườn ươm BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy biệt hóa in vitro quần thể tế bào gốc nhung hươu Việt Nam (Cervus nippon Pseudaxis) Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Tiến Bằng Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Thời gian thực đề tài: 12 tháng Kinh phí duyệt: 80.000.000 Kinh phí cấp: 72.000.000 theo TB số : 224 TB-SKHCN ngày 02/ 12 /2010 Mục tiêu: Mục tiêu ngắn hạn: Nuôi cấy nhân sinh khối in vitro thành công tế bào gốc nhung hươu Mục tiêu dài hạn: Thu nhận hoạt chất sinh học quý từ tế bào gốc nhung hươu nuôi cấy in vitro ứng dụng để tổng hợp thực phẩm chức Nội dung: (Theo đề cương duyệt hợp đồng ký) Công việc dự kiến Công việc thực Nghiên cứu thu nhận nuôi cấy in vitro tế Nghiên cứu thu nhận nuôi cấy in vitro tế bào đơn từ nhung hươu bào đơn từ nhung hươu Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Phân lập quần thể tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc tế bào gốc ứng viên Khảo sát tính gốc tế bào gốc ứng viên I Nghiệm thu đề tài Vườn ươm LỜI CẢM ƠN Khi nhìn thấy tế bào gốc nhung hươu phát triển điều kiện in vitro, chúng tơi, nhóm nghiên cứu trẻ phịng thí nghiệm Tế bào gốc, vỡ òa sung sướng Mặc dù bước chương trình nghiên cứu lâu dài khó khăn, có ý nghĩa quan trọng Để đạt thành ban đầu nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn tất thầy cô, quan, tổ chức tham gia thực góp ý xây dựng đề tài Chúng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:  Sở khoa học thành phố Hồ Chí Minh, chương trình Vườn ươm sáng tạo Khoa học Cơng nghệ trẻ cấp kinh phí thực đề tài  Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ trẻ đứng chủ trì đề tài  Các thầy cán nghiên cứu Phịng thí nghiệm Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên TpHCM  Trang chăn nuôi hươu nai Trường Thịnh, Long Thành, Đồng Nai Cuối nhóm nghiên cứu xin gửi lời tri ân đến thành viên hội đồng xét duyệt, phản biện nghiệm thu đóng góp nhiều ý kiến tích cực giúp đề tài thực thành cơng Tp Hồ Chí Minh, 04/06/2012 Chủ nhiệm đề tài ThS Nguyễn Tiến Bằng II Nghiệm thu đề tài Vườn ươm LỜI GIỚI THIỆU Sự phát triển năm nhung hươu trường hợp tái sinh động vật hữu nhũ, loài mà khả tái sinh lại phần bị hạn chế Ở số loài hươu, tốc độ tái tạo nhung đạt 2cm/ngày Do vậy, tái sinh nhung hươu thu hút nhiều ý nhà khoa học Các nhà nghiên cứu cho tượng tế bào gốc Các tế bào nhung hươu thu nhận nuôi cấy môi trường DMEM/F12, 10% FBS Sau khoảng 10 ngày nuôi cấy, tế bào nhung hươu tăng sinh mạnh chiếm khoảng 70 – 80% diện tích bề mặt ni cấy Tiếp đó, tế bào nhung hươu tiến hành cấy chuyền Trypsin – EDTA 0,25% nhằm cung cấp chất dinh dưỡng không gian cho phát triển chúng Các tế bào nhung hươu thu nhận thể tính đa giống tế bào gốc Trong mơi trường có tác nhân biệt hóa thích hợp, tế bào nhung hươu có khả biệt hóa thành tế bào xương, tế bào mỡ… INTRODUCTION The annual regeneration of deer velvets is a unique developmental event in mammals, which as a rule possess only a very limited capacity to regenerate lost appendages Some deer species, velvet regenerate rate achieves cm/day Thus, velvet regeneration attract the scientists's attention very much Researchers said that velvet regeneration is a stem cell – based process The cells derived from dapple deer velvet have been collected and cultured with DMEM/F12 plus 10% FBS (fetal bovine serum) About 10th day, those cells strongly expand and cover with 70 – 80% Roux’s surface At that time, the cells derived from dapple deer velvet are subcultured by using trypsin/EDTA 0,25% to provide nutrients and surface for development The cells derived from dapple deer velvet is multipotial like stem cells They could be differentiated to osteocytes in DMEM/F12, 10% FBS medium plus dexamethasone, glycerol phosphate, III Nghiệm thu đề tài Vườn ươm ascorbate, acid ascorbic; to adipocytes in DMEM/F12, 10% FBS plus isobutylmethylxanthine, dexamethasone, insulin, indomethacin IV Nghiệm thu đề tài Vườn ươm MỤC LỤC BÁO CÁO NGHIỆM THU I Lời cảm ơn II Lời giới thiệu III Mục lục V Danh sách bảng VIII Danh sách hình IX CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhung hươu ứng dụng 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Các giai đoạn phát triển sừng hươu 1.1.3 Thành phần hóa học nhung hươu 1.1.4 Một số tác dụng dược lý nhung hươu 1.1.4.1 Tác dụng bệnh viêm xương khớp 1.1.4.2 Tác dụng bệnh thấp khớp 1.1.4.3 Tác dụng kích thích miễn dịch 1.1.4.4 Tác dụng làm giảm huyết áp 1.1.4.5 Tác dụng chống sốc 1.2 Khái quát tế bào gốc 1.3 Tế bào gốc nhung hươu – lược sử nghiên cứu tiềm ứng dụng 1.3.1 Thế giới V Nghiệm thu đề tài Vườn ươm 1.3.2 Việt Nam 10 1.4 Tính cấp thiết đề tài 11 1.5 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn 11 CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu nghiên cứu tiến trình nghiên cứu 13 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 13 2.1.2 Tiến trình nghiên cứu 13 2.2 Dụng cụ thiết bị 14 2.3 Hóa chất 15 2.4 Các phương pháp thực nghiệm 19 2.4.1 Phương pháp thu nhận mẫu mô nhung hươu 19 2.4.2 Thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 20 2.4.3 Nuôi cấy tế bào đơn 21 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào cấy chuyền 22 2.4.4.1 Quy trình cấy chuyền tế bào 22 2.4.4.2 Phương pháp xác định số tế bào dựa phần mềm xCELLigence (phối hợp thực với đại diện Công ty Roche Việt Nam) 23 2.4.5 Chứng minh tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu biểu đặc điểm tế bào gốc 23 2.4.5.1 Kiểm chứng khả tăng sinh dài hạn – khả tự làm 23 2.4.5.2 Kiểm chứng khả biệt hóa 24 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết thu nhận mẫu mô nhung hươu 28 3.2 Kết thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu 29 3.3 Kết nuôi cấy sơ cấp tế bào nhung hươu 31 VI Nghiệm thu đề tài Vườn ươm 3.4 Kết cấy chuyền nuôi cấy tăng sinh tế bào nhung hươu 35 3.5 Kết chứng minh tính gốc tế bào thu nhận từ mẫu mô nhung hươu 42 3.5.1 Khả tăng sinh dài hạn – khả tự làm 42 3.5.2 Khả biệt hóa 42 3.5.2.1 Kết biệt hóa thành tế bào tạo xương 42 3.5.2.2 Kết biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 45 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 4.1 Kết luận 54 4.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 VII Nghiệm thu đề tài Vườn ươm DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG SỐ LIỆU TRANG 2.1 Danh mục dụng cụ sử dụng đề tài 14 2.2 Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 14 2.3 Danh mục hóa chất sử dụng đề tài 15 3.1 Kết thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu tươi 29 3.2 Kết thu nhận tế bào đơn từ mẫu mô nhung hươu đông 30 lạnh 3.3 Số lượng mẫu nuôi sơ cấp 31 3.4 Kết nuôi cấy sơ cấp tế bào thu nhận từ nhung hươu 34 3.5 Kết nuôi tăng sinh tế bào nhung hươu 39 VIII Nghiệm thu đề tài Vườn ươm DANH MỤC HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1 Mặt cắt vùng đỉnh tăng trưởng nhung hươu 1.2 Các tế bào STRO – 1+ vùng khác cuống [25] 2.2 Mẫu mô nhung hươu 14 2.3 Phần nhung hươu 19 3.1 Phần nhung hươu xử lý 28 3.2 Mẫu mô nhung hươu cắt thành mảnh nhỏ 28 3.3 Các mảnh mơ nhung hươu có kích thước – mm2 29 3.4 Các tế bào đơn thu nhận từ mô nhung hươu (X100 30 3.5 Tế bào nhung hươu sau 24 nuôi cấy (X40) 32 3.6 Tế bào nhung hươu sau 48 nuôi cấy (X40) 32 3.7 Tế bào nhung hươu sau 72 nuôi cấy (X40) 33 3.8 Tế bào nhung hươu sau ngày nuôi cấy (X40) 33 3.9 Tế bào nhung hươu sau ngày nuôi cấy (X40) 34 3.10 Tế bào nhung hươu sau 10 ngày nuôi cấy (X40) 34 IX Nghiệm thu đề tài Vườn ươm 3.11 Tế bào nhung hươu sau cấy chuyền (X100) 36 3.12 Tế bào nhung hươu sau cấy chuyền 24 (X40) 36 3.13 Tế bào nhung hươu sau cấy chuyền ngày (cấy chuyền 37 lần 1) (X40) 3.14 Tế bào nhung hươu qua lần cấy chuyền (X40) 37 3.15 Tế bào nhung hươu qua lần cấy chuyền (X40) 38 3.16 Tế bào nhung hươu qua lần cấy chuyền (X40) 38 3.17 Tế bào nhung hươu qua lần cấy chuyền (X100) 39 3.18 Các tế bào nhung hươu trước bắt đầu cảm ứng biệt hóa 43 (X40) 3.19 Các tế bào nhung hươu sau 15 ngày ni cấy mơi 44 trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200) 3.20 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy môi 44 trường biệt hóa thành tế bào tạo xương (X200) 3.21 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy môi 45 trường biệt hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc nhuộm Alizarin Red S (X40) 3.22 Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ tế bào chất sau 15 ngày nuôi cấy môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế X 47 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm (A) (B) (C) Hình 3.21 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy mơi trường biệt hóa thành tế bào tạo xương dương tính với thuốc nhuộm Alizarin Red S (X40) (A Đối chứng, B – C Thí nghiệm) Như vậy, mặt hình thái, đánh giá sơ tế bào nhung hươu biệt hóa thành tế bào tạo xương Các nghiên cứu như: nhuộm alkaline phosphatase, khảo sát diện marker phân tử tế bào xương (Osteocalcin, Osteopotin…) cần thực để chứng minh tế bào nhung hươu thực có khả biệt hóa thành tế bào xương 3.5.2.2 Kết biệt hóa thành tế bào tạo mỡ 45 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm Các tế bào nhung hươu cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ, tương tự cảm ứng thành tế bào tạo xương Theo dõi biến đổi trạng thái tế bào giai đoạn giờ, ngày, 15 ngày, 20 ngày sau biệt hóa  Ở giai đoạn sau cho môi trường cảm ứng biệt hóa vào: tế bào chưa có thay đổi  Sau ngày nuôi cấy môi trường biệt hóa: số tế bào chuyển từ dạng trải dài sang trải rộng  Sau 15 ngày nuôi cấy mơi trường biệt hóa biệt hóa: tế bào có thay đổi hình dạng, chuyển từ dạng trải dài sang dạng trải rộng có tạo thành giọt mỡ ti li tế bào chất  Sau 20 ngày biệt hóa: đa số tế bào chuyển qua dạng trải rộng Trong tế bào chất, giọt mỡ ti li kết hợp với thành giọt mỡ lớn Đây đặc điểm dùng để phân biệt tế bào nhung hươu biệt hóa thành tế bào tạo mỡ với tế bào nhung hươu khơng biệt hóa Các tế bào giọt mỡ quan sát dễ dàng kính hiển vi đảo ngược có độ phóng đại 200 lần Trong đó, tế bào mẫu đối chứng khơng có trải rộng hay tạo giọt mỡ mẫu biệt hóa Tiến hành nhuộm mẫu tế bào đối chứng mẫu tế bào biệt hóa với Oil Red O, quan sát kính hiển vi đảo ngược ghi nhận bắt màu mẫu nhuộm Các tế bào mẫu biệt hóa bắt màu đỏ, cịn tế bào mẫu đối chứng khơng bắt màu Điều chứng tỏ tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ nhỏ Trong nghiên cứu tiếp theo, marker phân tử tế bào mỡ PPARγ (peroxisome – proliferating activated receptor γ, C/EBPα (CCAAT enhancer binding protein α) khảo sát để làm rõ kết 46 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm (A) (B) Hình 3.22 Các tế bào nhung hươu tích tụ giọt mỡ tế bào chất sau 15 ngày nuôi cấy môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X100) (A Đối chứng, B Thí nghiệm) (A) (B) Hình 3.23 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X40) (A Đối chứng, B Thí nghiệm) 47 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm Hình 3.24 Các giọt mỡ tích tụ tế bào chất tế bào nhung hươu sau nuôi cấy môi trường cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo mỡ (X200) (A) (B) Hình 3.25 Các tế bào nhung hươu sau 20 ngày nuôi cấy mơi trường biệt hóa thành tế bào tạo mỡ dương tính với thuốc nhuộm Oil Red O (X40) (A Đối chứng, B Thí nghiệm) 48 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm B Tế bào Stro-1+ (X40) [25] A Tế bào AP (X200) [4] Hình 3.26 Tế bào nhung hươu thu nhận Berg cs [4] hay Rolf cs [25] Hình 3.27 Tế bào nhung hươu đề tài thu nhận (X200 X40) 49 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm (A) (X200) (B) (X200) Hình 3.28 Tế bào nhung hươu sau cảm ứng biệt hóa tạo xương đề tài (A) so với tế bào AP (B) Berg cs [4] (A) (X40) (B) (X40) 50 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm (C) (X100) (D) (X100) Hình 3.29 Tế bào nhung hươu sau cảm ứng biệt hóa tạo mỡ đề tài (A, C) so với tế bào Stro – 1+ (B, D) Rolf cs [25] (A) (X100) (B) (X100) 51 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm (C) (X100) (D) (X100) Hình 3.30 Tế bào nhung hươu đề tài (A, B) , tế bào AP (C) tế bào Stro – 1+ (D) sau cảm ứng biệt hóa tạo mỡ cho kết dương tính với nhuộm Oil Red O Do điều kiện hạn chế, xét nghiệm mặt sinh học phân tử chưa thực Tuy nhiên, dựa vào kết so sánh hình 2.26, 2.27, 2.28, 2.29, 2.30, tế bào nhung hươu mà đề tài thu nhận có kiểu hình tương đồng với tế bào nhung hươu có tính gốc thu nhận Berg cộng hay Rolf cộng sự, từ kiểu hình tế bào có tính gốc vừa thu nhận đến kiểu hình tế bào cảm ứng biệt hóa thành tế bào tạo xương hay tế bào tạo mỡ Bên cạnh đó, đề tài tế bào gốc nghiên cứu đối tượng hươu Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis), loài đặc hữu Việt Nam Kết đề tài tiền đề cho nghiên cứu sâu tế bào gốc nhung hươu Việt Nam, vai trò tế bào gốc chế tái sinh sừng hươu – chế thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học thuộc lĩnh vực y học phục hồi Tóm lại, theo kết khảo sát đề tài, bước đầu thấy tế bào nhung hươu thu nhận có khả tăng sinh dài hạn – khả tự làm – khả biệt hóa Xét kiểu hình, tế bào tương đồng với tế bào có tính gốc thu nhận Berg cộng hay Rolf cộng Đây sở 52 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm chứng minh nhung hươu Việt Nam chứa tế bào gốc Trong nghiên cứu tiếp theo, marker phân tử tế bào gốc nhung hươu STRO – 1, CD271, CD133 khảo sát để làm rõ kết luận 53 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết đạt được, bước đầu thấy rằng, đề tài thu nhận tế bào gốc từ mô nhung hươu Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis), với kết luận cụ thể sau: Thu nhận vả nuôi cấy in vitro thành công tế bào đơn từ vùng mô tăng trưởng nhung hươu Việt Nam (Cervus nippon pseudaxis) Các tế bào nhung hươu chọc lọc qua q trình ni cấy dài hạn bước đầu biểu đặc điểm tế bào gốc: Có khả tự làm (phân bào 90 lần thời gian 180 ngày ni cấy in vitro) Có khả biệt hóa thành dạng tế bào trung mô trưởng thành tế bào tạo xương hay tế bào tạo mỡ cảm ứng biệt hóa môi trường tương ứng Kết ban đầu cho thấy tế bào nhung hươu biểu đặc tính gốc có thời gian cần thiết hai lần phân bào 48 Tuy nhiên, nghiên cứu sâu cần thực để chứng minh cho nhận định 4.2 Đề nghị Do thời gian kinh phí nghiên cứu có hạn, đề tài dừng lại mức độ ghi nhận bước đầu nên chưa thỏa mãn minh chứng cuối cho diện tế bào gốc nhung hươu Việt Nam Trên sở kết này, đưa số đề xuất sau: Chọn lọc tế bào gốc từ nhung hươu Việt Nam thông qua biểu marker tế bào gốc STRO – 1, CD271, CD133 Xác định thời gian cần thiết hai lần phân bào tế bào gốc nhung hươu phương pháp đánh dấu huỳnh quang tế bào 54 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm Đánh giá khả tự làm tế bào gốc nhung hươu qua diện protein Nanog, Oct3/4, CrxOS, Sox2… Đánh giá khả biệt hóa tế bào gốc nhung hươu marker phân tử (các marker phân tử cho tế bào xương Osteocalcin, Osteopotin; marker phân tử cho tế bào mỡ PPARγ, C/EBPα) Khảo sát biểu hoạt chất sinh học proteoglycan, glycosaminoglycan… quần thể tế bào nhung hươu nuôi cấy in vitro… Đây mục tiêu mà chúng tơi hướng đến nghiên cứu 55 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm TÀI LIỆU THAM KHẢO Allen SP, Maden M, and Price JS (2002) A Role for Retinoic Acid in Regulating the Regeneration of Deer Antlers Developmental Biology 251, 409 – 423 Baksh D, Song L, Tuan RS (2004) Adult mesenchymal stem cells: Characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy J Cell Mol Med 8: 301 – 316 Barling PM, Liu H, Matich J, Mount J, Lai AKW, Ma L, Nicholson LFB (2004) Expression of PTHrP and the PTH/PTHrP receptor in growing red deer antler, Cell Biology International 28: 661 – 673 Berg DK, Li C, Asher G, Wells DN, Oback B (2007) Red Deer Cloned from Antler Stem Cells and Their Differentiated Progeny, Biology of Reproduction, 77, 3: 384 – 394 Bruder SP, Jaiswal N, and Haynesworth SE (1997) Growth kinetics, selfrenewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation J Cell Biochem 64, 278 – 294 Cegielski M, Calkosinski I, Dziegiel P, Gebarowski T, Podhorska – Okolow M (2006) Search for stem cells in the growing antler stag (Cervus elaphus), Bulletin Vet Inst Pulawy 50: 247 – 251 Dennis JE, Carbillet J-P, Caplan AI, Chen D (2002) The STRO-1+ marrow cell population is multipotential Cells Tissues Organs 170: 73 – 82 Goss RJ (1983) Deer antlers: Regeneration, function, and evolution, New York: Academic Press Graves SE, Francis MJO, Gundle R, and Beresoford JN (1994) Primary culture of human trabecular bone: Effects of L-ascorate-2-phosphate Bone 15, 132 – 133 56 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm 10 Hemmings SJ, Song X (2004) The effects of elk velvet antler consumption on the rat: development, behavior, toxicity and the activity of liver gglutamyltranspeptidase, Comparative Biochemistry and Physiology, Part C 138: 105 – 112 11 Jaiswal N, Haynesworth SE, Caplan AI, and Bruder SP (1997) Osteogenic differentiation of purified, culture expanded human mesenchymal stem cells in vitro J Cell Biochem 64, 295 – 312 12 Janderova L, McNeil M, Murrell AN, Mynatt RL, and Smith SR (2003) Humanmesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis Obes Res 11, 65 – 74 13 Jeon B, Kim S, Lee S, Park P, Sung S, Kim J, Moon S (2009) Effect of antler growth period on the chemical composition of velvet antler in sika deer (Cervus nippon), Mammalian Biology, 74, 5: 374 – 380 14 Jones EA, Kinsey SE, English A, Jones RA, Straszynski L, et al (2002) Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells, Arthritis Rheum 46: 3349 – 3360 15 Kierdorf U, Kierdorf H (2004) Bone formation in antlers pp 55 – 63 16 Kierdorf U, Kierdorf H, Szuwart T (2007) Deer Antler Regeneration: Cells, Concepts, and Controversies, Journal of Morphology, 268, 8: 726 – 738 17 Kim HS, Lim HK, Park WK (1999) Antinarcotic effects of the velvet antler water extract on morphine in mice, Journal of Ethnopharmacology 66: 41 – 49 18 Landete – Castillejos T, Estevez JA, Martínez A, Ceacero F, Garcia A, Gallego L (2007) Does chemical composition of antler bone reflect the physiological effort made to grow it? Bone 40: 1095 – 1102 19 Li C, Clark DW, Lord EA, Stanton JL, Suttie JM (2002) Sampling technique to discriminate the different tissue layers of growing antler tips for gene discovery, The Anatomical Record 268: 125 – 130 57 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm 20 Li YJ, Kim TH, Kwak HB, Lee ZH, Lee SY, Jhon GJ (2007) Chloroform extract of deer antler inhibits osteoclast differentiation and bone resorption, Journal of Ethnopharmacology 113: 191 – 198 21 Min J, Lee YJ, Kim YA, Park HS, Han SY, Jhon GJ, Choi W (2001) Lysophosphatidylcholine derived from deer antler extract suppresses hyphal transition in Candida albicans through MAP kinase pathway, Biochimica et Biophysica Acta 1531: 77 – 89 22 Nakamura T, Shiojima S, Hirai Y, Iwama T, Tsuruzoe N, Hirasawa A,Katsuma S,and Tsujimoto G (2003) Temporal gene expression changes during adipogenesis in human mesenchymal stem cells Biochem Biophys Res Commun 303, 306 – 312 23 Napp J, Wiese KG, Kierdorf U, Kierdorf H, Seymour N, et al (2006) Stem cells isolated from the regenerating antler express key markers of the osteogenic lineage, In: Bartos L, Dusek A, Kotrba R, Bartosova´-Vichova´ J, eds Advances in Deer Biology: Deer in a changing world Research Institute of Animal Production: Prague 162 p 24 Price JS, Faucheux C, Allen S (2005) Deer antlers as a model of mammalian regeneration, Curr Top Dev Biol 67: – 48 25 Rolf HJ, Wiese KG, Siggelkow H, Schliephake H, Bubenik GA (2006) In vitro studies with antler bone cells: Structure forming capacity, osteocalcin production and influence of sex steroids, Osteology 15: 245 – 257 26 Rosen ED, and Spiegelman BM (2000) Molecular regulation of adipogenesis Annu Rev Cell Dev Biol 16, 145 – 171 27 Sunwoo HH, Nakano T, Sim JS (1998) Isolation and characterization of proteoglycans from growing antlers of wapiti (Cervus elaphus), Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 121: 437 – 442 58 Nghiệm thu đề tài Vườn ươm 28 Sunwoo HH, Sim JS (2000) Potential uses of velvet antler as nutraceuticals, functional and medical foods in the West, Journal of Nutraceuticals, Functional & Medical Foods, 2:3: – 23 29 Tuckwell C (2003) Velvet Antler - Summary of the literature on health benefits, Rural Industries Research and Development Corporation 30 Zhou R, Li S (2009) In vitro antioxidant analysis and characterisation of antler velvet extract, Food Chemistry 114: 1321 – 1327 59