Nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu quả mỹ phẩm từ tế bào gốc dây rốn công ty cp hóa dược phẩm mekophar

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MỸ PHẨM TỪ TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN MÃ SỐ: 188-2010 Đồng Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS.BS Lê Văn Đông TS Phạm Văn Phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 06 NĂM 2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Tên đề tài: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MỸ PHẨM TỪ TẾ BÀO GỐC DÂY RỐN MÃ SỐ: 188-2010 ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: PGS.TS.BS Lê Văn Đông TS Phạm Văn Phúc CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ PHĨ TỔNG GIÁM ĐỐC DS Đặng Thị Kim Lan THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 06 NĂM 2016 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục tiêu: Đề tài “Nghiên cứu chế tạo đánh giá hiệu mỹ phẩm từ tế bào gốc dây rốn” có mục tiêu chế tạo mỹ phẩm chăm sóc da từ dịch chiết tế bào gốc mô dây rốn Nội dung phƣơng pháp: Nhóm nghiên cứu tiến hành chế tạo loại dịch chiết tế bào gốc (TBG) mô dây rốn trẻ sơ sinh sau nghiên cứu tác dụng in vitro loại dịch chiết nhƣ công thức phối trộn loại dịch chiết lên tế bào da ngƣời tìm cơng thức tối ƣu khả thi cho mỹ phẩm có tác dụng chống lão hóa trắng da Tiếp theo, tiến hành bào chế, tiêu chuẩn hoá đánh giá độ an toàn mỹ phẩm chứa dịch chiết TBG mô dây rốn theo công thức tối ƣu đƣợc lựa chọn từ thử nghiệm in vitro Cuối đánh giá tác dụng mỹ phẩm tạo ngƣời tình nguyện bơi mỹ phẩm lên da mặt thông qua test lẩy da, khảo sát thay đổi tiêu xét nghiệm hóa sinh huyết học sau sử dụng tiêu phân tích da toàn trƣớc, sau sử dụng mỹ phẩm nghiên cứu để bƣớc đầu đánh giá tính an tồn tác dụng chống lão hóa sáng da sản phẩm Kết quả: Đề tài chế tạo đánh giá đƣợc loại dịch chiết TBG mô dây rốn trẻ sơ sinh, bao gồm: dịch chiết số loại TBG tinh khiết đƣợc tách chiết từ dây rốn; dịch chiết ngoại bào mô dây rốn; dịch chiết nội bào tế bào tổng số dây rốn theo qui trình khơng sử dụng enzyme nhƣ dung môi hữu Khảo sát tác dụng in vitro lên tế bào da ngƣời nuôi cấy thấy công thức 3-5 chứa dịch chiết ngoại bào mô dây rốn dịch chiết tế bào tổng số, có TBG, dây rốn tốt cho sản phẩm chống lão hóa da có tác dụng kích thích tăng sinh nguyên bào sợi tế bào sừng da ngƣời; tăng khả sinh tổng hợp giảm phân hủy collagen Tuy nhiên công thức không làm giảm khả sinh sắc tố melanine tế bào sắc tố Từ kết bào chế gel mỹ phẩm với tên gọi “Celvaron Gel MKP” từ dịch chiết TBG mô dây rốn theo công thức tối ƣu 3-5 bổ sung alpha-arbutin hƣớng tới tác dụng chống lão hóa làm trắng da Sản phẩm đựng tuýp nhựa 1ml đậy nắp kín sử dụng lần Đánh giá tác dụng mỹ phẩm ngƣời tình nguyện gồm 70 phụ nữ tuổi từ 30-60 tình nguyện bôi lần vào buổi tối lên da mặt tháng liên tục sản phẩm Celvaron Gel MKP cho thấy không gây phản ứng mẫn da 12/12 ngƣời (100%) đƣợc i kiểm tra test lẩy da; khơng làm thay đổi số hóa sinh huyết học 70/70 (100%) Phân tích vùng da mặt trƣớc sau bôi sản phẩm “Celvaron Gel MKP” tháng hệ thống phân tích da VISIA (Mỹ) 58 phụ nữ tuổi từ 30-50 bƣớc đầu cho thấy, sản phẩm có tác dụng số phân tích da theo hƣớng làm sáng da chống lão hóa da, đặc biệt số đốm nâu (brown spots), vùng đỏ da (red area) có cải thiện rõ rệt sau sử dụng tuần Tuy nhiên, sản phẩm chứa protein có nguồn gốc từ ngƣời không đƣợc phép sử dụng dƣới dạng mỹ phẩm, đề tài kiến nghị đƣợc nghiên cứu phát triển thành sản phẩm thuốc hỗ trợ điều trị tổn thƣơng da ii SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Aims: Research project “Development and evaluation the effectiveness of umbilical cord stem cell cosmetic” aimed to develop a skincare cosmetic from umbilical cord tissue and stem cell extracts Contents and methods: Extracts from umbilical cord tissue and umbilical cord stem cells were produced and evaluated in vitro for their effects separately or in combination of human skin cells to find out optimum combinations and feasible to make a product with whitening and anti-aging effects Next, preparation, standardization and evaluation of the newly produced cosmetic based on optimum in vitro data were conducted Finally, the product was tested on volunteered human subjects for initial evaluation of safety and whitening and antiaging effects with skin prick test, total biochemical and hematological tests Results: Three extraction preparations from umbilical cord were made: homogenous stem cell extracts, extra cellular extract, total cellular extract without using enzyme and organic solvent The in vitro test on human skin cell cultures showed that formula 3.5 containing extra cellular extract, total cellular extract was optimum for anti-aging effect as it stimulated proliferation of human fibroblasts and keratinocytes; increased collagen production and decreased collagen degradation However, this formula did not decrease melanine production of melanocytes Therefore, the cosmetic namely “Celvaron Gel MKP” was made based on formula 3.5 supplemented with alpha-arbutin for the combination effect of both anti-aging and whitening The product was packed in 1mL plastic vials for single usage The cosmetic was tested on 70 women subjects aged between 30 and 60 years old who applied Celvaron Gel MKP on their faces daily in the evening for two months No skin hypersensitivity reaction was found on 12 people tested No change in biochemistry or hematology test was observed in all 70 subjects Facial skin analyzed with VISIA system among 58 women aged 30 to 50 years old indicated some significant improvements in brown spots, red area indexes after weeks of using the research cosmetic However, since the product contains human proteins that are not appropriate to use as cosmetic, we suggest develop it into a product that can support the treatment of skin lesions iii MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i SUMMARY OF RESEARCH CONTENT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi THÔNG TIN CHUNG VỀ ĐỀ TÀI ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng – Tổng quan 10 1.1 Tình hình nghiên cứu phát triển mỹ phẩm tế bào gốc 10 1.1.1 Mỹ phẩm tế bào gốc .10 1.1.2 Ứng dụng tế bào gốc vào mỹ phẩm 10 1.2 Nhu cầu chế tạo mỹ phẩm tế bào gốc 11 1.3 Cơ sở khoa học cho nghiên cứu mỹ phẩm tế bào gốc dây rốn 12 1.3.1 Tác động lên nguyên bào sợi 12 1.3.2 Tác động lên tế bào sừng tế bào sắc tố .14 1.3.3 Dây rốn – nguồn nguyên liệu cho mĩ phẩm .16 Chƣơng – Vật liệu, đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu .18 2.1 Vật liệu .18 2.1.1 Nguồn mô cung cấp tế bào da tế bào gốc 18 2.1.2 Hóa chất 19 2.1.3 Dụng cụ 20 2.1.4 Thiết bị .21 iv 2.2 Đối tượng nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Nuôi cấy mô sơ cấp tế bào da ngƣời 21 2.3.2 Phƣơng pháp đo tăng trƣởng tế bào – phƣơng pháp MTT 23 2.3.3 Phƣơng pháp Realtime RT-PCR 24 2.3.4 Phƣơng pháp chế tạo dịch chiết tế bào gốc dây rốn 26 2.3.5 Phƣơng pháp tiêu chuẩn hoá nguyên liệu dịch chiết dây rốn 27 2.3.6 Phƣơng pháp tách tế bào gốc từ dây rốn 27 2.3.7 Xác định marker bề mặt tế bào kĩ thuật flow cytometry 28 2.3.8 Phƣơng pháp chế tạo đánh giá độ ổn định sản phẩm 29 2.3.9 Phƣơng pháp khảo sát độ ổn định 38 2.3.10 Phƣơng pháp đánh giá tính an tồn hiệu mỹ phẩm nghiên cứu ngƣời tình nguyện .44 2.3.11 Xử lý số liệu 48 Chƣơng – Kết bàn luận 49 3.1 Thu thập, phân loại, chế tạo chế phẩm ứng viên từ dây rốn 49 3.1.1 Thu thập phân loại dây rốn 49 3.1.2 Chế tạo dịch chiết nội bào ngoại bào dây rốn 49 3.1.3 Phân tách chế tạo dịch chiết tế bào gốc dây rốn 49 3.1.4 Chế tạo 25 công thức sản phẩm .50 3.2 Đánh giá tác động in vitro chế phẩm mơ hình tế bào người 51 3.2.1 Thu nhận, nuôi cấy loại tế bào da 51 3.2.2 Tác động công thức chế phẩm lên tăng sinh biểu gen nguyên bào sợi 54 3.2.3 Tác động công thức lên tăng sinh tế bào sừng 59 v 3.2.4 Tác động công thức 3-5 lên tổng hợp melanin .61 3.3 Chế tạo sản phẩm đánh giá độ ổn định sản phẩm 66 3.3.1 Chuẩn hoá nguyên liệu trƣớc bào chế .66 3.3.2 Kết chế tạo sản phẩm đánh giá tiêu chuẩn chất lƣợng sản phẩm 69 3.3.3 Kết đánh giá độ ổn định sản phẩm 72 3.4 Đánh giá tính an tồn hiệu sản phẩm người tình nguyện 81 3.4.1 Tác dụng mẫn da .81 3.4.2 Ảnh hƣởng lên số xét nghiệm huyết học .81 3.4.3 Ảnh hƣởng lên số xét nghiệm hóa sinh .82 3.4.4 Ảnh hƣởng sản phẩm lên số phân tích da ngƣời tình nguyện83 3.4.4 Phản hồi ngƣời tình nguyện sử dụng sản phẩm 84 Kết luận .85 Kiến nghị 86 Tài liệu tham khảo 87 vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ cDNA complementary DNA DĐVN IV Dƣợc điển Việt Nam IV DEPC Diethyl pyrocarbonate DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 EGF Epidermal growth factor ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FACS Fluorescence-activated cell sorting FGF Fibroblast growth factor IGF Insulin-like growth factor LC-MS Liquid chromatography–mass spectrometry MMP Matrix metalloproteinases MPTBG Mỹ phẩm tế bào gốc MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide NBS Nguyên bào sợi PBS Phosphate buffered saline PRP Platelet rich plasma RNA Ribonucleic acid vii RT – PCR Reverse transcription polymerase chain reaction TBG Tế bào gốc TCCS Tiêu chuẩn sở TGF Transforming growth factor UV Ultraviolet VEGF Vascular endothelial growth factor viii 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146