Nghiên cứu môi trường nuôi cấy tạo quả thể nấm nhộng trùng thảo cordycepsmilitaris

UBND TP HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ -ooo0ooo - BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) Tên nhiệm vụ NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẠO QUẢ THỂ NẤM NHỘNG TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) CHỦ NHIỆM: KS NGUYỄN THỊ NGỌC SƯƠNG – CN TRẦN MINH MẪN TP HỒ CHÍ MINH,2015 TĨM TẮT Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) loài nấm túi Đây loài nấm dƣợc liệu quý Nhộng trùng thảo tự nhiên có sản lƣợng thấp giá thành cao Nó đƣợc nghiên cứu nuôi trồng in vitro để tạo nguồn cung cấp dƣợc liệu dồi ổn định Trong nghiên cứu này, thí nghiệm tuyển chọn giống thích hợp cho việc nuôi trồng tạo stroma đƣợc thực với chủng C militaris thu đƣợc kết chủng C militaris CM3 có tốc độ lan tơ cao Khuẩn lạc Nhộng trùng thảo có màu trắng, tơ mịn xốp, dạng bậc thang đặn Chủng C militaris CM3 đƣợc khảo sát điều kiện nhân giống cấp II môi trƣờng lỏng Giống cấp II đƣợc nuôi cấy tĩnh môi trƣờng PDB ngày nhiệt độ 25oC đƣợc chọn cho việc nuôi trồng stroma C militaris Mơi trƣờng M9 có thành phần gồm gạo lức 60 g, nhộng tằm 10 g, nƣớc cất 90 mL, CaCl2 0,1 g/L, folic acid µg/L mơi trƣờng ni trồng tốt mơi trƣờng thí nghiệm Trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô số lƣợng stroma thu đƣợc mơi trƣờng M9 có kết lần lƣợt 19,54 g/bình, 3,8404 g/bình, 70,3 g/bình Hàm lƣợng số hoạt chất có stroma adenosine (2,0027 mg/g), cordycepin (7,7551 mg/g), polysaccharide (166,20 mg/g), ergosterol (1,7369 mg/g) Trang i BM20-QT.QLKH MỤC LỤC Trang TÓM TẮT………………………………………………………………………… i MỤC LỤC………………………………………………………………………… ii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………….… iv DANH SÁCH BẢNG, ĐỒ THỊ…………………………………………………… v DANH SÁCH HÌNH…………………………………………………………… vi THÔNG TIN ĐỀ TÀI…………………………………………………………… vii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN…………………………………………………………2 1.1 Giới thiệu Cordyceps militaris……………………………………………… 1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris……………………………………………… 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Cordyceps militaris………………………………… 1.2 Một số hoạt chất sinh học Cordyceps……………………………………… 1.2.1 Nucleotides………………………………………………………………… 1.2.2 Sterol……………………………………………………………………… 1.2.3 Protein amino acid………………………………………………… 1.2.4 Acid béo…………………………………………………………………… 1.2.5 Polysaccharide…………………………………………………………… 1.3 Một số tác dụng dƣợc lý nấm Cordyceps………………………………… 1.3.1 Hiệu chống ung thƣ…………………………………………………… 1.3.2 Tác động điều hòa miễn dịch……………………………………………… 1.3.3 Tác động bảo vệ gan……………………………………………………… 1.3.4 Tác động bảo vệ thận……………………………………………………… 1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến tạo thành stroma C Militaris………………… 1.4.1 Nhu cầu dinh dƣỡng cho hình thành phát triển stroma……………… 1.4.2 Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng…………………………………… 1.5 Nuôi trồng Cordyceps militaris………………………………………………… CHƢƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………… 14 2.1 Nội dung 1: Tuyển chọn chủng Cordyceps militaris thích hợp để ni trồng stroma in vitro…………………………………………………………………… 14 Trang ii BM20-QT.QLKH 2.1.1 Vật liệu:…………………………………………………………………… 14 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu: Chủng C militaris…………………………………… 14 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu:……………………………………… 14 2.1.4 Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………… 14 2.1.5 Chỉ tiêu phƣơng pháp theo dõi………………………………………… 15 2.2 Nội dung 2: Khảo sát điều kiện nhân giống C militaris cấp II………… 15 2.2.1 Vật liệu…………………………………………………………………… 15 2.2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu:……………………………………… 15 2.2.3 Phƣơng pháp thí nghiệm 15 2.2.4 Chỉ tiêu phƣơng pháp theo dõi………………………………………… 16 2.3 Nội dung 3: Khảo sát môi trƣờng tạo stroma C militaris………………… 16 2.3.1 Vật liệu:…………………………………………………………………… 16 2.3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu: ……………………………………… 16 2.3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm………………………………………………… 17 2.3.4 Chỉ tiêu phƣơng pháp theo dõi………………………………………… 18 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………… 20 3.1 Tuyển chọn chủng C militaris thích hợp để ni trồng stroma in vitro…20 3.2 Điều kiện nhân giống cấp II Cordyceps militaris…………………………… 22 3.3 Môi trƣờng tạo stroma Cordyceps militaris………………………………… 23 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………… 30 4.1 Kết luận…………………………………………………………………… 30 4.2 Kiến nghị………………………………………………………………… 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………… 31 PHỤ LỤC Trang iii BM20-QT.QLKH DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ tiếng viết C militaris Cordyceps militaris Ctv Cộng tác viên ĐC Đối chứng PDA Potato dextrose agar PDB Potato dextrose broth Trang iv BM20-QT.QLKH DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1 Tựa bảng Trang Sự sinh trƣởng C militaris môi trƣờng thạch đĩa 20 PDA theo thời gian Ảnh hƣởng điều kiện nhân giống cấp II đến thời gian tơ 3.2 22 phủ kín mơi trƣờng tạo stroma Ảnh hƣởng số môi trƣờng đến tạo thành stroma 3.3 24 Nhộng trùng thảo (C militaris) Hàm lƣợng số hoạt chất sinh học có stroma môi 3.4 trƣờng nuôi trồng Nhộng trùng thảo (C militaris) 28 Một số tiêu hóa học môi trƣờng trƣớc sau nuôi 3.5 29 trồng Nhộng trùng thảo (C militaris) Trang v BM20-QT.QLKH DANH SÁCH HÌNH Tựa hình Hình Trang 3.0 Sơ đồ quy trình thực 19 3.1 Khuẩn lạc chủng nấm C militaris 21 3.2 Hình thái khuẩn lạc Corydyceps sau 20 ngày ni ủ 21 3.3 Bình nhân giống C militaris cấp II 23 3.4 Tơ nấm mọc lan môi trƣờng gạo 23 3.5 Tơ nấm C militaris phát triển mơi trƣờng gạo 24 3.6 Mầm stroma hình thành mơi trƣờng gạo 24 3.7 Stroma hình thành mơi trƣờng M2 21 3.8 Stroma hình thành mơi trƣờng M8 25 3.9 Stroma hình thành mơi trƣờng M9 26 3.10 Stroma hình thành mơi trƣờng đối chứng 26 3.11 Stroma C militaris bị tơ nấm bao phủ 26 3.12 Stroma C militaris khô thu đƣợc từ thí nghiệm 27 3.13 Stroma C militaris khơ thị trƣờng 27 Trang vi BM20-QT.QLKH THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy tạo thể nấm Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) Chủ nhiệm đề tài/dự án: Nguyễn Thị Ngọc Sƣơng, Trần Minh Mẫn Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Thời gian thực hiện: 03/2015 – 12/2015 Kinh phí đƣợc duyệt: 181.345.000 đồng Mục tiêu: - Tuyển chọn giống Cordyceps militaris thích hợp cho việc tạo stroma in vitro - Xác định điều kiện nhân giống cấp II C militaris - Xác định môi trƣờng tạo stroma nấm C militaris Nội dung đề tài: Nội dung 1: Tuyển chọn chủng Cordyceps militaris thích hợp để ni trồng thể in vitro Nội dung 2: Khảo sát điều kiện nhân giống C militaris cấp II Nội dung 3: Khảo sát môi trƣờng tạo thể C militaris Sản phẩm đề tài /dự án: Stroma C militaris Trang vii BM20-QT.QLKH MỞ ĐẦU Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris) thuộc chi Cordyceps dạng nấm ký sinh trùng lồi nấm dƣợc liệu q Nhiều nghiên cứu lâm sàng chứng minh Nhộng trùng thảo có khả phục hồi sức khỏe, tăng cƣờng dẻo dai bắp, kích thích tinh thần hƣng phấn, bảo vệ tim mạch, tăng cƣờng lƣu thông máu thể, bảo vệ gan, bảo vệ thận, hạ đƣờng huyết, tăng cƣờng miễn dịch cho thể, chống viêm nhiễm, tăng cƣờng chức sinh lý, hỗ trợ điều trị ung thƣ,… Với công dụng tốt sức khỏe ngƣời, Nhộng trùng thảo đƣợc nhiều ngƣời tin dùng Tuy nhiên Nhộng trùng thảo có nguồn gốc tự nhiên hiếm, giá thành cao nhu cầu ngƣời Nhộng trùng thảo ngày tăng Vì cần có nguồn cung cấp Nhộng trùng thảo số lƣợng lớn với chất lƣợng cao để phục vụ cho nhu cầu cải thiện sức khỏe ngƣời Để đáp ứng yêu cầu cần có mơ hình cơng nghệ sản xuất stroma in vitro nguồn chất sẵn có, dễ tìm, giá thành thấp Do đề tài “Nghiên cứu mơi trƣờng ni cấy tạo thể nấm Nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris)” đƣợc thực nhằm xác định đƣợc môi trƣờng nuôi trồng Nhộng trùng thảo Từ ứng dụng vào cơng nghệ sản xuất tạo lƣợng lớn stroma Nhộng trùng thảo thời gian ngắn với chi phí thấp nhƣng chất lƣợng cao Trang BM20-QT.QLKH CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Cordyceps militaris 1.1.1 Phân loại nấm Cordyceps militaris Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipitaceae Chi: Cordyceps Loài: Cordyceps militaris Chi nấm Cordyceps thuộc ngành nấm túi, loại nấm ký sinh côn trùng số động vật chân khớp [25] Cordyceps đƣợc thu mẫu miêu tả 400 loài khác vùng khác giới Trong có nhiều lồi đƣợc ý nhiều đến dƣợc lý dùng làm thuốc chữa bệnh với lồi Cordyceps sinensis Cordyceps militaris 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Cordyceps militaris Loài nấm Cordyceps militaris phân bố rộng rãi độ cao từ đến 2000m so với mực nƣớc biển [44] Loài thƣờng đƣợc biết đến loài nấm màu cam ký sinh sâu bƣớm Cordyceps militaris đƣợc nghiên cứu nhiều nhƣ nguồn thay cho C sinensis thành phần hóa học dƣợc tính chúng tƣơng tự [44] Quả thể C sinensis C militaris có giá trị có chứa chất chuyển hóa khác với sợi nấm sinh dƣỡng Cordyceps militaris loài đƣợc biết đến nhiều chi Cordyceps [44] Sự đa dạng hình thái ký chủ giúp cho C militaris có mặt nhiều vùng địa lý vùng sinh thái khác giới [25], (Mains, 1958; Sung Spatafora, 2004) Các ký chủ phổ biến tự nhiên bao gồm ấu trùng nhộng cánh vẩy, ký chủ gặp khác côn trùng cánh cứng, cánh màng hai cánh Trang BM20-QT.QLKH The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.201656 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 0.8972 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CHUNG A 29.0967 CM3 B 26.2933 CM1 C 23.2500 CM2 Phụ lục 2: Kết xử lý số liệu nội dung 1: Đƣờng kính khuẩn lạc chủng C militaris vào ngày thứ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels CHUNG Values CM QT TG Number of Observations Read Number of Observations Used The ANOVA Procedure Dependent Variable: SI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 85.34835556 42.67417778 546.95 F CHUNG 85.34835556 42.67417778 546.95 F Model 78.29868889 39.14934444 49.25 0.0002 Error 4.76953333 0.79492222 Corrected Total 83.06822222 R-Square Coeff Var Root MSE SI Mean 0.942583 1.624771 0.891584 54.87444 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F CHUNG 78.29868889 39.14934444 49.25 0.0002 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.794922 Critical Value of t 2.44691 Least Significant Difference 1.7813 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N CHUNG A 57.1067 CM1 A 56.8100 CM3 B 50.7067 CM2 A Phụ lục 4: Kết xử lý số liệu nội dung 1: Đƣờng kính khuẩn lạc chủng C militaris vào ngày thứ 14 Class Level Information Class Levels CHUNG Values CM QT TG Number of Observations Read Number of Observations Used The ANOVA Procedure Dependent Variable: SI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 39.57980000 19.78990000 98.12 F CHUNG 39.57980000 19.78990000 98.12 F Model 0.05132976 0.01710992 8.27 0.0078 Error 0.01654248 0.00206781 11 0.06787224 Corrected Total Source DK R-Square Coeff Var Root MSE SI Mean 0.756270 3.778388 0.045473 1.203508 DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F 0.05132976 0.01710992 8.27 0.0078 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SI NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom Error Mean Square 0.002068 Critical Value of t 2.30600 Least Significant Difference 0.0856 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N DK A 1.31529 N1 B 1.18142 N4 1.16584 N2 1.15147 N3 B B B B Phụ lục 6: Kết xử lý số liệu tiêu trọng lƣợng tƣơi stroma - nội dung 3: Nghiên cứu môi trƣờng tạo stroma C militaris The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MT M2 M8 M9 Number of Observations Read Number of Observations Used The ANOVA Procedure Dependent Variable: SI Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 108.0480382 54.0240191 365.39 F 108.0480382 54.0240191 365.39 F Model 4.99606273 2.49803136 112.90 F 4.99606273 2.49803136 112.90 F Model 7483.262222 3741.631111 250.11 F 7483.262222 3741.631111 250.11