Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink

Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối monascus giàu monacolink

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP.HCM CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 18/06/2013) NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH KHỐI MONASCUS GIÀU MONACOLIN K Thủ trưởng Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên chữ ký) (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng xét duyệt SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 18/06/2013) NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH KHỐI MONASCUS GIÀU MONACOLIN K Thủ trưởng Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên chữ ký) (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng xét duyệt BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối Monascus giàu Monacolin K” Chủ nhiệm đề tài: Vũ Thanh Thảo Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Thời gian thực đề tài: 12/2010 – 12/2011 Kinh phí duyệt: 80.000.0000 Kinh phí cấp: theo TB số : TB-SKHCN ngày / / Mục tiêu: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy Monascus giàu Monacolin K citrinin thấp Nội dung: (Theo đề cương duyệt hợp đồng ký Công việc dự kiến Công việc thực Định danh nấm Monascus Chủng nấm Monascus định danh Monascus purpureus Khảo sát điều kiện tối ưu sinh Phương pháp o rắn: độ ẩm 65% o nuôi cấy 30 C/ ngày 26 C/14 monacolin K ngày Phương pháp lỏng: nuôi 30oC/ 14 ngày) pH Phương pháp chiết tách xác định Tách chiết citrinin với acetonitril iso octan hàm lượng, citrinin Xác định citrinin HPLC với hệ dung môi acetonitril: nước: TFA (0.5%) với tỉ lệ 58: 32: 10 Tối ưu hóa mơi trường ni cấy rắn Mơi trường tối ưu : chất gạo bổ sung thêm ethanol 0,3%; nấm Monascus sinh Monacolin K NH Cl 0,5%; glycerol 0,5%; NaCl 0,1% Hàm lượng: Monacolin K 2,982 mg/g, citrinin 8,04 μg/g Tối ưu hóa mơi trường nuôi cấy lỏng Phương pháp lỏng: môi trường chất gạo 3% bổ sung ethanol nấm Monascus sinh Monacolin K 0,21%; NH Cl 0,13%; KH PO 0,03%; MgSO 0,02% Hàm lượng: Monacolin K 215,31 mg/l, citrinin 0,42 ppm Khảo sát độ ổn định monacolin K Hàm lượng monacolin K ổn định tháng i BẢNG KÊ QUYẾT TỐN KINH PHÍ ĐỢT Tên chủ nhiệm đề tài: Vũ Thanh Thảo Tên đề tài: Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy sinh khối Monascus giàu Monacolin K STT NGÀY 24/01/2011 NỘI DUNG Th khốn chun mơn Định danh nấm Monascus SỐ TIỀN 36.500.000 5.000.000 Khảo sát điều kiện tối ưu sinh 14/02/2011 monacolin K Phương pháp chiết tách xác 1/3/2011 định hàm lượng citrinin Tối ưu hóa mơi trường ni cấy rắn nấm Monascus sinh 2/3/2011 Monacolin K giảm citrinin Tối ưu hóa mơi trường nuôi cấy lỏng nấm Monascus sinh 15/02/2011 Monacolin K giảm citrinin Khảo sát độ ổn định monacolin K 25/01/2011 6.000.000 6.000.000 Đvt: đồng GHI CHÚ HĐTK HĐTK Trần Thị Thanh Thảo HĐTK Huỳnh Bái Nhi HĐTK Lê Minh Trí 6.000.000 HĐTK Lê Minh Trí 7.500.000 HĐTK Huỳnh Bái Nhi HĐTK Trần 6.000.000 Thị Thanh Thảo 20.036.797 HĐTC 10/3/2011 Nguyên, nhiên vật liệu Hóa chất Acetonitrile isooctane 12/3/2011 Hóa chất mơi trường 8.339.399 164353 10/3/2011 Dụng cụ ( ống ly tâm + phin lọc) 5.870.801 164286 10 10/3/2011 Bình hút ẩm đo nấm 4.125.599 164287 VPP 1.700.998 164250 465.000 11 21/2/2011 In ấn tài liệu 99.000 HĐ bán lẻ 12 19/2/2011 Photo tài liệu 80.000 HĐ bán lẻ 13 17/2/2011 Giấy A4 98.000 HĐ bán lẻ 14 15/1/2011 In ấn tài liệu 98.000 HĐ bán lẻ ii Photo tài liệu 15 14/1/2011 16 Chi phí quản lý xét duyệt 30/11/2010 Chi phí xét duyệt 15/03/2010 Quản lý phí quan quản lý 17 Tổng cộng 90.000 HĐ bán lẻ 3.250.000 1.500.000 61.751.797 iii TÓM TẮT ĐỀ TÀI/ DỰ ÁN NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY SINH KHỐI MONASCUS GIÀU MONACOLIN K Monascus pupurues sinh tổng hợp monacolin K, hay gọi lovastatin Đây hoạt chất có tác dụng làm giảm cholesterol thơng qua việc ức chế enzym hydroxymethylglutaryl coenzym A (HMG-CoA) reductase Đã có nhiều nghiên cứu thực theo phương pháp lên men rắn nhằm thu hàm lượng monacolin K cao nghiên cứu ni cấy chìm cịn hạn chế Trong nghiên cứu tập trung vào khảo sát điều kiện ni cấy rắn ni cấy chìm Monascus pupureus nhằm thu nhận sinh khối giàu Monacolin K Kết cho thấy, môi trường lên men rắn, môi trường tối ưu cho nấm sinh monacolin K cao mơi trường có chất gạo, bổ sung thêm ethanol 0,3%, NH Cl 0,5%, glycerol 0,5% NaCl 0,1%, với lượng monacolin K 2,982 mg/g Đối với ni cấy chìm, gạo trắng với nồng độ 3% thích hợp Monascus purpureus sinh monacolin K Kết khảo sát chất bổ sung môi trường gạo 3% theo phương pháp đáp ứng bề mặt cho thấy thêm ethanol 0,3%, NH Cl 0,19%, KH PO 0,05%, MgSO 7H O 0,03% cho kết hàm lượng monacolin K tạo cao 214,85 mg/l iv SUMMARY OF RESEARCH CONTENT STUDY ON FERMENTATION CONDITIONS FOR MONACOLIN K RICH BIOMASS PRODUCTION BY MONASCUS Monascus can produce monacolin K, which is identical to lovastatin, a cholesterollowering drug Many studies have investigated the solid state growth conditions of this yeast but few have focused on submerged conditions This study focused on optimizing the condition of cultivating M purpureus to produce monacolin K-rich biomass under submerged and solid state fermentation In solid state fermentation, the optimum culture medium is rice with the addition of 0.3% ethanol, 0.5% NH Cl, 0.5% glycerol and 0.1% NaCl, and the maximum monacolin yield was 2,982 mg/l In liquid medium, 3% white rice extraction were the most suitable base subtrate for production of monacolin K The response surface methodology results indicated that the maximum monacolin K production predicted by the quadratic model was 215,31 mg/l using base substrate supplemented with 0.3% ethanol, 0.19% NH Cl, 0.05% KH PO , 0.03% MgSO v MỤC LỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ iv v vi CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát nấm Monascus 1.1.1 Lịch sử sử dụng sản phẩm gạo đỏ lên men 1.1.2 Đặc điểm sinh học nấm Monascus 1.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất nấm Monascus sp 1.2 Khái quát monacolin K (lovastatin) 11 1.2.1 Khái niệm 11 1.2.2 Tính chất vật lý 11 1.2.3 Cơ chế tác động 12 1.2.4 Con đường sinh tổng hợp monacolin 14 1.2.5 Phương pháp điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến monacolin K 16 1.3 Các nghiên cứu nước 20 1.3.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước: 20 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước: 21 1.4 Tính cấp thiết đề tài : 22 1.5 Ý nghĩa tính khoa học thực tiễn: 23 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Trang thiết bị hóa chất 24 2.1.1 Trang thiết bị 24 , dung môi, môi trường 24 2.2 Định danh nấm Monascus 25 2.2.1 Mô tả nội dung 25 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.3 Các tiêu theo dõi 26 2.2.4 Nội dung cần đạt 26 2.3 Khảo sát phương pháp chiết tách xác định hàm lượng citrinin 26 2.3.1 Mô tả nội dung 26 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 27 i 2.3.3 Các tiêu theo dõi 29 2.3.4 Nội dung cần đạt 29 2.4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy sinh monacolin K 29 2.4.1 Mô tả nội dung 29 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.4.3 Các tiêu theo dõi 33 2.4.4 Nội dung cần đạt 33 2.5 Tối ưu hóa mơi trường ni cấy Monascus sinh monacolin K cao citrinin thấp 33 2.5.1 Mô tả nội dung 33 2.5.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.5.3 Các tiêu theo dõi 40 2.5.4 Sản phẩm nội dung cần đạt 40 2.6 Khảo sát độ ổn định hàm lượng monacolin K sản phẩm 40 2.6.1 Mô tả nội dung 40 2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 44 3.1 Định danh nấm Monascus 44 3.1.1 Kết định danh nấm khóa phân loại Lin Izaka 44 3.1.2 Định danh nấm gen 18S rDNA 45 3.2 Kết khảo sát phương pháp chiết định lượng citrinin 46 3.3 Khảo sát điều kiện nuôi cấy 48 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng độ ẩm 48 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy môi trường rắn 50 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy mơi trường lỏng 52 3.4 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Monascus sinh monacolin K cao citrinin thấp 53 3.4.1 Nuôi cấy môi trường rắn 53 3.4.2 Nuôi cấy môi trường lỏng 61 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH nuôi cấy môi trường lỏng 73 3.5 Độ ổn định hàm lượng monacolin K sản phẩm 75 3.6 Bàn luận 76 3.6.1 Về định danh nấm Monascus 76 3.6.2 Về điều kiện nuôi cấy Monascus để thu monacolin K 76 3.6.3 Về tối ưu hóa mơi trường ni cấy 78 ii 3.6.4 Về độ ổn định hàm lượng monacolin K sản phẩm 80 3.6.5 So sánh kết với nghiên cứu khác 80 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 82 4.1 Kết luận 4.2 Đề nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 82 83 iii Báo cáo Vườn Ươm Hàm mục tiêu thử nghiệm lượng monacolin K tạo cao citrinin thấp Điều kiện xác định phần point prediction (dự đoán điểm) phần mềm sau: ethanol 0,21%; NH Cl 0,13%; KH PO 0,03%; MgSO 7H O 0,02% Với nồng độ tối ưu này, lượng sinh khối, monacolin K, citrinin dự đoán 7,03 (g/l); 212,028 (mg/l); 0,4 (ppm) Cơng thức dự đốn tối ưu đánh giá cách lập lại lần erlen thu kết trình bày Bảng 3.19 với độ xác cao Như mơ hình có tính tương thích với thực nghiệm cao Bảng 3.20 Kết đánh giá độ xác mơ hình Dự đốn 7,03 Monacolin K (mg/l) 212,028 Thực nghiệm 6,78 ± 0,19 200,06 ± 12,01 0,38 ± 0,068 Độ xác (%) 96,44 94,36 95 SKK (g/l) Citrinin (ppm) 0,4 Sau tối ưu hóa yếu tố bổ sung, hàm lượng monacolin K tạo môi trường cao 1,4 lần hàm lượng citrinin giảm 1,7 lần so với môi trường không bổ sung yếu tố điều kiện nuôi cấy 3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng pH nuôi cấy môi trường lỏng Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH môi trường với yếu tố bổ sung khảo sát gồm: ethanol 0,21%; NH Cl 0,13%; KH PO 0,03%; MgSO 7H O 0,02% mốc pH 2, 3, 4, 5, 6, môi trường chứng không điều chỉnh pH Bảng 3.21 Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến hàm lượng monacolin K citrinin pH SKK (g/l) Monacolin K (mg/g SKK) Monacolin K (mg/l) Citrinin (ppm) 6,51±0,06 20,21±0,45 131,58±4,09 0,26±0,042 6,94±0,14 26,82±0,99 186,12±10,55 0,38±0,016 7,26±0,08 36,93±1,63 268,12±8,78 0,49±0,028 73 Báo cáo Vườn Ươm 7,34±0,44 33,55±0,93 246,28±6,99 0,34±0,042 7,21±0,25 27,66±0,96 199,46±13,85 0,32±0,026 7,04±0,44 23,23±0,68 163,52±14,73 0,28±0,016 Chứng 7,05±0,31 29,61±0,99 208,75±15,97 0,39±0,042 Citrinin (ppm) 300 1.5 200 1.0 100 0.5 Citrinin (ppm) Monacolin K (mg/l) Monacolin K (mg/l) 0.0 pH2 pH3 pH4 pH5 pH6 pH7 Chung Môi trườn g điều chỉnh pH Đồ thị 3.13 Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến tạo monacolin K citrinin Kết cho thấy hàm lượng sinh khối tạo tăng dần thay đổi pH từ acid đến kiềm Nhìn chung pH 4, chủng nấm phát triển so với mốc pH lại Đối với hàm lượng monacolin K lượng tích lũy khác rõ rệt thay đổi pH nuôi cấy Lượng monacolin K tạo cao nuôi cấy pH (cao 1,3 lần so với môi trường không điều chỉnh pH), pH (cao 1,18 lần), pH 6, pH 3, pH thấp nuôi pH (thấp 1,6 lần so với môi trường không điều chỉnh pH) Hàm lượng citrinin có xu hướng tạo nhiều pH ni cấy từ – (từ 0,38 – 0,49 ppm) giảm pH nuôi cấy tăng từ 5-6 (từ 0,34 – 0,28 ppm) Khi xem xét tỉ lệ monacolin K citrinin cho thấy tỉ lệ cao pH (724,35) cao 1,3 lần so với pH 1,35 lần so với môi trường không 74 Báo cáo Vườn Ươm điều chỉnh pH Như vậy, pH pH ni cấy thích hợp để M purpureus tổng hợp monacolin K cao citrinin thấp 3.5 Độ ổn định hàm lượng monacolin K sản phẩm Chúng tiến hành khảo sát độ ổn định hàm lượng monacolin K sản phẩm lên men rắn lên men lỏng tháng Kết trình bày bảng sau: Bảng 3.22 Độ ổn định monacolin K sản phẩm lên men rắn Thời gian bảo quản Chế độ bảo quản Nhiệt độ phòng (μg/g) 2-8oC (μg/g) 2982,39± 7,71 2982,39± 7,71 2978,88± 6,08 2980,22± 3,84 2974,28± 4,93 2972,95± 6,98 2962,44± 10,03 2961,44± 10,91 2957,85± 9,29 2957,57± 9,52 2957,53± 8,61 2956,86± 9,18 Monacolin K (%) 99,17% 99,14% Bảng 3.23 Độ ổn định monacolin K sản phẩm lên men lỏng Thời gian bảo quản Chế độ bảo quản Nhiệt độ phòng (mg/g) 2-8oC (mg/g) 33,64± 0,08 33,62± 0,06 33,59± 0,14 33,59± 0,06 33,57± 0,12 33,55± 0,02 33,54± 0,13 33,52± 0,04 33,52± 0,12 33,52± 0,05 33,49± 0,12 33,50± 0,04 Monacolin K (%) 99,56% 99,63% Kết khảo sát cho thấy hàm lượng monacolin K sinh khối khô lên men men rắn lên men lỏng ổn định thời gian bảo quản tháng nhiệt 75 Báo cáo Vườn Ươm độ phòng 2-8oC với hàm lượng monacolin K sau tháng bảo quản 99% so với hàm lượng ban đầu 3.6 Bàn luận 3.6.1 Về định danh nấm Monascus Kết định danh nấm cách quan sát đại thể, vi thể phản ứng sinh hóa theo khóa phân loại Lin Izaka kết định danh gen 16S rDNA nấm phân lập từ gạo đỏ cho kết Monascus purpureus 3.6.2 Về điều kiện nuôi cấy Monascus để thu monacolin K 3.6.2.1 Nuôi cấy rắn Điều kiện nhiệt độ độ ẩm Các kết khảo sát cho thấy yếu tố nhiệt độ độ ẩm có ảnh hưởng đáng kể đến q trình tăng trưởng sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp nấm Monascus Độ ẩm 65% độ ẩm thích hợp để M purpureus sản sinh monacolin K, giảm citrinin so với độ ẩm cao thấp Theo nghiên cứu Chen Hu, 2005; độ ẩm thích hợp cho M pilosus sinh monacolin K giảm citrinin 65% [5] Như vậy, chủng M pilosus M purpureus, độ ẩm 65% độ ẩm thích hợp để chúng tăng sản xuất monacolin K giảm tạo citrinin Giovanni, 1983 giải thích mối liên quan độ ẩm mơi trường ni cấy q trình sản xuất monacolin K nấm Monasucs dựa vào cân nồng độ khí oxy hàm lượng nước mơi trường ni cấy Khí oxy cần thiết cho thơng khí giúp nấm tăng trưởng cịn nước giúp cho q trình chuyển hóa nấm giúp loại bỏ nhiệt sinh từ q trình Khi độ ẩm tăng, lượng nước môi trường tăng, không khí tồn khoảng trống bị thay nước, làm giảm nồng độ khí oxy Ngược lại, độ ẩm thấp, lượng nước thấp, nồng độ khí oxy tăng [14] Hàm lượng monacolin K cao độ ẩm 65% (965,65 μg/g SKK), độ ẩm nồng độ khí oxy hàm lượng nước thích hợp cho nấm sản sinh monacolin K 76 Báo cáo Vườn Ươm Đối với yếu tố nhiệt độ, khoảng nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển khác với khoảng nhiệt độ để nấm sinh chất chuyển hóa thứ cấp (30-32ºC thích hợp cho nấm tăng sinh khối nấm tạo nhiều sản phẩm trao đổi thứ cấp nhiệt độ thấp 26-28ºC) [13], ni nấm trì nhiệt độ 30oC (I) 26oC (II) suốt q trình ni cấy cho thấy hàm lượng monacolin K tạo khơng cao Trong đó, chế độ nhiệt (III): nuôi nấm 30ºC ngày đầu để nấm tăng sinh khối, trì 26ºC 14 ngày sau để nấm sản sinh chất chuyển hóa thứ cấp tạo lượng monacolin K cao 3.6.2.2 Nuôi cấy lỏng Về nhiệt độ pH nuôi cấy ảnh hưởng đến tổng hợp monacolin K citrinin Các kết khảo sát cho thấy yếu tố nhiệt độ pH có ảnh hưởng đáng kể đến q trình tăng trưởng sản sinh chất thứ cấp chủng nấm thử nghiệm Đối với yếu tố nhiệt độ nuôi cấy môi trường lỏng, chế độ nhiệt I nuôi 30oC 14 ngày chế độ nhiệt thích hợp Kết khác với kết nuôi cấy rắn chủng nấm thử nghiệm, phương pháp nuôi cấy khác dẫn đến nhiệt độ ni cấy thích hợp mơi trường rắn khác mơi trường lỏng Bên cạnh đó, kết phù hợp với nghiên cứu Monascus purpureus [44] 30oC Bên cạnh nghiên cứu Lee cộng [36], thu sinh khối Monascus giàu monacolin K nồi lên men nhiệt độ lựa chọn 30oC Như vậy, nuôi cấy môi trường lỏng chủng nấm M purpureus, chế độ nhiệt I (30oC 14 ngày) thích hợp cho nấm phát triển sinh hợp chất thứ cấp Đối với yếu tố pH, pH ni cấy kích thích nấm tạo lượng monacolin K citrinin cao Kết tương tự với nghiên cứu Chen cộng cho giá trị pH thấp (4,0) kích thích nấm tăng trưởng tăng tổng hợp citrinin [13] Ngoài theo nghiên cứu Fernanda cộng kết luận tổng hợp citrinin phụ thuộc nhiều vào pH môi trường, pH môi trường tăng lượng citrinin tạo giảm, pH kiềm ức chế mạnh tổng 77 Báo cáo Vườn Ươm hợp citrinin [22] Kết phù hợp với nghiên cứu lượng citrinin tạo pH thấp 1,75 lần so với pH Khi so sánh kết nuôi cấy pH pH nhận thấy pH lượng citrinin tạo thấp 1,4 lần so với pH lượng monacolin K tạo thấp khoảng 1,02 lần Như pH khoảng pH thích hợp để M purpureus tạo monacolin K cao citrinin thấp 3.6.3 Về tối ưu hóa mơi trường ni cấy 3.6.3.1 Về chất thích hợp Kết cho thấy chủng nấm thử nghiệm nuôi cấy môi trường rắn lỏng, gạo trắng chất thích hợp so với củ từ Kết khác với nghiên cứu Lee cộng [37], nhóm nghiên cứu khảo sát loại chất gạo, khoai lang, khoai tây Dioscorea batatas theo phương pháp nuôi cấy rắn cho kết chất Dioscorea batatas, chủng M purpureus NTU 301 tổng hợp lượng monacolin K cao cao 5,37 lần so với môi trường gạo Bên cạnh đó, nghiên cứu khác Lee [36], so sánh loài Dioscorea khác làm chất nền: D alata L var purpurea; D alata L Kaotien; D alata L Shansan; D alata L Chungkuochang; D batatas Dence thấy hàm lượng monacolin K tạo từ chủng M purpureus NTU 568 khác nhau, có lồi Dioscorea tạo monacolin K nhiều gạo khoảng từ 0,5 đến 1,49 lần (D alata L var purpurea; D alata L Kaotien; D batatas Dence), có lồi tạo khoảng 0,6 đến 0,75 lần (D alata L Shansan; D alata L Chungkuochang) chất tốt D batatas Dence Vì vậy, điều cịn tùy thuộc vào lồi dioscorea chủng nấm Monascus Đối với nấm M purpureus thử nghiệm loại khoai có sẵn Việt Nam thuộc chi Dioscorea khơng phải chất thích hợp để tạo monacolin K So với Dioscorea gạo chất tốt 3.6.3.2 Về chất bổ sung ảnh hưởng đến tổng hợp monacolin K citrinin Nuôi cấy rắn 78 Báo cáo Vườn Ươm Nguồn carbon bổ sung ethanol glucose kích thích nấm tạo nhiều monacolin K Kết tương tự với nghiên cứu tác giả Wang cộng sự, 2003 [30] ; Lee cộng sự, 2007 [20] Ngoài ra, đề tài nhận thấy ethanol có tác dụng làm giảm lượng citrinin nhiều glucose Bên cạnh đó, chúng tơi nhận thấy việc sản xuất monacolin K citrinin có xu hướng tương tự điều kiện nuôi cấy Khi nồng độ ethanol tăng (0,3-0,7%), hàm lượng monacolin K citrinin giảm Khi nồng độ glucose tăng (0,5-2%), hàm lượng monacolin K citrinin tăng Nguồn nitơ NH Cl cho hàm lượng monacolin K citrinin cao nhất, MSG tạo monacolin K, citrinin thấp Như vậy, điều kiện làm tăng monacolin K thơng thường làm tăng citrinin Điều đường sinh tổng hợp monacolin K citrinin gần giống nhau, chúng tạo từ đường tổng hợp polyketid [30] Nuôi cấy lỏng Ở thử nghiệm này, sàng lọc tối ưu hóa nồng độ chất bổ sung phương pháp RSM để nấm M purpureus sinh monacolin K cao citrinin thấp Nồng độ tối ưu chất phần mềm DX7.1 dự đoán kiểm tra lại ethanol 0,21%; NH Cl 0,13%; KH PO 0,03%; MgSO 7H O 0,02% Trong nghiên cứu Lee cộng [36], để cải thiện tỉ lệ monacolin K citrinin sinh M purpureus NTU 568 ni cấy chìm tối ưu hóa nồng độ ethanol, nồng độ Discorea, pH phương pháp RSM kết luận nồng độ ethanol tăng (khoảng 0,5%) ức chế tổng hợp citrinin pH mơi trường khoảng – 7,5 Cịn nghiên cứu Wang cộng [46], sàng lọc yếu tố ảnh hưởng đến tạo thành monacolin K citrinin môi trường rắn, cho thấy số yếu tố ure, NH Cl, methionie, MSG NH Cl (trên 0,5%) có ảnh hưởng tích cực đến tạo thành monacolin K, yếu tố lại ức chế tạo thành monacolin K citrinin Điều giải thích sử dụng nguồn nitơ bổ sung NH Cl làm tăng hoạt tính enzym glutamate 79 Báo cáo Vườn Ươm dehydrogenase cuối làm tăng tích lũy acetyl CoA nguyên liệu ban đầu cho tổng hợp chất polyketid [49] trình bày mục 1.2.5.2 Đồng thời từ nghiên cứu trên, so sánh yếu tố ethanol với glucose nhận thấy nồng độ glucose 2% làm giảm tạo thành citrinin nhiều so với ethanol 1% lượng monacolin K tạo môi trường glucose 2% (4 mg/kg) thấp nhiều so với ethanol 1% (123 mg/kg) Hiện nay, chế làm giảm tổng hợp citrinin bổ sung ethanol nồng độ thích hợp chưa nghiên cứu Điều liên quan đến đường tổng hợp citrinin M purpureus Trong nghiên cứu Sayyad cộng [43], tối ưu hóa thơng số dinh dưỡng đến tổng hợp lovastatin M purpureus MTCC 369 nhận thấy yếu tố MgSO 7H O KH PO có tương tác tích cực đến việc tạo lovastatin Như vậy, kết thử nghiệm có xu hướng tương tự với nghiên cứu khác ảnh hưởng yếu tố bổ sung đến tổng hợp monacolin K cao citrinin thấp nồng độ tối ưu yếu tố khác nghiên cứu Điều phương pháp ni cấy chủng nấm thử nghiệm khác 3.6.4 Về độ ổn định hàm lượng monacolin K sản phẩm 3.6.5 So sánh kết với nghiên cứu khác Kết từ nghiên cứu khác nuôi cấy Monascus để thu monacolin K theo phương pháp ni cấy chìm trình bày Bảng 3.20 Bảng 3.24 So sánh kết với nghiên cứu khác Tác giả Chủng nấm Chang cộng Monascus ruber Chung cộng Monascus spp Môi trường tối ưu Gạo 3,44% Pepton 1,08% Glucose 12,9% KNO 0,8% MgSO 0,4% Glycerol 3,64 ml Bột mì 1% Pepton 1% Dầu oliu 0,01% Monacolin K Citrinin 157 mg/l * 151,06mg/l * 80 Báo cáo Vườn Ươm Tác giả Chủng nấm Sayyad cộng Monascus purpureus MTCC 369 Lee cộng Monascus purpureus NTU 568 Nghiên cứu Monascus purpureus *Chú thích: “*” khơng khảo sát Môi trường tối ưu KH PO 0,01% Glucose 2,95% NH Cl 0,38% KH PO 0,17% MgSO 0,086% MnSO 0,019% Dioscorea batatas 1% Ethanol 0,5% Gạo 3% Ethanol 0,21% NH4Cl 0,13% KH PO 0,03% MgSO 0,02% Monacolin K Citrinin 326 mg/l * 27,9 mg/g 2,15 µg/g 246,28mg/l (33,55mg/g) 0,34ppm (46,3µg/g) Như trình bày mục 1.2.3, sản phẩm monacolin K citrinin tổng hợp theo đường polyketid từ Monascus Do đó, monacolin K kích thích tạo nhiều hàm lượng citrinin tạo tăng lên Vì vậy, cần phải tối ưu hóa mơi trường cho lượng monacolin K tăng citrinin hình thành mức thấp Trong nghiên cứu chúng tôi, hàm lượng monacolin K đạt 246,28 mg/l cao 1,56 lần so với nghiên cứu Chang cộng [11] 1,6 lần so với nghiên cứu Chung cộng [16] lại thấp 1,3 lần so với nghiên cứu Sayyad cộng [43] Tuy nhiên hầu hết nghiên cứu ni cấy chìm khơng đề cập đến lượng citrinin nên kết mang tính tham khảo Ở nghiên cứu Lee cộng [36], sử dụng chủng Monascus purpureus NTU 568 chủng đột biến tạo citrinin thấp [27], lượng citrinin tạo thấp 21 lần so với nghiên cứu Mặc dù hàm lượng citrinin chưa giảm xuống mức tối thiểu, sử dụng số phương pháp hóa học để tách citrinin giữ hàm lượng monacolin K sản phẩm nghiên cứu Lee cộng [35] 81 Báo cáo Vườn Ươm CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Sau q trình làm thực nghiệm, chúng tơi thực đầy đủ nội dung nghiên cứu nêu rút số kết luận sau: • Định danh chủng nấm phân lập đến loài Monascus purpureus • Xác định qui trình chiết citrinin sản phẩm Monascus • Xác định điều kiện ni cấy tối ưu phương pháp rắn lỏng: - Phương pháp rắn: độ ẩm ban đầu 65% chế độ nhiệt độ nuôi cấy 30oC ngày đầu 26oC 14 ngày sau - Phương pháp lỏng: xác chế độ nhiệt I (nuôi 30oC 14 ngày) thích hợp pH ni cấy pH • Xác định thành phần môi trường nuôi cấy tối ưu theo phương pháp rắn lỏng: - Phương pháp rắn: môi trường có chất gạo bổ sung thêm ethanol 0,3%; NH Cl 0,5%; glycerol 0,5%; NaCl 0,1% - Phương pháp lỏng: môi trường chất gạo 3% bổ sung ethanol 0,21%; NH Cl 0,13%; KH PO 0,03%; MgSO 0,02% • Hàm lượng monacolin K sản phẩm lên men rắn lên men lỏng ổn định ở nhiệt độ phòng 2-8oC tháng bảo quản 4.2 Đề nghị Sau thực đề tài, chúng tơi có số đề nghị sau: • Nghiên cứu phương pháp tách citrinin khỏi sản phẩm sinh khối nấm giàu monacolin K • Gây đột biến ứng dụng kĩ thuật di truyền để chọn lọc chủng nấm tạo nhiều monacolin K citrinin 82 Báo cáo Vườn Ươm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] [2] [3] [4] [5] Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hoạt chất tự nhiên NXB Y học Lê Đức Mạnh (2007), "Khảo sát khả tạo sắc tố, lovastatin độc tố citrinin hai chủng nấm mốc đỏ Monascus purpureus", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ, 23, tr 238-244 Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Đống Thị Anh Đào, Nguyễn Hữu Phúc (2007), "Chọn giống nấm men Rhodotorula có khả phát triển với mốc Monascus sp trường gạo theo phương pháp nuôi cấy bề mặt.", Kỷ yếu hội nghị khoa học công nghệ - Viện Khoa học Công nghệ VNViện sinh học nhiệt đới Huỳnh Bái Nhi, Vũ Thanh Thảo, Lê Minh Trí, Trần Cát Đơng (2010), "Hoạt tính chống oxi hóa dịch chiết methanol từ mơi trường ni cấy Monascus sp.", Tạp chí Y Học, 14, tr 134 - 139 Vũ Thanh Thảo, Huỳnh Bái Nhi, Cao Thị Hồng Gấm, Trần Cát Đông (2011), "Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi nấm Monascus purpureus để thu sinh khối giàu monacolin K", Tạp chí Y Học TP HCM, 15, tr 195-201 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [6] [7] [8] [9] Ambrose, A M., F Deeds (1946), "Some toxicological and pharmacological properties of citrinin", J Pharmacol Exp Ther, 88 p 173186 Aniya, Y, Ohtani II, Higa T, Miyagi C, Gibo H, Shimabukuro M, Nakanishi H, Taira J (2000), "Dimerumic acid as an antioxidant of the mold Monascus anka", Free Radic Biol Med, 28(6), p 999-1004 Arnold, L Demain, Julian E Davies (1999), Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology American Society for Microbiology, p 80-93 Blanc, P J., M O Loret, G Goma (1995), "Production of citrinin by various species of Monascus", Biotechol Lett., 17(3), p 291-294 83 Báo cáo Vườn Ươm [10] Chang, Y N., Y C Lin, C C Lee, B L Liu, Y M Tzeng (2002), "Effect of rice-glycerol complex medium on the production of lovastatin byMonascus ruber", Folia Microbiol, 47(6), p 677-684 [11] Chang, Yaw-Nan, Jen-Chang Huang, Chih-Chen Lee, Ing-Lung Shih, YewMin Tzeng (2002), "Use of response surface methodology to optimize culture medium for production of lovastatin by Monascus ruber", Enzyme and Microbial technology, 30(7), p 889-894 [12] Chayawat, Jirawun, Saeree Jareonkitmongkol, Apisit Songsasen, Busaba Yongsmith (2009), "Pigments and Anti-Cholesterol Agent Production by Monascus kaoliang KB9 and Its Color Mutants in Rice Solid Cultures", Kasetsart J (Nat Sci), 43 p 696-702 [13] Chen, MH, Johns MR (1993), "Effect of pH and nitrogen source on pigment production by Monascus purpureus", Appl Microbiol Biotechol, 73 p 297-304 [14] Chen, Y P., C P Tseng, L L Liaw, C L Wang, I C Chen, W J Wu, M D Wu, G F Yuan (2008), "Cloning and characterization of monacolin K biosynthetic gene cluster from Monascus pilosus", J Agric Food Chem, 56(14), p 5639-5646 [15] Chen, Yen-lin , Ing-er Hwang, Ming-chih Lin, Ting-kuo Huang, Chien-cho Chen, Gwo-fang Yuan Monascus purpureus mutant and its use in preparing yellow pigment Food Industry Research and Development Institute, Editor 2003 [16] Chung, C.C., H.H Chen (2007), "Application of the taguchi method to optimize Monascus spp Culture", Food Process Engineering, 30 p 241254 [17] Cicero, A F., M Brancaleoni, L Laghi (2005), "Antihyperlipidaemic effect of a Monascus purpureus brand dietary supplement on a large sample of subjects at low risk for cardiovascular disease, A pilot study", Ther.med, 13 p 273-278 [18] Endo, A (1979), "Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species", J Antibiotics 32 p 852-854 [19] Endo, A (1980), "Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase", J Antibiot (Tokyo), 33(3), p 334-336 [20] Endo, A., Y Negishi, T Iwashita, K Mizukawa, M Hirama (1985), "Biosynthesis of ML-236B (compactin) and monacolin K", J Antibiot, 38 p 444-448 84 Báo cáo Vườn Ươm [21] Erdogrul, Ozlem, Sebile Azirak (2004), "Review of the studies on the red yeast rice (Monascus purpureus)", Turkish Electronic Journal of Biotechnology 2p 37-49 [22] Fernanda, Sandra, Bilnao Orozco, Beatriz Vahan Kilikian (2008), "Effect of pH on citrinin and red pigments production by Monascus purpureus CCT3802", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24 p 263268 [23] Flajs, D., M Peraica (2009), "Toxicological properties of citrinin", Arh Hig Rada Toksikol, 60 p 457-464 [24] Ganrong, X., C Yue, C Yun, L Xiaorong, L Xing (2004), "Production of acid form Monacolin K by Monascus sp.9001 without producing citrinin", CNKI Journal, 10 p 16-24 [25] Hajjaj, H., A Klaébé, M O Loret, G Goma, P J Blanc, J Franỗois (1999), "Biosynthetic pathway of citrinin in the filamentous fungus Monascus ruber as revealed by 13C nuclear magnetic resonance", Appl Environ Microbiol 1999 January, 65 p 311–314 [26] Hoog, G.S, J Guarro (2002), Atlas of Clinical Fungi Universitat Rovira I Virgili, p 283-284 [27] Hsu, Y W., L C Hsu, Y H Liang, Y H Kuo, T M Pan (2010), "Monaphilones A-C, three new antiproliferative azaphilone derivatives from Monascus purpureus NTU 568", J Agric Food Chem, 58(14), p 8211-8216 [28] Huang, H N., Y Y Hua, G R Bao, L H Xie (2006), "The quantification of monacolin K in some red yeast rice from Fujian province and the comparison of the other product", Chem Pharm Bull (Tokyo), 54(5), p 687689 [29] Japakaset, Jantima, Chakamas Wongkhalaung, Vichien Leelawatcharamas (2009), "Utilization of soybean residue to produce monacolin K-cholesterol lowering agent", Songklanakarin Journal of Science and Technology, 31 p 35-39 [30] Jia, X Q., Z N Xu, L P Zhou, C K Sung (2010), "Elimination of the mycotoxin citrinin production in the industrial important strain Monascus purpureus SM001 ", Metabolic Engineering, 12 p 1-7 [31] Juzlova, P, L Martinkova, V Kren (1996), "Secondary metabolites of the fungus Monascus: a review", Journal of Industrial Microbiology, 16 p 163170 85 Báo cáo Vườn Ươm [32] Kao, Chien-Lung (2004), Study on the flavor of red rice chiew effected by the addition of Monascus yeast strains and culture temperature, Deparment of Bioengineering Tatung University, Master of sicence p 4-42 [33] Kimura, K., D Komagata, S Murakawa, A Endo (1990), "Biosynthesis of monacolins: Conversion of monacolin J to monacolin K (mevinolin)", J Antibiotics, 43 p 1621-1622 [34] Komagata, D., H Shimada, S Murakawa, A Endo (1989), "Biosynthesis of monacolins: conversion of monacolin L to monacolin J by a monooxygenase of Monascus ruber", J Antibiot (Tokyo), 42(3), p 407-412 [35] Lee, C L., W P Chen, J J Wang, T M Pan (2007), "A simple and rapid approach for removing citrinin while retaining monacolin K in red mold rice", J Agric Food Chem, 55(26), p 11101-11108 [36] Lee, C L., H K Hung, J J Wang, T M Pan (2007), "Improving the ratio of monacolin K to citrinin production of Monascus purpureus NTU 568 under dioscorea medium through the mediation of pH value and ethanol addition", J Agric Food Chem, 55(16), p 6493-6502 [37] Lee, C L., J J Wang, S L Kuo, T M Pan (2006), "Monascus fermentation of dioscorea for increasing the production of cholesterollowering agent monacolin K and antiinflammation agent monascin", Appl Microbiol Biotechnol, 72(6), p 1254-1262 [38] Li, Y G., H Liu, Z T Wang (2005), "A validated stability-indicating HPLC with photodiode array detector (PDA) method for the stress tests of Monascus purpureus-fermented rice, red yeast rice", J Pharm Biomed Anal, 39(1-2), p 82-90 [39] M Manzoni, M Rollini (2002), "Biosynthesis and biotechnological production of statins by filamentous fungi and application of these cholesterol-lowering drugs", Appl Microbiol Biotechol, 58(9), p 555-564 [40] Mossini, S A G., C Kemmelmeier (2008), "Inhibition of Citrinin Production in Penicillium citrinum Cultures by Neem Azadirachta indica A Juss", Int J Mol Sci , 9(9), p 1676-1684 [41] Panda, Bibhu Prasad, Saleem Javed, Mohammad Ali (2008), "Optimization of Fermentation Parameters for Higher Lovastatin Production in Red Mold Rice through Co-culture of Monascus purpureus and Monascus ruber", Food Bioprocess Technol, p 373-378 [42] Phillips, R D , W O Berndt, A W Hayes (1979), "Distribution and excretion of [14C] citrinin in rats", Toxicology, 12 p 285-298 86 Báo cáo Vườn Ươm [43] Sayyad, S A., B P Panda, S Javed, M Ali (2007), "Optimization of nutrient parameters for lovastatin production by Monascus purpureus MTCC 369 under submerged fermentation using response surface methodology", Appl Microbiol Biotechnol, 73(5), p 1054-1058 [44] Su, Yuan Chi, Jyh Jye Wang, Tzu Tsen Lin (2003), "Production of the secondary metabolites c-aminobutyric acid and monacolin K by Monascus", J Ind Microbial Biotechnol, 30(1), p 41-46 [45] Sumioka, I., M Hayama, Y Shimokawa, S Shiraishi, A Tokunaga (2006), "Lipid-lowering effect of monascus garlic fermented extract (MGFE) in hyperlipidemic subjects", Hiroshima J Med Sci, 55(2), p 59-64 [46] Wang, J J., C L Lee, T M Pan (2003), "Improvement of monacolin K, gamma-aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of environmental conditions of Monascus purpureus NTU 601", J Ind Microbiol Biotechnol, 30(11), p 669-676 [47] Wang, Jyh-Jye, Chung-Lin Lee, Tzu-Ming Pan (2004), "Modified mutation method for screening low citrinin-producing strains of Monascus purpureus on rice culture", J Agric Food Chem., 52 p 6977-6982 [48] Wang, L., H Mo, H Shi (1999), "Production of lovastatin with solid-state fermentation of Monascus ruber (Chinese)", Chinese Journal of Antibiotics, 24 p 96-98 [49] Wang, Tseng-Hsing, Tzann-Feng Lin 2007, "Monascus rice products", in Advances in Food and Nutrition Research, Steve Taylor, Editor Academic Press p 123-159 87