Nghiên cứu phân lập gen 4cl1 mã hóa cho 4 coumarate coenzyme a ligase 1 từ cây thông mã vĩ (pimus massoniana l ) và biểu hiện ở vi khuẩn escherichia coli

Tr-ờng đại học lâm nghiệp Khoa lâm học  KHÓA LUN TT NGHIP Nghiên cứu phân lập gen 4CL1 mà hoá cho 4-Coumarate Coenzyme A Ligase từ Thông M· VÜ (Pinus massoniana L.) vµ biĨu hiƯn ë vi khuÈn Escherichia coli Ngành : Công nghệ sinh học Mã ngnh : 307 Giáo viên h-ớng dẫn: ThS Bùi Văn Thắng : ThS Hà Văn Huân Sinh viên thực : Vũ Thị Lợi Khóa học : 2005 - 2009 Hµ Néi – 2009 ĐẶT VẤN ĐỀ Cơng nghệ gen hƣớng cho nhà tạo giống trồng, diện tích đất trồng ngày bị thu hẹp q trình thị hoá diễn ngày mạnh mẽ Cây lâm nghiệp biến đổi gen theo đà phát triển lớn mạnh ngày Từ năm 2004, có nhiều quốc gia đƣa lâm nghiệp biến đổi gen vào trồng thƣơng mại hố điển hình nhƣ Hoa Kỳ Trung Quốc, quốc gia tiên phong lĩnh vực công nghệ sinh học lâm nghiệp Khi đƣa công nghệ gen ứng dụng vào lâm nghiệp, nhà khoa học thƣờng quan tâm tới đặc tính nhƣ: tốc độ sinh trƣởng, chất lƣợng gỗ, khả chống chịu sâu bệnh hại chống chịu lại điều kiện bất lợi môi trƣờng Cải thiện chất lƣợng gỗ mối quan tâm hàng đầu nhà nghiên cứu, với 57% tổng số cơng trình nghiên cứu lâm nghiệp biến đổi gen liên quan đến tính trạng Từ thập niên 90 trở lại đây, nhiều cơng trình nghiên cứu việc thay đổi hàm lƣợng lignin thể thực vật đƣợc ứng dụng vào thực tế sản xuất Các nghiên cứu chủ yếu dựa vào việc kích thích hoạt động nhóm gen 4CL, có khả ảnh hƣởng đến việc sinh tổng hợp lignin thể thực vật Gen 4CL1 mã hóa cho enzym 4- Coumarate Coenzyme A Ligase kích thích sinh tổng hợp lignin làm cho cấu trúc mạch gỗ bền vững hơn, chịu đƣợc tác nhân lý - hoá học tác động từ mơi trƣờng bên ngồi gen đƣợc quan tâm nhiều Thực tế khẳng định, việc phân lập thành công gen mục tiêu 4CL1 từ đối tƣợng thực vật biểu đƣợc gen 4CL1 hệ thống biểu prokaryot vô cần thiết cho nghiên cứu chuyển gen lâm nghiệp làm tăng chất lƣợng gỗ Với mục tiêu cuối chuyển gen 4CL1 vào trồng lâm nghiệp, gen 4CL1 cần phải nguồn gen đáng tin cậy tạo sản phẩm chức Xuất phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu phân lập gen 4CL1 mã hoá cho - Coumarate Coenzyme A Ligase từ Thông Mã Vĩ (Pinus massoniana L.) biểu vi khuẩn Escherichia coli” làm tảng cho trình chuyển gen 4CL1 vào trồng lâm nghiệp Đây phần nội dung đƣợc thực đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Malia azadarach L.) biến đổi gen có tốc độ sinh trƣởng nhanh, chất lƣợng gỗ tốt” Với mục tiêu: - Phân lập xác định đƣợc trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập từ Thông Mã Vĩ - Thiết kế cấu trúc vector biểu gen 4CL1 - Tạo chủng vi khuẩn E.coli mang vector biểu tái tổ hợp đƣợc chèn gen quan tâm 4CL1 Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan phân lập gen 1.1.1 Vai trò trồng biến đổi gen Trƣớc đây, để tạo giống nhà tạo giống thƣờng sử dụng phƣơng pháp lai để tổ hợp gen hai cá thể bố mẹ tạo thể lai Tuy nhiên, phép lai chéo thực đƣợc cá thể loài gặp nhiều khó khăn Cơng nghệ gen đời tạo cách mạng công tác tạo giống với hàng loạt giống trồng, vật nuôi vi sinh vật mang đặc tính mong muốn vƣợt qua đƣợc giới hạn kỹ thuật tạo giống truyền thống (Lê Duy Thành, 2001) Cây trồng biến đổi gen GMC (Genetically Modified Crop) giống trồng có vật chất di truyền đƣợc biến đổi theo mục tiêu phục vụ lợi ích ngƣời (Vũ Văn Vụ, 2005) Từ năm 1996, trồng biến đổi gen đƣợc đƣa vào canh tác đại trà (James, 2005) Đánh giá tổng kết FAO năm 2007 cho thấy, diện tích trồng CNSH liên tục tăng mức cao (gồm 12 nƣớc phát triển 11 nƣớc công nghiệp) mang lại nhiều lợi ích kinh tế mơi trƣờng (FAO, 2007) Hiện có tới 674 sản phẩm trồng CNSH đƣợc 53 phủ phê chuẩn có mặt thị trƣờng từ tháng 11 năm 2007 (http://www.biotechnology.com.vn) Trung Quốc quốc gia đông dân cƣ giới cam kết trồng CNSH mà quốc gia tiên phong việc đƣa lâm nghiệp biến đổi gen vào trồng thƣơng mại hóa (FAO, 2004)s Tiến hành nghiên cứu lâm nghiệp biến đổi gen thƣờng theo hai hƣớng tăng tốc độ sinh trƣởng (chiếm 6%) cải thiện chất lƣợng gỗ (chiếm 57%) nhằm nâng cao giá trị kinh tế đơn vị diện tích trồng rừng (FAO, 2004) Do yêu cầu chất lƣợng gỗ với mục đích sử dụng khác nhau, cần loại gỗ có hàm lƣợng lignin khác mà nhà tạo giống vào hƣớng cải thiện chất lƣợng gỗ lâm nghiệp Cải thiện chất lƣợng gỗ làm tăng giảm hàm lƣợng lignin thể thực vật để phù hợp với mục tiêu ngƣời Cả hai hƣớng nghiên cứu tập trung tác động vào chế điều hịa hoạt tính enzym chìa khóa liên quan trực tiếp đến trình sinh tổng hợp lignin Để đạt đƣợc mục đích đó, nhà khoa học ứng dụng công nghệ chuyển gen để tạo giống mang đặc tính mong muốn 1.1.2 Tổng quan nghiên cứu tách dòng gen Tách dòng gen (gene cloning) đƣợc gọi với nhiều tên khác nhau: tạo dòng gen, nhân dòng gen, phân lập gen,… SƠ ĐỒ TÁCH DÒNG GEN RNA tổng số mRNA Gen mục tiêu Vector tách dòng Vector tách dòng tái tổ hợp Vi khuẩn E.coli tách dòng Vi khuẩn E.coli mang vector tái tổ hợp Sàng lọc gen Phân tích trình tự nucleotid Tách dòng gen tập hợp kỹ thuật nhằm đƣa gen, đoạn DNA cần thiết (DNA insert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện thích hợp để tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số tế bào mang đoạn chèn DNA (DNA insert) giống nhau, hình thành nên dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2005) Hầu hết gen tế bào có với kích thƣớc vơ nhỏ bé hệ genom khổng lồ Công nghệ gen cần gen dạng độc lập với số lƣợng lớn Vì vậy, phải tiến hành tách dòng gen nhằm tạo lƣợng lớn gen mong muốn làm nguyên liệu cho nghiên cứu nhƣ: xác định trình tự gen (gene sequencing), biểu gen (gene expression) chuyển gen (transfergene) (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2005) a Vector tách dịng Vector tách dịng (vector cloning) trình tự DNA có kích thƣớc nhỏ cho phép cài (gắn) đoạn DNA cần thiết, có khả tái khơng phụ thuộc vào phân chia tế bào, tồn tế bào chủ nhiều hệ không gây biến đổi gen tế bào vật chủ (Khuất Hữu Thanh, 2006) Có nhiều loại vector tách dòng, nhƣng đƣợc dùng phổ biến plasmid (đoạn DNA ngắn -10 kb, dạng vòng, nằm nhiễm sắc thể tế bào vật chủ, đƣợc tìm thấy lần vi khuẩn), ngƣời biết lợi dụng đặc tính tự nhiên khơng ngừng cải tiến để tạo hệ vector nhân tạo mang nhiều đặc tính quý cho việc tách dòng gen Một vector tạo dòng nhân tạo thuộc hệ đƣợc sử dụng phổ biến vector pCR® 2.1 (Invitrogen Catalog nos, 2004) hãng Invitrogen sản xuất Vector pCR® 2.1 mang đầy đủ đặc tính tách dịng nhƣ: - Khả tự chép tích cực, độc lập tế bào chủ - Kích thƣớc nhỏ, dễ xâm nhập vào tế bào chủ, chép nhanh hiệu - Có gen thị cho phép phát dễ dàng tế bào chứa chúng (gen phân hủy kháng sinh giúp tế bào sinh trƣởng đƣợc mơi trƣờng có kháng sinh gen có khả sản sinh enzym ß- galactosidase operon lactose chuyển hố chất tạo màu đƣợc phát môi trƣờng thạch có bổ sung X-gal) (Khuất Hữu Thanh, 2006) - Tồn ổn định tế bào chủ qua nhiều hệ, khơng bị đào thải gây xáo trộn cho tế bào chủ - Mang vị trí nhận biết enzym giới hạn (Restriction enzyme), cho phép đoạn DNA cần tạo dòng gắn vào Trong nghiên cứu tách dòng gen mục tiêu, thƣờng sử dụng plasmid hệ hệ điển hình pBR322, pUC18, pSP64, pSP56, pCR2.1, pBluescript Hình 1.1 Vector tách dịng pCR® 2.1- TOP Ngày nay, ngƣời ta thƣờng sử dụng vector pCR® 2.1 – TOP để làm vector tách dịng Vector pCR® 2.1- TOP có kích thƣớc 3929 nucleotid, có gen kháng lại kháng sinh Amp Kan, có promoter T7 (362-381 bp) có vị trí cắt đặc hiệu enzym giới hạn nhƣ: HindIII, KpnI, SacI, BamHI, SpeI, BstXI, EcoRI, EcoRV, NotI, XhoI, NsiI, XbaI ApaI (Invitrogen Catalog nos, 2004) b Tách RNA tổng số mRNA Mọi nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lƣợng axít nucleic đủ lớn đủ độ tinh (Khuất Hữu Thanh, 2006) Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy enzym Ribonuclease (RNase) có mặt khắp nơi, có hoạt tính cao bền vững với tác nhân thƣờng dùng để loại bỏ enzym Vì vậy, việc tránh tạp nhiễm RNase từ môi trƣờng vô cần thiết RNA tổng số gồm loại RNA thông tin (mRNA); RNA riboxom (rRNA) RNA vận chuyển (tRNA) Trong rRNA chiếm 80-85% RNA tổng số, tRNA mRNA chiếm 15-20% (Khuất Hữu Thanh, 2006) mRNA chiếm 1-5% RNA tổng số tế bào, chúng có kích thƣớc trình tự vơ đa dạng nhƣng có điểm chung cấu trúc polyA (có thể lên tới 200A) (Khuất Hữu Thanh, 2006) Dựa vào đặc tính mà tách mRNA khỏi mẫu sắc kí lực cột oligod T – cellulose Hiện nay, thị trƣờng có nhiều Kit tách mRNA sử dụng viên bi từ có mang oligod T bề mặt c Tạo thƣ viện cDNA Thƣ viện cDNA tập hợp từ tất mRNA tế bào Không giống với thƣ viện gen, thƣ viện cDNA đƣợc thiết lập từ loại mơ xác định gen nghiên cứu phải đƣợc biểu thành mRNA Thƣ viện cDNA mang tính đặc trƣng mơ cao loại mơ thể biệt hố có số gen đƣợc phiên mã thành mRNA Thiết lập thƣ viện cDNA chủ yếu nhằm mục đích nghiên cứu biểu số gen xác định với vấn đề liên quan nhƣ: điều hoà biểu gen, mối tƣơng tác gen q trình sống, Khi phân tích kết thu đƣợc từ thƣ viện cDNA cần ý rằng: - Sự biểu gen chịu tác động lớn tình trạng sinh lí tế bào vào thời điểm thí nghiệm - Một số gen đƣơc phiên mã thành mARN nhƣng không đƣợc dịch mã Ngày nay, thƣ viện cDNA đƣợc ứng dụng nhiều CNSH nhƣ: phân lập gen, xác định trình tự gen, kiểm tra gen mục tiêu, lập đồ di truyền…(Đái Duy Ban, 2005) d Phƣơng pháp PCR Việc triển khai ứng dụng sinh học phân tử thƣờng vấp phải trở ngại số lƣợng vật chất di truyền Nhiều phƣơng pháp tạo dòng in vivo đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, giải đƣợc vấn đề số lƣợng vật chất di truyền nhƣng đòi hỏi thao tác phức tạp thời gian dài Sự đời phƣơng pháp khuếch đại in vitro đảo lộn nguyên tắc việc tạo dòng cổ điển, mở triển vọng ứng dụng to lớn Cách mạng phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) Karl Mullis cộng phát minh năm 1985 (Đái Duy Ban, 2005) Từ năm 1985 đến nay, PCR phƣơng pháp đƣợc ứng dụng hầu hết nghiên cứu sinh học phân tử nhƣ: - Xác định trình tự nucleotid đoạn DNA đƣợc nhân lên; tách dịng DNA đặc hiệu; phát đột biến; phân tích liên tiếp gen từ tế bào riêng lẻ; nghiên cứu q trình tiến hố mức độ phân tử; phục hồi gen tồn cách hàng chục triệu năm, … - Trong khoa học hình sự: chẩn đốn nhanh xác từ vết máu khơ, nƣớc bọt, sợi tóc thủ phạm cịn lƣu lại trƣờng; xác định quan hệ huyết thống cha con, ông cháu - Chọn cặp cha mẹ tốt làm giống nhanh chóng chọn giống trồng, vật ni - Trong y học đại giúp chẩn đoán sớm nhanh chóng bệnh nhiễm trùng di truyền, ung thƣ; chẩn đốn nhanh xác bệnh di truyền; chẩn đốn giới tính trƣớc sinh tuần tuổi dị tật bẩm sinh - Xác định đƣợc mức độ nhiễm sinh học nhanh chóng lĩnh vực bảo vệ mơi trƣờng Ngồi ra, phƣơng pháp PCR thiếu việc sản xuất phƣơng pháp sinh học phân tử khác để giải nhiều vƣớng mắc công nghệ sinh học đại (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2005 ) Tới nay, có tới bảy kỹ thuật PCR đƣợc ứng dụng rộng rãi bao gồm: - Kĩ thuật PCR chuẩn (Standard PCR) - Kĩ thuật PCR ngƣợc (RT-PCR) - Kĩ thuật PCR lồng (Nested PCR) - Kĩ thuật PCR đảo (Inverse PCR) - Kĩ thuật PCR dạng neo (Anchored PCR) - Kĩ thuật PCR phức (Multuplex PCR) - Kĩ thuật PCR chỗ (PCR in situ) e Giải trình tự nucleotid gen (DNA sequencing) Giải trình tự gen (DNA sequencing) phƣơng pháp xác định vị trí xếp nucleotid phân tử DNA giúp chẩn đoán bệnh tật ứng dụng thực tiễn sản xuất để phục vụ lợi ích ngƣời (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2005) Tùy theo mục đích phƣơng pháp nghiên cứu gen, ngƣời ta xác định đƣợc loại đồ di truyền gen khác nhau: đồ hình thái nhiễm sắc thể (NST), đồ di truyền tế bào, đồ di truyền liên kết, đồ lai phóng xạ, đồ trình tự gen,… Trong đó, đồ trình tự gen có độ xác cao nhất, đƣợc ứng dụng rộng rãi thực tiễn phục vụ lợi ích ngƣời Giải trình tự gen lồi sinh vật lập đồ trình tự gen khơng có ý nghĩa nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa lồi sinh vật mà cịn có vai trị to lớn việc phát gen hỏng, gen bị bệnh ngƣời, vật nuôi trồng Năm 1977, lần gen thực khuẩn thể đƣợc xác định trình tự (F.sanger et al., 1977) Đến nay, có hàng trăm gen virus, vi khuẩn gen số lồi sinh vật bậc cao đƣợc xác định trình tự: - Năm 1981, gen ty thể ngƣời đƣợc giải trình tự hồn chỉnh - Năm 1997, trình tự gen vi khuẩn E.coli đƣợc xác định trình tự (Blattner, Plunkett et al., 1997) 10 Ngoài ra, vector đƣợc thiết kế gắn thêm nucleotid T hai đầu hở nên sản phẩm PCR (gen mục tiêu 4CL1) đƣợc tổng hợp nhờ enzym Taq-DNA polymerase (Taq-DNA polymerase có gắn thêm đầu A phía 3' đoạn DNA đƣợc nhân lên) đƣợc gắn vào vector pCR 2.1 TA cách dễ dàng nhờ enzym nối T4- DNA ligase tạo vector tách dòng tái tổ hợp chứa gen mục tiêu Sản phẩm nối nhờ enzym T4- DNA ligase (vector tách dòng tái tổ hợp pCR 2.1- 4CL1) đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli TOP10 (chủng vi khuẩn đƣợc chọn để làm chủng gốc cho việc tách dịng gen) Thực q trình biến nạp (đƣa vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu vào chủng vi sinh vật đích) phƣơng pháp sốc nhiệt nhƣ trình bày phần phƣơng pháp nghiên cứu Sau thực trình biến nạp, cấy trải vi khuẩn lên đĩa pettri chứa môi trƣờng chọn lọc (đã bổ sung kháng sinh) với nồng độ khác nuôi 37oC sau khoảng 16 thu sản phẩm đĩa pettri chứa khuẩn lạc Kết biến nạp cho thấy, đĩa thạch có hai loại khuẩn lạc: khuẩn lạc xanh khuẩn lạc trắng Các dịng vi khuẩn sinh trƣởng đƣợc mơi trƣờng chứa kháng sinh Amp chứng tỏ đƣợc biến nạp vector pCR 2.1 có gen kháng kháng sinh Khuẩn lạc xanh xuất giải thích tế bào có vector pCR 2.1 TA khơng bị chèn đoạn DNA ngoại lai (vector pCR 2.1 TA tự đóng vịng) Do đó, gen lacZ đƣợc phiên mã, dịch mã bình thƣờng tổng hợp nên enzym ßgalactosidase, enzym chuyển hố chất X- gal khơng màu thành hợp chất có màu xanh Vậy khuẩn lạc xanh khơng phải khuẩn lạc chúng tơi quan tâm chắn không đƣợc chèn thêm DNA ngoại lai vào gen lacZ Khuẩn lạc trắng xuất tế bào vi khuẩn nhận đƣợc vector tái tổ hợp mang đoạn DNA ngoại lai chèn vào gen lacZ làm hỏng cấu trúc gen lacZ Vì vậy, tế bào vi khuẩn khơng thể chuyển hố đƣợc chất khơng 45 màu X- gal có mơi trƣờng ni cấy vi sinh vật thành hợp chất có màu xanh Nên đĩa pettri xuất khuẩn lạc màu trắng Một vấn đề đặt là, đoạn DNA ngoại lai đƣợc chèn vào gen lacZ vector tách dịng có kích thƣớc lớn hơn, nhỏ đoạn DNA mục tiêu quan tâm Vì vậy, phải tiến hành tách plasmid để kiểm tra xem khuẩn lạc trắng đĩa thạch đƣợc biến nạp nhận đƣợc vector tách dòng tái tổ hợp mang gen quan tâm 4CL1 Tiến hành lấy khuẩn lạc trắng (kí hiệu từ T1-T7) khuẩn lạc xanh (kí hiệu X) lần lƣợt cấy vào lọ penicellin lọ chứa ml môi trƣờng LB bổ sung Amp 100µg/ml ni 37oC, lắc 225 rpm, qua đêm để tiến hành tách chiết plasmid theo kit trình bày phần phƣơng pháp nghiên cứu Kết tách plasmid đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% khoảng 45 phút dòng điện chiều có hiệu điện 120V M 5090 3054 1600 Hình 3.3 Kết tách plasmid Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; Giếng 1-7: dòng T1-T7; Giếng 8: X 46 Kết điện di hình 3.3 cho thấy plasmid bốn dịng vi khuẩn T2, T4, T6 T7 có kích thƣớc lớn plasmid ba dòng lại Có nghĩa bốn dịng đƣợc chèn thêm đoạn DNA ngoại lai có kích thƣớc gần kích thƣớc lý thuyết gen 4CL1 Vì lí trên, bốn dòng vi khuẩn T2, T4, T6 T7 đƣợc chọn để cắt kiểm tra cặp enzym giới hạn đặc hiệu Ba dòng tế bào vi khuẩn (T1, T3 T5) cịn lại có kích thƣớc plasmid giống với plasmid khuẩn lạc xanh (tế bào đƣợc biến nạp vector pCR 2.1 đƣợc chèn DNA ngoại lai song đoạn DNA có kích thƣớc vơ nhỏ khơng phải DNA mục tiêu) nên bị loại bỏ Cặp mồi thiết kế nhân gen mục tiêu 4CL1 có trình tự điểm nhận biết cặp enzym giới hạn BamHI/SacI Do đó, sử dụng cặp enzym để cắt plasmid tách chiết từ bốn dòng vi khuẩn T1, T4, T6 T7 để kiểm tra xem đoạn DNA ngoại lai có phải gen 4CL1 hay không Phản ứng cắt kiểm tra enzym giới hạn đƣợc trình bày phần phƣơng pháp nghiên cứu Sản phẩm phản ứng cắt cặp enzym giới hạn đặc hiệu đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết điện đồ (hình 3.4) cho thấy giếng 2, 3, tƣơng ứng với dòng T1, T4, T6 T7 có sản phẩm cắt cặp enzym giới hạn BamHI/SacI xuất băng vạch tƣơng đƣơng với kích thƣớc sản phẩm PCR (gen 4CL1) tƣơng đƣơng với kích thƣớc lý thuyết gen 4CL1 (1,6kb) Nhƣ vậy, kết luận dịng tế bào vi khuẩn E.coli T1, T4, T6 T7 đƣợc biến nạp mang vector tách dòng tái tổ hợp pCR 2.1 – 4CL1 (đƣợc chèn đoạn gen mục tiêu quan tâm 4CL1) 47 M kb 12,2 4,07 3,05 2,03 1,6 1,01 0,5 Hình 3.4 Kết xử lý plasmid cặp enzym giới hạn BamHI/SacI Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb; Giếng 1: Sản phẩm PCR; Giếng 2-5: dòng T1, T4, T6 T7 3.1.5 Kết xác định trình tự nucleotid gen 4CL1 Để khẳng định chắn dòng vi khuẩn chứa plasmid phân lập đƣợc mang gen mục tiêu 4CL1, tiến hành xác định trình tự nucleotid đoạn DNA vector tách dịng máy đọc trình tự tự động theo nguyên tắc enzym học Sanger Các dịng vi khuẩn có plasmid tái tổ hợp T1, T4, T6 T7 đƣợc dùng để xác định trình tự nucleotid đoạn DNA chèn vào Dƣới hình ảnh nhìn thấy máy đọc trình tự tự động: 48 Hình 3.5 Phổ xác định trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập từ Thơng Mã Vĩ máy đọc trình tự tự động Trình tự nucleotid đoạn chèn đƣợc so sánh với trình tự nucleotid gen 4CL1 Thơng Lửa (Pinus taeda) đƣợc công bố ngân hàng gen quốc tế với mã số đăng kí PTU12012 phần mềm ClustalX GenDoc Kết so sánh (hình 3.6) cho thấy trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập đƣợc từ Thông Mã Vĩ (Pinus massonisna) tƣơng đồng tới 98% so với trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập từ Thông Lửa (Pinus taeda) công bố ngân hàng gen quốc tế Bên cạnh đó, đem so sánh trình tự axít amin đƣợc dịch mã từ gen 4CL1 phân lập từ Thông Mã Vĩ với trình tự axít amin dịch mã từ gen 4CL1 phân lập từ Thơng Lửa cho kết tƣơng đồng tới 99% Từ kết so sánh trên, khẳng định phân lập thành công gen 4CL1 từ Thông Mã Vĩ (Pinus massonisna) với kích thƣớc 1614bp, dịch mã protein có khối lƣợng phân tử 58,5kDa trình tự nucleotid nhƣ hình 3.5 49 Hình 3.6 Kết so sánh trình tự nucleotid gen 4CL1 tách từ Thông Lửa (Pinus taeda) với Thông Mã Vĩ (Pinus massonia) P- Taeda: trình tự nucleotide gen 4CL1 Thơng Lửa, mã số PTU12012 P- Massonia: trình tự nucleotide gen 4CL1 phân lập từ Thơng Mã Vĩ 50 Trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập đƣợc từ Thông Mã Vĩ đƣợc công bố ngân hàng gen giới với mã số đăng kí FJ810495 3.2 Kết biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami 3.2.1 Tạo vector biểu tái tổ hợp mang gen mục tiêu biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu E.coli Rosetta gami Vector biểu pET 21 pQE 30 sau đƣợc xử lý cặp enzym giới hạn BamHI/SacI để mở vịng tạo hai đầu so le có khả bắt cặp với gen 4CL1 đƣợc cắt từ vector tách dòng tái tổ hợp pCR 2.1 - 4CL1 tạo hai đầu dính cặp enzym giới hạn này, nhân tố phản ứng nối enzym T4- DNA ligase Sản phẩm cắt (tạo vector mở vòng đoạn DNA có hai đầu dính) đƣợc tinh kit “Purelink Quick Gel Extract Kit, Cat No K210012” hãng Invitrogen cung cấp Sau tinh sạch, tiến hành phản ứng nối vector biểu cắt mở vòng với gen mục tiêu đƣợc tạo đầu so le khớp với phản ứng nối có tham gia enzym T4-DNA ligase nhiệt độ bắt cặp thích hợp (nhƣ trình bày chi tiết phần phƣơng pháp nghiên cứu) để tạo vector biểu tái tổ hợp mang gen mục tiêu 4CL1 Vector biểu tái tổ hợp vừa tạo đƣợc qua phản ứng nối nhờ enzym T4- DNA ligase đƣợc dùng để biến nạp vào chủng vi khuẩn biểu E.coli Rosetta gami phƣơng pháp sốc nhiệt 42oC Sau biến nạp, dịch khuẩn đƣợc cấy trải mơi trƣờng LB chọn lọc có bổ sung kháng sinh Amp 100µg/ml, Kan 15µg/ml Chloram 34µg/ml Ni đĩa khuẩn 37oC, qua đêm Kết biến nạp vector biểu tái tổ hợp mang gen mục tiêu 4CL1 vào chủng vi khuẩn biểu E.coli Rosetta gami đƣợc thể nhƣ hình 3.7 dƣới 51 Hình 3.7 Kết biến nạp vector biểu vào chủng vi khuẩn biểu E.coli Rosetta gami Kết đĩa khuẩn lạc (hình 3.7) sau biến nạp vector biểu tái tổ hợp mang gen mục tiêu 4CL1 vào chủng biểu cho thấy, chủng vi khuẩn biểu E.coli Rosetta gami đƣợc mang vector tái tổ hợp có gen sản xuất enzym có khả phân hủy kháng sinh Amp có mơi trƣờng LB Bƣớc đầu kết luận rằng, khuẩn lạc E.coli Rosetta gami đĩa thạch đƣợc biến nạp vector biểu tái tổ hợp mang gen quan tâm 4CL1 Để xác định thông tin này, tiến hành nuôi cấy vài khuẩn lạc đĩa thạch để tách plasmid kiểm tra (theo phƣơng pháp nêu phần phƣơng pháp nghiên cứu) Kết tách plasmid đƣợc kiểm tra cách sử dụng cặp enzym giới hạn BamHI/SacI để cắt sản phẩm plasmid vừa tách chiết điện di kiểm tra sản phẩm cắt enzym giới hạn gel agarose 1% khoảng 50- 60 phút dịng điện có hiệu điện 120V (dòng điện chiều) Kết điện di sản phẩm sau cắt plasmid cặp enzym giới hạn BamHI/SacI đƣợc thể hình 3.8 Kết điện di gel agarose 1% thể hình 3.8 cho thấy dòng khuẩn lạc lấy từ đĩa thạch sau tách plasmid dùng cặp enzym giới 52 hạn BamHI/SacI để cắt kiểm tra xuất đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đƣơng với kích thƣớc lý thuyết gen mục tiêu 4CL1 (1,6kb) Từ kết điện di hình 3.8, khẳng định tạo đƣợc vector biểu tái tổ hợp chứa gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami mang vector biểu tái tổ hợp chứa gen mục tiêu 4CL1 Kết cho phép thực nghiên cứu liên quan tới vấn đề biểu gen 4CL1 vi khuẩn E.coli M 5000pb Vector pQE 30 2000bp Gen 4CL1 Hình 3.8 Kết cắt plasmid tách chiết từ chủng vi khuẩn tái tổ hợp cặp enzym giới hạn BamHI/SacI Giếng M: Thang DNA chuẩn; Giếng 1, 2: sản phẩm cắt cặp enzym giới hạn plasmid dòng vi khuẩn đĩa thạch 3.2.2 Kết biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami Nhƣ trình bày phần phƣơng pháp nghiên cứu, thí nghiệm yếu tố nhiệt độ cảm ứng đƣợc cố định để nghiên cứu ảnh hƣởng hai yếu tố thời gian cảm ứng nồng độ chất cảm ứng IPTG Vi khuẩn E.coli thấy nhiều ruột ngƣời, có nghĩa sinh trƣởng phát triển tốt nhiệt độ thể 37oC Vì vậy, thí nghiệm đƣợc cố định nhiệt độ cảm ứng 37oC 53 Gen 4CL1 đƣợc biểu chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami nhƣ miêu tả phần phƣơng pháp với nồng độ chất cảm ứng IPTG khác thời gian cảm ứng khác a Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng IPTG đến khả biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami Thí nghiệm đƣợc tiến hành với ba nồng độ chất cảm ứng IPTG lần lƣợt 0mM, 0,5mM 1mM Khi tiến hành thí nghiệm, nồng độ chất cảm ứng thu mẫu khoảng thời gian khác nhƣ sau: 0h, 1h, 2h 3h Vì thời gian làm khố luận tốt nghiệp có hạn, tơi tiến hành thí nghiệm biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami với vector biểu tái tổ hợp pQE 30 - 4CL1 Kết biểu gen với cảm ứng nồng độ chất cảm ứng thời gian đƣợc thể hình 3.9 dƣới M 10 60 kDa Hình 3.9 Kết điện di SDS-PAGE 12,6% sản phẩm protein biểu theo nồng độ chất cảm ứng IPTG Giếng M: Thang chuẩn protein Giếng 1, 2, mẫu cảm ứng IPTG 1mM lần lƣợt sau 3h, 1h, 0h Giếng 4, 5, 6, 7: cảm ứng IPTG 0,5mM lần lƣợt sau 3h, 2h, 1h, 0h Giếng 8, 9, 10 không cảm ứng IPTG sau 3h, 1h, 0h 54 Kết điện di đồ cho thấy, không cảm ứng chất cảm ứng IPTG gel cho kết khơng có băng vạch protein khoảng 60kDa, đƣợc thể giếng 8, giếng 10 Sử dụng chất cảm ứng IPTG, kết gel cho băng vạch protein khoảng 60kDa rõ ràng sắc nét phù hợp với kích thƣớc lý thuyết sản phẩm protein đƣợc dịch mã từ gen 4CL1, cho thấy gen 4CL1 đƣợc biểu vi khuẩn E.coli (hình 3.9 với giếng từ 1- 7) Sử dụng IPTG nồng độ 0,5mM (giếng 4, 5, 7) cho kết biểu gen 4CL1 tốt so với sử dụng nồng độ IPTG 1mM (giếng 1, 3) Từ kết hình 3.9, tạm thời khẳng định rằng: biểu gen 4CL1 vi khuẩn E.coli Rosetta gami sử dụng vector biểu pQE 30 UA cho thấy sử dụng chất cảm ứng IPTG có hiệu Nồng độ chất cảm ứng IPTG thích hợp cho việc biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami 0,5mM b Ảnh hƣởng thời gian cảm ứng đến khả biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami Sau xác định đƣợc nồng độ chất cảm IPTG ứng đạt hiệu cao cho việc biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami 0,5mM, tiếp tục tiến hành thí nghiệm nghiên cứu xác định xác ảnh hƣởng yếu tố thời gian tới khả biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami Trong thí nghiệm này, yếu tố đƣợc cố định nhiệt độ cảm ứng 37oC nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5mM, lấy mẫu thời điểm khác để chọn thời điểm thích hợp cho việc biểu gen mục tiêu 4CL1 Sau thu mẫu, tiến hành xử lý mẫu theo phƣơng pháp xử lý đƣợc trình bày chi tiết phần phƣơng pháp nghiên cứu Sản phẩm protein tách chiết đƣợc kiểm tra điện di SDS-PAGE Các phân tử protein đƣợc thể thành dạng băng vạch gel poly acrylamid sau nhuộm với dung dịch Coomassie Blue rửa dung dịch tẩy rửa gel điện di protein 55 Kết điện di protein đƣợc thể hình 3.10 dƣới M 10 60kDa Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm protein biểu theo thời gian gel SDS-PAGE Giếng M: Thang chuẩn protein Giếng 1, 2, 3, 4, 5: mẫu không cảm ứng IPTG thời điểm 0h, 1h, 3h, 5h, 16h Giếng 6, 7, 8, 9, 10: mẫu cảm ứng IPTG 0,5 mM thời điểm 0h, 1h, 3h, 5h, 16h Bản điện di hình 3.10 cho thấy mẫu không cảm ứng IPTG không cho băng vạch khoảng 60 kDa (giếng 1, 2, 3, 5) mẫu có cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5mM cho băng vạch protein khoảng 60 kDa (giếng 6, 7, 8, 10) So sánh kết mẫu cảm ứng IPTG nồng độ 0,5mM với thời điểm khác cho thấy giếng (cảm ứng IPTG 0,5mM sau 1h nhiệt độ 37oC) cho hình ảnh đậm rõ ràng Điều cho thấy, biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami nhiệt độ 37oC sử dụng chất cảm ứng IPTG với nồng độ 0,5mM thời điểm 1h sau cảm ứng đạt đƣợc hiệu biểu gen cao 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu đƣợc nhƣ trên, rút số kết luận nhƣ sau: 1.1 Phân lập thành cơng gen 4CL1 từ Thơng Mã Vĩ, có kích thƣớc 1614bp Trình tự nucleotid gen 4CL1 mà phân lập đƣợc từ Thông Mã Vĩ tƣơng đồng tới 98% so với trình tự nucleotid gen 4CL1 phân lập từ Thông Lửa (mã số đăng kí PTU12012) đƣợc cơng bố ngân hàng gen giới (NCBI) trình tự axít amin tƣơng đồng tới 99% 1.2 Biểu đƣợc gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami sử dụng vector pQE 30 – UA với nhiệt độ cảm ứng 37oC, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5mM thời gian cảm ứng Kiến nghị 2.1 Tiếp tục nghiên cứu tối ƣu hóa biểu gen 4CL1 vi khuẩn E.coli nghiên cứu đặc tính protein tái tổ hợp 2.2 Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen 4CL1 phục vụ công tác tạo giống lâm nghiệp biến đổi gen có chất lƣợng gỗ tốt 57 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan phân lập gen 1.1.1 Vai trò trồng biến đổi gen 1.1.2 Tổng quan nghiên cứu tách dòng gen 1.2 Tổng quan nghiên cứu biểu gen 11 1.2.1 Biểu gen 11 1.2.3 Các hệ thống vector biểu 14 1.3 Tổng quan gen mục tiêu 4CL1 17 1.3.1 Đặc điểm gen mục tiêu 17 1.3.2 Tình hình nghiên cứu phân lập gen 4CL1 21 1.3.3 Tình hình nghiên cứu biểu gen 4CL 23 Chƣơng NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.2 Vật liệu nghiên cứu 26 2.2.1 Nguyên liệu 26 2.2.2 Hoá chất 27 2.2.3 Thiết bị dụng cụ 27 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập gen 27 2.3.2 Biểu gen 4CL1 vi khuẩn E.coli Rosetta gami 34 a Thiết kế vector biểu gen 4CL1 34 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40 3.1 Kết phân lập gen 4CL1 từ Thông Mã Vĩ 40 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số từ Thông Mã Vĩ 40 3.1.2 Kết tách mRNA từ RNA tổng số 41 3.1.3 Kết tổng hợp cDNA nhân gen 4CL1 42 58 3.1.4 Kết sàng lọc gen mục tiêu 4CL1 44 3.1.5 Kết xác định trình tự nucleotid gen 4CL1 48 3.2.1 Tạo vector biểu tái tổ hợp mang gen mục tiêu biến nạp vào 51 Hình 3.8 Kết cắt plasmid tách chiết từ chủng vi khuẩn 53 tái tổ hợp cặp enzym giới hạn BamHI/SacI 53 Giếng M: Thang DNA chuẩn; Giếng 1, 2: sản phẩm cắt cặp enzym giới hạn plasmid dòng vi khuẩn đĩa thạch 53 3.2.2 Kết biểu gen 4CL1 chủng vi khuẩn E.coli Rosetta gami 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 Kết luận 57 Kiến nghị 57 59