Nghiên cứu quy trình tạo cây mướp đắng (momordica charantia l ) đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn in vitro tt

i DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI STT Họ tên Vai trò TS Nguyễn Minh Lý Chủ nhiệm đề tài TS Trịnh Đăng Mậu Thư ký khoa học ThS Vũ Đức Hoàng Thành viên ii Đơn vị công tác Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm-Đại học Đà Nẵng MỤC LỤC DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI i MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU v INFORMATION OF RESEARCH RESULTS viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.2 Phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Kỹ thuật trồng mướp đắng 1.2.2 Thu mẫu tiền xử lý khử trùng nụ hoa 1.2.3 Phương pháp xác định giai đoạn phát triển tiểu bào tử 1.2.4 Phương pháp nuôi cấy bao phấn phát sinh callus môi trường dinh dưỡng nhân tạo 1.2.5 Phương pháp tái sinh chồi rễ từ callus bao phấn 1.2.6 Phương pháp tách chiết DNA tổng số, PCR điện di 1.2.7 Phương pháp xử lý số liệu CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1 Lựa chọn trồng giống mướp đắng làm nguồn cho bao phấn 2.2 Hiệu phương pháp khử trùng nụ hoa mướp đắng 2.3 Ảnh hưởng yếu tố nội ngoại sinh đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng 2.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát sinh callus 2.3.2 Ảnh hưởng kiểu gen đến khả phát sinh callus 2.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả phát sinh callus 2.3.4 Ảnh hưởng giai đoạn phát triển tiểu bào tử (hạt phấn) đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng 13 2.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng 15 2.5 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh rễ từ callus bao phấn mướp đắng 16 2.6 Xác định mẫu rễ đơn bội phát sinh từ tiểu bào tử 16 3.7 Quy trình tạo callus từ bao phấn mướp đắng in vitro 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: AC : B5 : BAP : bp : cs: DH : ĐHST: GA3 : IAA : IBA : MS : NAA: NS : TDZ : Dichlorophenoxyacetic acid Activated carbon Gamborg 6-benzylaminopurine Base pair Cộng Doubled Haploid Điều hòa sinh trưởng Gibberellic acid Indole-3-Acetic Acid Indole-3-butyric acid Murashige and Skoog 1-Naphthaleneacetic acid Năng suất Thidiazuron iv THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình tạo Mướp đắng (Momordica charantia L.) đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn in vitro - Mã số: B2017-ĐN03-13 - Chủ nhiệm: TS Nguyễn Minh Lý - Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Sư phạm - Thời gian thực hiện: 06/2017 – 05/2019 Mục tiêu đề tài Xác định ảnh hưởng yếu tố nội sinh ngoại sinh đến hiệu nuôi cấy bao phấn mướp đắng in vitro, góp phần xây dựng quy trình tạo mướp đắng đơn bội Tính tính sáng tạo Nghiên cứu đưa dẫn liệu khoa học ảnh hưởng nhân tố nội sinh ngoại sinh đến phát sinh callus bao phấn mướp đắng (Momordica charantia L.) Đặc biệt, xác định giai đoạn đơn nhân sớm đơn nhân giai đoạn phát triển tối ưu tiểu bào tử (hạt phấn) để đưa vào nuôi cấy phát sinh callus Lần đầu tiên, tái sinh rễ mướp từ callus bao phấn Kết nghiên cứu Giống mướp đắng xanh đen Kami 999 thích hợp trồng xã Hòa Khương, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng vào vụ thu - đông (7/2018 – 11/2018) với suất thực tế đạt 20,50 ± 1,03 tấn/ha Cơng thức khử trùng nụ hoa mướp đắng có hiệu cao cồn 70% 30 giây kết hợp với NaOCl 5% phút với tỷ lệ nhiễm 10,62±1,32% tỉ lệ hạt phấn sống đạt 92,34±1,95% Tiền xử lý mẫu nụ hoa 4°C 24 làm tăng tỉ lệ tạo callus từ bao phấn mướp đắng Trong đó, xử lý mẫu bao phấn sau cấy 32°C kìm hãm trình phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Mơi trường ni cấy bao phấn có ảnh hưởng quan trọng đến hình thành bao phấn từ callus mướp đắng Trong đó, mơi trường tối ưu để ni cấy bao phấn mướp đắng giống Diago 26 MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 1,5 mg/l BAP (đạt 93,75±2,55%) Bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy kìm hãm phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Kiểu gen giai đoạn phát triển tiểu bào tử có ảnh hưởng tới phát sinh callus từ bao phấn Giai đoạn phát triển tiểu bào tử tối ưu để tiến hành nuôi cấy bao phấn đơn nhân sớm đơn nhân Sử dụng cơng thức mơi trường chất điều hịa sinh trưởng sử dụng nghiên cứu, không quan sát thấy tái sinh chồi từ callus bao phấn v mướp đắng Trong đó, tỉ lệ tái sinh rễ từ callus mướp đắng đạt cao (89,7±5,24%) bổ sung 2,5 mg/l IBA vào môi trường nuôi cấy Tỉ lệ rễ đơn bội đạt 4% tổng số rễ tái sinh từ callus bao phấn mướp đắng giống Diago 26 Sản phẩm 5.1 Sản phẩm khoa học - 01 báo tạp chí nước danh mục tính điểm Hội đồng chức danh giáo sư nhà nước: Nguyễn Minh Lý, Võ Châu Tuấn, Nguyễn Thị Như Thảo (2017) Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng (Momordica charantia L.) in vitro Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 12: 67-72 - 01 báo quốc tế tạp chí thuộc danh mục Scopus: Nguyen M.L., Ta T.H.T., Huyen T.N.B.T., Voronina A.V (2019) Anther-derived callus formation in bitter melon (Momordica charantia L.) As influenced by microspore development stage and medium composition Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya [Agricultural Biology], 54(1): 140-148 - 01 thạc sĩ bảo vệ thành công luận văn chuyên ngành sinh thái học với đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng suất giống mướp đắng xanh đen điều kiện sinh thái huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng” 5.2 Sản phẩm ứng dụng + 01 quy trình tạo callus từ bao phấn mướp đắng in vitro + Mẫu callus tái sinh từ bao phấn mướp đắng in vitro Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết nghiên cứu khả ứng dụng 6.1 Hiệu giáo dục đào tạo: Đề tài nghiên cứu đóng góp phần vào việc đào tạo kiến thức chuyên ngành kĩ nghiên cứu khoa học cho sinh viên, học viên tham gia theo học chuyên ngành Công nghệ sinh học Sinh thái học, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng Ngồi ra, kết từ đề tài cịn nguồn tư liệu tham khảo có giá trị cho việc giảng dạy lý thuyết thực hành học phần có liên quan 6.2 Hiệu kinh tế - xã hội: Kết nghiên cứu đề tài bước đầu góp phần hồn thiện quy trình sản xuất mướp đắng đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn in vitro Khi quy trình hồn thiện cho phép rút ngắn trình chọn tạo giống mướp đắng có suất phẩm chất tốt 6.3 Phương thức chuyển giao khả ứng dụng: Kết nghiên cứu đề tài chuyển giao cho Viện nghiên cứu trồng nông nghiệp để tiến hành nghiên cứu sâu việc xây dựng quy trình tạo mướp đắng đơn bội vi Đà nẵng, ngày tháng Cơ quan chủ trì năm 2019 Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Minh Lý vii INFORMATION OF RESEARCH RESULTS General information: - Project title: Study on production of haploid bitter melon (Momordica charantia L.) plants using anther culture in vitro - Code number: B2017-ĐN03-13 - Implementing Institution: University of Science and Education - Study time: 06/2017 – 05/2019 Objective: The objective of the research is to identify endogenous and exogenous factors affecting the effectiveness of the bitter melon anther culture in vitro contributing to producing haploid bitter melon (Momordica charantia L.) plants Creativeness and innovativeness: This research provided new scientific information about the effects of the endogenous and exogenous factors on callus formation from the bitter melon anther In particular, the early uninucleate and mid uninucleate stages were determined as the optimal development phages of microspores This is the first time to regenerate the bitter melon roots from the anther callus Research results The bitter green melon hybrid Kami 999 is suitable for planting in Hoa Khuong commune, Hoa Vang district, Da Nang city in the autumn-winter season (7/2018 - 11/2018) with the yield of 20.50 tons/ha The most effective method of sterilizing bitter melon flower buds was obtained with alcohol 70% for 30 seconds in combination with NaOCl 5% for minutes The infection rate and the ratio of alive microspores were 10.62 ± 1.32% and 92.34 ± 1.95%, respectively Pretreatment of flower buds at 4°C for 24 h had resulted in increasing the rate of callus formation from anther Meanwhile, treating anther samples after transplanting at 32°C inhibited the callus formation from bitter melon anther Anther culture medium had an important effect on the callus induction The highest ratio of callus formation was observed on the medium MS with 1.0 mg/l 2,4-D and 1.5 mg/l BAP (93.75 ± 2.55 %) Adding activated carbon to the culture medium inhibited callus induction from bitter melon anther The genotype and microspore development stage affected the callus formation from anther The optimal microspore stages for anther culture were early and later uninuclear Using MS medium and growth regulators were not lead to regenerate buds from bitter melon callus Meanwhile, the root regeneration rate from callus was the highest (89.7 ± 5.24%) on the medium MS with 2.5 mg/l IBA viii The ratio of haploid roots reached 4% of the total regenerated roots from the anther dervided callus Products: 5.1 Scientific products - A research paper was published: Nguyen M.L., Vo C.T., Nguyen T.N.T (2017) Effect of plant growth regulators on callogenesis from anther culture of bitter gourd (Momordica charantia L.) Science and Technology Journal of Agriculture and Rural Development, 12: 67-72 - A research paper was published in Scopus journal: Nguyen M.L., Ta T.H.T., Huyen T.N.B.T., Voronina A.V (2019) Anther-derived callus formation in bitter melon (Momordica charantia L.) As influenced by microspore development stage and medium composition Sel’skokhozyaistvennaya Biologiya [Agricultural Biology], 54(1): 140-148 - Supervising graduate student to complete the Master thesis 5.2 Other products - 01 the procedure of callus formation from bitter melon anthers - Callus samples in the laboratory Effectiveness, transfer alternatives of research results and applicability 6.1 Educational and training efficiency This research has contributed to training advanced knowledge and research skills for undergraduate as well as graduate students of Ecology and Biotechnology at The University of Da Nang, University of Science and Education Moreover, the information from research results is valuable references resource for teaching theory as well as the practice of relevant modules 6.2 Economic and social efficiency The research results have initially contributed to improving the production process of haploid bitter melon plants by anther culture in vitro The completed procedure of anther from callus formation will allow reducing the breeding process of bitter melon with good productivity and quality, which contribute to socio-economic development 6.3 Transfer alternatives and applicability The research results are able to be transfered to the Institutes studying on plants and agriculture to carry out further researches on completing the process of haploid bitter melon plants ix MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Mướp đắng hay Khổ qua (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) loại hàng năm Cây có nguồn gốc từ Ấn Độ, Nam Trung Quốc trồng rộng rãi vùng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới Nam Mỹ, Châu Á Châu Phi (Ahmad et al., 2016; Gupta et al., 2016) Tại Việt Nam, trồng hầu hết tỉnh từ đồng bằng đến trung du với diện tích khoảng 27.000 vào năm 2013 suất trung bình đạt 16,0 tấn/ha (Nguyễn Quốc Hùng cs, 2016) Mướp đắng loại rau ăn sử dụng phổ biến với giá trị dinh dưỡng cao Bên cạnh đó, mướp đắng cịn có giá trị dược liệu sử dụng thuốc y học cổ truyền, điều chế loại thuốc y học chữa bệnh tiểu đường, bệnh gút, ung thư (Joseph et al., 2013; Arafat et al., 2016) Phân tích hóa học cho thấy, mướp đắng có chứa saponin (momordicin momordin) có khả kháng khuẩn, kháng nấm kháng virus kháng sâu (Poolperm et al., 2017) Hiện nay, giới 80% mướp đắng đưa vào sản xuất giống lai F1, nhiên Việt Nam sử dụng chủ yếu giống địa phương Tuy có khả thích nghi cao, khả kháng bệnh suất lại thấp (Behera et al., 2010) Ngoài ra, đa số giống lai F1 sử dụng giống nhập ngoại có số giống lai lai tạo viện trung tâm nghiên cứu nước Việc hạn chế số lượng giống lai F1 mướp đắng xác định trình chọn lại giống kéo dài, phức tạp, đặc biệt q trình tạo dịng bố mẹ chủng (Bal et al., 2012) Đối với phương pháp truyền thống cần tiến hành thụ phấn cưỡng chọn lọc liên tục qua 5-7 hệ để thu dòng thuần, nhiên, dòng chưa trạng thái đồng hợp tử tuyệt đối tất gen (Monakhos et al., 2014; Usman et al., 2015) Trên giới phương pháp tạo đơn bội kép (doubled haploid – DH) áp dụng để đẩy nhanh q trình tạo dịng 200 loại giống trồng khác nhau, đặc biệt giống họ cải lương thực (Foster et al., 2007; Dwivedi et al., 2015) Các dòng đơn bội kép đồng hợp tử tuyệt đối tất gen, tạo thời gian ngắn (1 hệ) Nuôi cấy bao phấn in vitro kỹ thuật phổ biến sử dụng để tạo đơn bội kép số loài phương pháp hiệu Thành công phương pháp phụ thuộc vào nhiều yếu tố, kiểu gen, giai đoạn phát triển tiểu bào tử , thành phần mơi trường, chất kích thích sinh trưởng, điều điện ni cấy bao phấn (Qiao et al., 2013) Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu tạo đơn bội tương đối hạn chế số đối tượng lúa, ngô, cải 1.2.4 Phương pháp nuôi cấy bao phấn phát sinh callus Bao phấn với giai đoạn phát triển tiểu bào tử phù hợp tách tủ cấy an toàn sinh học bằng kim cấy chuyển vào chai môi trường dinh dưỡng giữ 25°C với số chiếu sáng thay đổi theo thí nghiệm (16 sáng (2000 lux)/8 tối tối hồn tồn) Mơi trường ni cấy (MS B5) có chứa 30 g/l sucrose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 chất ĐHST NAA, TDZ, IBA, 2,4-D, kinetin, BAP đơn lẻ kết hợp nồng độ khác Để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ cao đến khả phát sinh callus, sau cấy, bao phấn giữ 32°C tủ ấm thời gian 24, 48, 36, 72, 96 Quan sát cảm ứng hình thái callus quan sát thời gian tuần sau ni cấy độ phóng đại ×40 kính hiển vị soi 1.2.5 Phương pháp tái sinh chồi rễ từ callus bao phấn Để tái sinh chồi rễ, callus phát sinh chuyển sang mơi trường có bổ sung chất ĐHST NAA, TDZ, IBA, kinetin, BAP đơn lẻ kết hợp nồng độ khác Các mẫu callus sau chuyển sang môi trường tái sinh chồi sẽ nuôi nhiệt độ 25°C với số chiếu sáng 16 sáng (2000 lux)/8 tối Cảm ứng phát sinh phôi, tái sinh chồi rễ quan sát kính hiển vi soi độ phóng đại ×40 Hiệu cơng thức thí nghiệm tính theo tỉ lệ phần trăm chồi rễ phát sinh từ callus 1.2.6 Phương pháp tách chiết DNA tổng số, PCR điện di Mẫu rễ phát sinh từ callus bao phấn tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB có cải tiến (Green and Sambrook, 2012) Cân 0,2 g mẫu callus mẫu rễ riêng lẻ để tách chiết DNA bằng dung dịch đệm CTAB 2% ủ bể ổn nhiệt 60°C vòng 60 phút DNA tinh bằng dung dịch C:I (24 chloroform : iso amyl alcohol) kết tủa bằng isopropanol Mẫu DNA tách chiết bảo quản lạnh -20ºC Thành phần phản ứng PCR tích 20 l: Bao gồm dung dịch đệm Master mix PCR 2X; 200 nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymeraza 40 ng DNA tổng số Chu trình nhiệt gồm 95°C, phút, chu kỳ lặp lại 35 vòng gồm 94°C, 30 giây; 55°C, 30 giây mồi SSR 50°C, 30 giây; 72°C, 30 giây 72°C, phút bảo quản mẫu 4°C DNA tổng số sản phẩm PCR kiểm tra bằng điện di gel Agarose 0,8 %; Đệm TAE 0,5 X; 90V; 120 mA; 30 phút Kết soi máy phát tia UV, chụp lại hình ảnh 1.2.7 Phương pháp xử lý số liệu Mỗi cơng thức thí nghiệm bao gồm 10 bình, bình chứa 12 bao phấn Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Số liệu nghiên cứu xử lý bằng phần mềm IBM SPSS Statistics 22 Sự sai khác giá trị trung bình có ý nghĩa thống kê kiểm định bằng phương t-test với p ≤ 0,05 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1 Lựa chọn trồng giống mướp đắng làm nguồn cho bao phấn Quá trình khảo sát vùng trồng mướp đắng Quảng Nam Đà Nẵng cho thấy hai giống mướp đắng lai F1 (F1 Diago 26 TN 187) giống đưa vào sản xuất rộng rãi nhiều năm có khả thích nghi với điều điện khí hậu thổ nhưỡng địa phương Chính vậy, giống sử dụng làm nguồn cung cấp bao phấn cho q trình ni cấy in vitro Giống mướp đắng xanh đen Kami 999 loại giống có nguồn gốc từ Thái Lan trình thử nghiệm Việt Nam Để sử dụng giống làm nguồn cho bao phấn cần tiến hành tiến hành đánh giá mức độ thích nghi giống Quảng Nam-Đà Nẵng Trong nghiên cứu khảo sát khả sinh trưởng, phát triển suất giống xã Hòa Khương, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng 2.1.1 Thời gian hoàn thành giai đoạn sinh trưởng, phát triển giống mướp đắng xanh đen Kami 999 Đánh giá thời gian hoàn thành giai đoạn sinh trưởng phát triển thực theo đặc điểm: thời gian bắt đầu bung tua tính từ thời điểm gieo trồng, thời gian bắt đầu phân nhánh, thời gian bắt đầu hoa cái, thời gian thu lần đầu hoàn thành thu hoạch mùa vụ (Nguyễn Quốc Hùng cs, 2016) Kết thu cho thấy, thời gian sinh trưởng phát triển giống nghiên cứu có sai khác có ý nghĩa thống kê mùa vụ Các giai đoạn bung tua (17,0±0,4 ngày) phân nhánh (22,8±0,78 ngày) giống mướp đắng vụ thu – đông bắt đầu sớm số vụ Điều dẫn đến thời gian bắt đầu hoa quan sát sớm sau 33,40±0,69 ngày, thời gian bắt đầu cho thu hoạch sau 48,7±0,99 ngày Trong đó, thời gian sinh trưởng giống F1 Kami 999 bị kéo dài vụ xuân với thời gian bắt đầu bung tua sau 26,0±2,92 ngày, thời gian bắt đầu phân nhánh – 31,2±0,78 ngày, thời gian bắt đầu hoa – 49,8±0,78 ngày, thời gian thu bắt đầu sau – 64,0±0,81 Bên cạnh đó, khoảng thời gian thu hoạch giống nghiên cứu vụ có khác biệt Thời gian thu hoạch giống vụ thu-đông dài (gần 75,9 ngày), vụ đông 20,9 ngày vụ xuân 28,3 ngày Như vậy, vụ thu-đông, giống mướp đắng xanh đen Kami 999 có thời gian sinh trưởng, phát triển diễn sớm nhất, đồng thời, thời gian cho thu hoạch thời gian hoàn thành chu kỳ sống kéo dài 2.1.2 Đặc điểm yếu tố cấu thành suất suất giống mướp đắng xanh đen Kami 999 Để nghiên cứu ảnh hưởng mùa vụ trồng đến yếu tố cấu thành suất suất giống mướp đắng xanh đen Kami 999 vụ trồng khác nhau, tiêu khối lượng trung bình quả, số quả/cây, suất cá thể, suất lý thuyết suất thực tế giống đánh giá Kết nghiên cứu trình bày bảng 2.1 cho thấy, số thực thu/cây, suất cá thể, suất lý thuyết suất thực tế giống đạt giá trị cao vụ thu-đông, tương ứng 16,4±1,03 quả, 4,18±0,11 kg/cây, 26,12±1,68 tấn/ha, 20,50±1,03 tấn/ha Trong tiêu hai vụ đơng xuân tương đồng mặt thống kê Kết đánh giá suất yếu tố cấu thành suất thu tương thích với đặc điểm sinh trưởng phát triển phân tích mục 2.1.1 Bảng 2.1 Các tiêu cấu thành NS NS giống mướp đắng xanh đen Kami 999 trồng đất cát pha mùa vụ khác Mùa vụ Số /cây (quả) Khối lượng TB (g) NS cá thể (kg/cây) NS lý thuyết (tấn/ha) NS thực tế (tấn/ha) Thu – đông 16,4±1,03a 200±1,71a 4,18 ±0,11a 26,1±1,68a 20,50±1,03a Đông 10,2±1,03b 237± 9,48b 3,24±0,27b 20,2±1,69b 15,07±1,26b 9,6±0,84b 236±8,43b 2,99±0,14 b 18,7±9,91b 14,1±1,05b Xuân Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Như vậy, kết nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển suất giống mướp đắng xanh đen Kami 999 qua mùa vụ trồng cho thấy, giống thử nghiệm thích hợp trồng địa bàn xã Hòa Khương, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng vào vụ thu-đông (7/2018 – 11/2018) với suất thực tế đạt 20,50±1,03 tấn/ha Chính vậy, việc nghiên cứu tạo dòng đơn bội đơn bội kép từ giống cung cấp vật liệu di truyền ban đầu quan trọng trình chọn tạo giống 2.2 Hiệu phương pháp khử trùng nụ hoa mướp đắng Mẫu nụ hoa từ giống lai F1 Diago 26, F1 TN 187, F1 Kami 999 khử trùng theo công thức khác thành phần chất sử dụng Tỉ lệ mẫu nhiễm tỉ lệ hạt phấn sống tiểu bào tử (hạt phấn) đánh giá sau tuần nuôi cấy (bảng 2.2) Kết cho thấy, khả khử trùng cao (tỉ lệ mẫu nhiễm - 10,62%) đạt sử dụng công thức cồn 70%, 30 giây, NaOCl 5%, phút Sử dụng cồn 70%, phút có tỉ lệ nhiễm cao (40,19%), sau Cồn 70º, 30 giây; H2O2 40%, phút (40,19±1,60%) cồn 70%, 30 giây; HgCl2 0,1%, phút (20,50±2,25) Trong đó, tỉ lệ hạt phấn sống công thức khử trùng sử dụng cồn, NaOCl, H2O2 khơng có khác biệt đạt 90%, nhiên, HgCl2 lại làm giảm tỉ lệ hạt phấn sống xuống cịn 85,33±1,34% Như vậy, cơng thức khử trùng nụ hoa cồn 70% - 30 giây, rửa lại bằng nước cất vơ trùng, sau tiếp tục khử trùng bằng NaOCl nồng độ 5% phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng lần công thức khử trùng tối ưu nụ hoa mướp đắng sử dụng để tiến hành nghiên cứu khác đề tài Bảng 2.2 Hiệu công thức khử trùng nụ hoa mướp đắng Tỉ lệ nhiễm Tỉ lệ hạt phấn (%) sống (%) Cồn 70%, phút 60,37±3,15a 94,67±2,21a 10,62±1,32d Cồn 70%, 30 giây; NaOCl 5%, phút 92,34±1,95a b Cồn 70%, 30 giây; H2O2 40%, phút 30,19±1,60 90,10±2,20a c Cồn 70%, 30 giây; HgCl2 0,1%, phút 15,50±2,25 85,33±1,34b Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Cơng thức khử trùng 2.3 Ảnh hưởng yếu tố nội ngoại sinh đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng 2.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát sinh callus 2.3.1.1 Ảnh hưởng thời gian tiền xử lý nụ hoa nhiệt độ 4°C đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Các nụ hoa giống lai F1 Diago 26, F1 TN 187, F1 Kami 999 trước vô mẫu bảo quản 4°C khoảng thời gian khác Kết cho thấy tỉ lệ callus phát sinh có sai khác cơng thức thí nghiệm (Bảng 2.3) Trong đó, xử lý nụ hoa thời gian 24 làm tăng khả phát sinh callus từ bao phấn (51,11±2,53%), nhiên tăng thời gian tiền xử lý mẫu, tỉ lệ phát sinh callus lại giảm dần, điều chứng tỏ xử lý lạnh lâu (trên 24 giờ) sức sống bao phấn bị giảm Bảng 2.3 Ảnh hưởng thời gian tiền xử lý nụ hoa 4ºC đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Thời gian tiền xử lý Tỷ lệ phát sinh callus Hình thái callus bao phấn 4ºC (giờ) (%) 30,67±2,23b Kết khối chặt, màu vàng 24 51,11±2,53a Kết khối chặt, màu vàng 48 40,43±3,16b Kết khối chặt, màu vàng 72 20,81±1,34c Kết khối chặt, màu vàng Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Như vậy, việc tiền xử lý lạnh bao phấn 4oC trước ni cấy thời gian 24 có hiệu tăng cường tỉ lệ phát sinh callus mướp đắng sử dụng nghiên cứu đề tài 2.3.1.2 Ảnh hưởng thời gian xử lý bao phấn nhiệt độ 32°C đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Bao phấn sau cấy môi trường giữ nhiệt độ 32°C khoảng thời gian khác quan sát phát sinh callus Kết cho thấy nhiệt độ 32°C làm giảm khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Sau 24 tỉ lệ phát sinh callus giảm 30,81±2,11%, đặc biệt sau 96 xử lý mẫu không quan sát phát sinh callus Ngoài ra, callus phát sinh sau xử lý 32°C có màu vàng đậm so với mẫu khơng xử lý 2.3.2 Ảnh hưởng kiểu gen đến khả phát sinh callus Tỷ lệ bao phấn cảm ứng tạo callus có liên quan chặt chẽ với kiểu gen cung cấp bao phấn Trong nghiên cứu này, đánh giá khả phát sinh callus từ bao phấn giống mướp đắng lai F1 Diago 26, F1 TN 187, Kami 999 Kết cho thấy tỷ lệ phát sinh callus có khác biệt giống, giá trị cao đạt giống F1 Diago 26 (51,11±2,53%), giống F1 TN 187 (39,52±1,56%), giống Kami 999 (11,22 ± 1,18%) (Bảng 3.6) Hình thái callus giống khơng có khác biệt Bảng 2.4 Tỷ lệ phát sinh callus từ bao phấn giống mướp đắng Tên giống Tỷ lệ phát sinh callus (%) Hình thái callus F1 TN 187 39,52±1,56b Kết khối chặt, màu vàng F1 Diago 26 51,11±2,53a Kết khối chặt, màu vàng Kami 999 11,22 ± 1,18b Kết khối chặt, màu vàng Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 2.3.3 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng 2.3.3.1 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng a Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng bổ sung riêng lẻ đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Các chất điều hòa sinh trưởng 2,4-D; kinetin; BAP bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao phấn với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l riêng lẻ Kết cho thấy, khơng có phát sinh callus từ môi trường thử nghiệm Đặc biệt, bao phấn mướp đắng khơng bị hóa nâu sau tuần ni cấy giữ nguyên trạng thái cấy Như vậy, chất điều hòa sinh trưởng tác động riêng rẽ khơng có tác dụng kích thích hình thành callus từ bao phấn giống mướp đắng lai Diago 26 b Ảnh hưởng kết hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng - 2,4-D kết hợp với kinetin Trong thí nghiệm, khảo sát hiệu kết hợp 2,4-D (nồng độ 0,5-2,0 mg/l) kinetin (nồng độ 0,5-3,0 mg/l) cảm ứng phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng giống Diago 26 Kết cho thấy, bổ sung 2,4-D nồng độ 0,5 mg/l 1,5 mg/l phát sinh callus nồng độ kinetin (Bảng 2.5) Tại nồng độ 2,4-D lên 1,0 mg/l hình thành callus đạt giá trị cao (28,89±1,12%) nồng độ kinetin 0,5 mg/l Tiếp tục tăng nồng độ kinetin, quan sát thấy tỉ lệ tạo callus giảm dần không xuất callus nồng độ từ 1,5 mg/l Tỉ lệ callus đạt cao (66,67±3,62%) kết hợp 2,0 mg/l 2,4-D 2,0 mg/l kinetin Hình thái callus thu tất cơng thức thí nghiệm có màu vàng đậm, nhiên thời gian phát sinh callus có khác biệt Với công thức (2,0 mg/l 2,4-D 2,0 mg/l kinnetin) quan sát phát sinh callus thời gian sớm tuần sau nuôi cấy Tại nồng độ 1,0 mg/l 2,4-D quan sát thấy hình thành callus sau tuần ni cấy Tuy nhiên, callus phát sinh mơi trường có kết hợp 2,4-D kinetin bị hóa nâu nhanh sau tuần sau phát sinh Chính vậy, mơi trường khơng sử dụng nghiên cứu đề tài - 2,4-D kết hợp với TDZ Trong nghiên cứu này, đánh giá hiệu việc sử dụng kết hợp 2,4-D (nồng độ 0,1-2,0 mg/l) TDZ (nồng độ 0,1-0,75 mg/l) phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Trong số 20 nghiệm thức thí nghiệm, có cho nghiệm thức kết hợp 0,1 mg/l 2,4-D 0,5 mg/l TDZ cho phép thu callus sau tuần nuôi cấy với tỷ lệ 37,78% với đặc điểm hình thái kết khối chặt, màu vàng Tỉ lệ phát sinh callus thấp kết hợp (2,0 mg/l 2,4-D 2,0 mg/l kinnetin) thời gian bắt đầu phát sinh callus chậm Chính vậy, cơng thức khơng sử dụng thí nghiệm đề tài - 2,4-D kết hợp với BAP Tương tự kết hợp 2,4-D TDZ, nghiệm thức thí nghiệm phối hợp 2,4-D BAP, có nghiệm thức cho phép thu callus với tỷ lệ phát sinh 40,0±3,12% 38,6±2,27% với kết hợp 1,0 mg/l 2,4-D + 1,5 mg/l BAP 1,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BAP Tuy nhiên, thời gian bắt đầu phát sinh callus sớm so với trường hợp TDZ tuần Trên mơi trường có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D + 1,5 mg/l BAP callus có màu vàng, kết khối chặt, môi trường chứa 1,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l BAP callus có màu xanh Có thể kết luận, TDZ BAP kết hợp với 2,4-D có hiệu hạn chế việc nâng cao tỷ lệ phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng - NAA kết hợp với BAP Ở nghiên cứu này, kết hợp NAA (nồng độ 0,2 mg/l) BAP (0,6 mg/l) cho phép thu tỷ lệ phát sinh callus từ 10 bao phấn đạt 51,11±2,53% sau tuần nuôi cấy Sự kết hợp BAP NAA nồng độ khác cho thấy tượng phát sinh callus Bảng 2.5 Ảnh hưởng kết hợp chất điều hòa sinh trưởng đến phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng giống Diago 26 Chất ĐHST (mg/l) Tỷ lệ phát sinh callus (%) 2,4-D (1,0) + kinetin (0,5) 2,4-D (1,0) + kinetin (1,0) 2,4-D (2,0) + kinetin (2,0) 2,4-D (1,0) + TDZ (0,5) 2,4-D (1,0) + BAP (1,5) 2,4-D (1,5) + BAP (1,0) NAA (0,6) + BAP (0,2) NAA(1,0)+BAP(0,5)+kinetin(1,0) NAA(1,5)+BAP(0,5)+kinetin(1,0) 28,89±2,12e 17,78±1,52f 66,67±3,62b 37,78±2,24d 80,0±3,12a 60,6±2,27b 51,11±2,53c 50,21±3,16c 80,43±4,15a Thời gian phát sinh tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần tuần Hình thái callus Chặt, vàng đậm Chặt, vàng đậm Chặt, vàng đậm Chặt, vàng Chặt, vàng Chặt, xanh Chặt, vàng xanh Xốp, vàng xanh Xốp, vàng xanh NAA(2,0)+BAP(0,5)+kinetin(1,0) 22,22±1,25f tuần Xốp, vàng xanh Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Dấu “–“: không phát sinh callus - 2,4-D kết hợp với BAP Kinetin Đối với tổ hợp 0,5 mg/l 2,4-D; 1,0 mg/l BAP 1,0 mg/l kinetin tỷ lệ bao phấn tạo callus cao đạt 31,11±2,12% Callus có đặc điểm kết khối chặt, màu vàng xanh Khi tăng nồng độ Kinetin lên 1,5 mg/l quan sát phát sinh callus với tỷ lệ thấp 22,22±1,25%, thời gian phát sinh callus muộn sau tuần nuôi cấy - NAA kết hợp với BAP Kinetin Trên mơi trường có bổ sung NAA, BAP kinetin, quan sát thấy callus màu vàng xanh, có kết khối xốp Trong bốn cơng thức thí nghiệm, tỉ lệ phát sinh callus cao (80,43±4,15%) đạt mơi trường có bổ sung 1,5 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP 1,0 mg/l NAA Tỉ lệ phát sinh callus ngang bằng với tỉ lệ thu mơi trường có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 1,5 mg/l BAP Các callus giữ mơi trường thời gian tuần chưa quan sát thấy tượng hóa nâu Bên cạnh đó, thời gian bắt đầu phát sinh callus quan sát sau tuần nuôi cấy Điều cho thấy kết hợp NAA, BAP, kinetin có khả kích thích hình thành callus từ bao phấn mướp đắng Như vậy, sau nghiên cứu công thức bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cách riêng lẻ kết hợp đưa kết luận, chất điều hịa sinh trưởng đơn lẻ khơng có tác dụng kích thích q trình cảm ứng tạo calllus 11 từ bao phấn mướp đắng Sự kết hợp chất điều hòa sinh trưởng số nồng độ định tăng cường tỉ lệ phát sinh callus Ba môi trường phát sinh callus hiệu mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D, 1,5 mg/l BAP (MK1 - 80,0±3,12%); 1,5 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l BAP (MK2 60,6±2,27%); 1,5 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP, 1,0 mg/l kinetin (MK3 80,43±4,15%) Các công thức môi trường sử dụng để tiến hành nghiên cứu 2.3.3.2 Ảnh hưởng môi trường đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát phát sinh callus từ bao phấn nồng độ chất kích thích sinh trưởng MK1 (1,0 mg/l 2,4-D + 1,5 mg/l BAP); MK2 (1,5 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l BAP); MK3 (1,5 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP, 1,0 mg/l kinetin) với hai môi trường khác B5 MS có bổ sung 30g đường sucrose 8g/l agar, pH 5,7-5,8 (Bảng 2.6) Kết nghiên cứu cho thấy công thức kết hợp chất điều hòa sinh trưởng (MK1, MK2, MK3) tỉ lệ phát sinh callus môi trường B5 thấp so với mơi trường MS Ngồi ra, thời gian phát sinh callus môi trường B5 bắt đầu sau tuần nuôi cấy, muộn so với môi trường MS (1 tuần) Màu sắc callus môi trường B5 chuyển sang màu vàng nâu chuyển sang màu nâu sau tuần nuôi cấy Như vậy, mơi trường MS thích hợp cho q trình ni cấy bao phấn Bảng 2.6 Ảnh hưởng môi trường đến phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng giống Diago 26 Công Tỷ lệ phát Thời gian thức sinh callus phát sinh Hình thái callus ĐHST (%) callus (tuần) MK1 Chặt, màu vàng 75,15±3,14b e nâu MK2 Chặt, màu vàng 50,85±4,15 B5 c nâu màu vàng MK3 68,20±2,06 Xốp, a MK1 80,0±3,12 Chặt, màu vàng MK2 60,6±2,27d Chặt, màu xanh MS a MK3 Xốp, màu vàng 80,43±4,15 Chú thích: Các chữ khác cột sai khácxanh có ý nghĩa thống kê với p≤0,05 Mơi trường 2.3.3.3 Ảnh hưởng than hoạt tính đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Kết cho thấy, bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy, bao phấn có khả phát sinh callus nồng độ, nhiên, tỉ lệ phát sinh thấp so với môi trường không bổ sung callus (Bảng 2.7) Theo mức 12 độ tăng dần nồng độ than hoạt tính từ 0,1 - 0,3 g/l tỉ lệ callus xuất giảm dần từ 71,15±3,68% xuống 55,07±3,05% Bảng 2.7 Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng giống Diago 26 Tỷ lệ phát Thời gian phát sinh Hình thái sinh callus callus (tuần) callus (%) a 80,0±3,12 Chặt, vàng 0,0 71,15±3,68b Chặt, vàng 0,1 MK1 65,07±2,13c Chặt, vàng nhạt 0,2 55,07±3,05d Chặt, vàng nhạt 0,3 60,6±3,27c Chặt, xanh 0,0 nhạt 54,6±4,13d Chặt, vàng 0,1 MK2 40,2±3,06ef Chặt, vàng 0,2 nhạt 20,3±2,06g Chặt, vàng nhạt 0,3 80,43±4,15a Xốp, màu nhạt 0,0 65,6±3,71c Xốp, xanh màu vàng 0,1 MK3 45,9±1,36e Xốp, màu vàng nhạt 0,2 40,6±2,27f Xốp, màu 0,3 vàng nhạt Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ývàng nghĩanhạt thống kê với p≤0,05 Môi trường Nồng độ AC (g/l) Như vậy, than hoạt tính ức chế hình thành callus từ bao phấn mướp đắng không bổ sung vào môi trường nuôi cấy bao phấn 2.3.4 Ảnh hưởng giai đoạn phát triển tiểu bào tử (hạt phấn) đến khả phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng 2.3.4.1 Mối quan hệ kích thước nụ hoa giai đoạn phát triển tiểu bào tử (hạt phấn) Trong đề tài tiến hành nghiên cứu mối tương quan kích thước nụ hoa giai đoạn phát triển tiểu bào tử giống lai Diago 26 môi trường MK1 (1,0 mg/l 2,4-D + 1,5 mg/l BAP); MK2 (1,5 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l BAP); MK3 (1,5 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP, 1,0 mg/l kinetin), kết nghiên cứu cho phép lựa chọn nụ hoa với kích thước thích hợp cho q trình ni cấy Kết cho thấy, bao phấn chứa tiểu bào tử thuộc giai đoạn phát triển khác đơn nhân sớm đến hai nhân Vì vậy, chọn lọc nụ hoa mướp đắng với tiểu bào tử thuộc giai đoạn phát triển thực mướp đắng Ngoài ra, phụ thuộc vào giai đoạn phát triển nụ hoa tỉ lệ tiểu bào tử giai đoạn phát triển khác không giống nhau, ln có giai đoạn định chiếm ưu (Hình 2.1) Kết nghiên cứu tế bào học bao phấn cho thấy, nụ hoa kích thước 13 4,0-4,5 mm đồng thời tồn tiểu bào tử bốn giai đoạn phát triển, giai đoạn đơn nhân sớm, chiếm ưu 60,19±2,32%, đơn nhân có 24,08±0,98%, tỉ lệ đơn nhân muộn 14,99±1,8%, hai nhân – 0,74±0,74% Trong nụ hoa có kích thước 4,6-5,0 mm quan sát thấy bốn giai đoạn phát triển tiểu bào tử với chiếm ưu giai đoạn đơn nhân (71,98±0,42%) Như vậy, lựa chọn bao phấn với giai đoạn phát triển định tiểu bào tử, tách bao phấn có chứa tiểu bào tử với giai đoạn phát triển tối ưu chiếm ưu 100 Đơn nhân sớm Đơn nhân 50 4.0-4.5mm 4.6-5.0mm 5.1-6.0mm 6.1-6.5mm 6.6-7.0mm Hình 2.1 Tỷ lệ phần trăm tiểu bào tử giai đoạn phát triển khác nụ hoa giống Diago 26 2.3.4.2 Ảnh hưởng giai đoạn phát triển tiểu bào tử đến phát sinh callus mướp đắng giống Diago 26 Để nghiên cứu ảnh hưởng giai đoạn phát triển tiểu bào tử lên khả phát sinh callus tiến hành nuôi cấy bao phấn nụ hoa thuộc hai nhóm kích thước: 4,0-5,0mm có chứa tiểu bào tử giai đoạn đơn nhân sớm đơn nhân giữa; 5,1-6,5mm có chứa tiểu bào tử giai đoạn đơn nhân muộn hai nhân Hai nhóm bao phấn ni cấy ba môi trường MK1 (1,0 mg/l 2,4D + 1,5 mg/l BAP); MK2 (1,5 mg/l 2,4-D, 1,0 mg/l BAP); MK3 (1,5 mg/l NAA, 0,5 mg/l BAP, 1,0 mg/l kinetin) Kết cho thấy, tỉ lệ phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng nhóm kích thước nụ hoa mơi trường có sai khác mang ý nghĩa thống kê, nhận thấy khơng có liên hệ tác động yếu tố (Bảng 2.8) Hiệu phát sinh callus cao (93,75±2,55%) thu môi trường MK1 ni cấy nụ hoa có kích thước 4,0-5,0 mm Kết cao so với kết tốt Tang cs (2009) công bố mướp đắng (80,55%) nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D 2,0 mg/l BAP Tần số tạo callus thấp quan sát môi trường MK2 – 51,56±3,93% 14 Bảng 2.8 Ảnh hưởng kích thước nụ hóa đến phát sinh callus bao phấn mướp đắng giống F1 Diago 26 Thời gian bắt đầu Hình thái callus phát sinh callus (tuần) Kích thước nụ hoa 4,0 – 5,0 mm МК1 93,75±2,55a Kết khối chặt, vàng Kết khối chặt, vàng МК2 60,94±5,33be xanh af МК3 82,81±2,99 Xốp, vàng xanh Kích thước nụ hoa 5,1 – 6,5 mm МК1 73,44±2,99cbf Kết khối chặt, vàng de Kết khối chặt, vàng МК2 51,56±3,93 xanh af МК3 79,69±2,99 Xốp, vàng xanh Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p≤0,05 Mơi trường Tỉ lệ phát sinh callus, % 2.4 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng Callus phát sinh từ bao phấn giống mướp đắng Diago 26, Kami 999, F1 TN 187 môi trường MK1, MK2, MK3 sau tuần nuôi cấy chuyển qua môi trường để khảo sát phát sinh chồi Tất môi trường sử dụng môi trường MS chứa 30g/l đường sucrose, 8g/l agar, pH 5,7-5,8 bổ sung chất ĐHST thuộc nhóm auxin cytokinin khác tùy vào thí nghiệm 2.4.1 Ảnh hưởng ĐHST bổ sung đơn lẻ đến tái sinh chồi từ callus từ bao phấn mướp đắng Trong nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng cytokinin Kinetin, BAP, TDZ với nồng độ 0,5 – 3,0 mg/l đến khả phát sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng Kết cho thấy, tái sinh chồi mơi trường MS có bổ sung riêng lẻ chất kích thích sinh trưởng Các callus có tăng trưởng kích thước q trình ni Ở nồng độ TDZ thấp (0,5-1,5 mg/l) callus bị hóa nâu sau tuần ni cấy, nồng độ cao mẫu bị hóa nâu sau tuần ni cấy Trên môi trường BAP nhận thấy tăng trưởng kích thước callus Đối với mơi trường có bổ sung Kinetin mẫu callus có tăng trưởng kích thước chậm mơi trường có TDZ, BAP hóa nâu nhanh sau khoảng tuần ni cấy 2.4.2 Ảnh hưởng ĐHST bổ sung kết hợp đến tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng Trong nghiên cứu khảo sát hiệu tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng auxin cytokinin với thành phần nồng độ khác nhau, cụ thể 15 NAA BAP (0,5 – 2,5 mg/l); BAP (0,5 – 2,0 mg/l) TDZ (0,03 – 1,0 mg/l); 2,4-D (0,5 – 2,0 mg/l) TDZ (0,03 – 1,0 mg/l); NAA (0,5 – 2,0 mg/l) TDZ (0,03 – 1,0 mg/l) Kết nghiên cứu cho thấy, khơng có phát sinh chồi từ mẫu callus tất mơi trường ni cấy Kích thước callus tăng so với trước cấy vào mơi trường, callus chuyển sang màu xanh hóa nâu sau khoảng 2-3 tuần nuôi cấy 2.5 Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng đến khả tái sinh rễ từ callus bao phấn mướp đắng Trong thí nghiệm sử dụng mơi trường MS có 30g/l đường sucrose, g/l agar, pH 5,7-5,8 bổ sung IBA nồng độ 1,0 -3,0 mg/l Kết thí nghiệm cho thấy, nồng độ từ 1,5 – 3,0 mg/l IBA từ callus ban đầu quan sát thấy tái sinh rễ với tỉ lệ từ 60,5±2,65% đến 90,2±3,05% (Bảng 2.9) Ngồi ra, khơng quan sát thấy tái sinh chồi phát sinh phôi môi trường Rễ tiếp tục phát sinh thời gian tuần, tuần sau phát sinh mẫu callus rễ bắt đầu hóa nâu Bảng 2.9 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ từ callus bao phấn Thời gian bắt đầu IBA Tỷ lệ phát Hình thái rễ phát sinh rễ (tuần) (mg/l) sinh rễ (%) 0,5 1,0 1,5 60,5c±2,65 Màu trắng có lơng tơ 2,0 78,4b±4,65 Màu trắng có lơng tơ 2,5 89,7a±5,24 Màu trắng có lơng tơ 3,0 90,2a±3,05 Màu trắng có lơng tơ Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p≤0,05 Dấu “–“: khơng phát sinh rễ Một số nghiên cứu ra, q trình ni cấy in vitro, từ callus phát sinh phơi chồi trước q trình phát sinh rễ diễn tiếp sau Tuy nhiên, từ callus phát sinh rễ trước, từ callus phát sinh chồi phôi Điều có liên quan trực tiếp đến cấu trúc callus, tổ chức tế bào callus biệt hóa tế bào theo hướng phát sinh rễ Từ đây, đưa kết luận, trình hình thành phát triển callus bao phấn mướp đắng tạo tế bào biệt hóa thành rễ mà khơng thể phát triển thành chồi Để giải vấn đề tạo đơn bội từ mướp đắng tiếp tục tiến hành xác định nguồn gốc phát sinh rễ từ tế bào soma bao phấn hay từ tiểu bào tử, sau nghiên cứu quy trình phát sinh callus từ rễ này, sau tái sinh phận mướp đắng 2.6 Xác định mẫu rễ đơn bội phát sinh từ tiểu bào tử Để đánh giá nguồn gốc mẫu rễ phát sinh từ callus 16 trình ni cấy bao phấn giống mướp đắng Diago 26, tiến hành khảo sát 50 mẫu rễ bằng thị SSR (A2, A47, C1, C4, C30) công bố mướp đắng (Guo et al., 2012) Kết cho thấy số thị sử dụng, thị phân tử A47 tổng hợp allen với kích thước ~180 bp ~ 230 bp có khả để ứng dụng đánh giá nguồn gốc mẫu rễ thu Kết cho thấy, số 50 mẫu rễ khảo sát bằng thị A47, quan sát mẫu rễ (mẫu 9) có alen (~180 bp), mẫu khác tồn allen đồng thời (~ 180 bp ~230 bp kiểu gen cho bao giống F1 Diago 26 Điều cho thấy, mẫu rễ có nguồn gốc hình thành từ tiểu bào tử (Hình 3.7.) Như vậy, q trình ni cấy bao phấn có phát triển tiểu bào từ thành rễ đơn bội với tỉ lệ 4% Hình 2.2 Hình ảnh điện di thị A47 với mẫu rễ P: Diago 26, 1-14: mẫu rễ thu từ callus bao phấn mướp đắng, M: ladder, 100bp 2.7 Quy trình tạo callus từ bao phấn mướp đắng in vitro Bước 1: Thu mẫu nụ hoa từ mướp đắng tiến hành vào buổi sáng sớm từ 5-7 bảo quản túi nhựa zipper nhựa, giữ nhiệt độ khoảng 4°C bằng đá bào trình vận chuyển; Bước 2: Lựa chọn mẫu nụ hoa mướp đắng theo kích thước có chứa tiểu bào tử giai đoạn phát triển đơn nhân sớm đơn nhân muộn bằng phương pháp nhuộm acetocarmin 2%, soi mẫu kính hiển vi độ phóng đại ×40 Bước 3: Khử trùng nụ hoa theo công thức ngâm cồn 70% 30 giây, rửa lại bằng nước cất vô trùng, tiến hành khử trùng bằng NaOCl nồng độ 5% phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng lần Nụ hoa thấm khô giấy thấm Các thao tác tiến hành tủ cấy an toàn sinh học cấp Bước 4: Tách bao phấn khỏi bao phấn nhị tủ an toàn sinh học cấp bằng kim cấy đưa vào mơi trường ni cấy MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 1,0 mg/l 2,4-D 1,5 mg/l BAP Giữ mơi trường có chứa bao phấn nhiệt độ 25°C±1°C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, chu kỳ chiếu sáng 16 giờ/ngày 17 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Giống mướp đắng xanh đen Kami 999 thích hợp trồng sản xuất xã Hịa Khương, huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng vào vụ thu-đông (7/2018 – 11/2018) với suất đạt 20,50 ± 1,03 tấn/ha Công thức khử trùng nụ hoa mướp đắng có hiệu cao cồn 70% 30 giây kết hợp với NaOCl 5% phút với tỷ lệ nhiễm 10,62±1,32% tỉ lệ hạt phấn sống đạt 92,34±1,95%) Tiền xử lý mẫu nụ hoa 4°C 24 làm tăng tỉ lệ tạo callus từ bao phấn mướp đắng Trong đó, xử lý mẫu bao phấn sau cấy 32°C kìm hãm trình phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Mơi trường ni cấy bao phấn có ảnh hưởng quan trọng đến hình thành bao phấn từ callus mướp đắng Trong đó, mơi trường tối ưu để ni cấy bao phấn mướp đắng giống Diago 26 MS có bổ sung 1,0 mg/l 2,4-D 1,5 mg/l BAP (đạt 93,75±2,55%) Bổ sung than hoạt tính vào mơi trường ni cấy kìm hãm phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Kiểu gen giai đoạn phát triển tiểu bào tử (hạt phấn) có ảnh hưởng tới phát sinh callus từ bao phấn Giai đoạn phát triển tiểu bào tử tối ưu để tiến hành nuôi cấy bao phấn đơn nhân sớm đơn nhân Sử dụng công thức môi trường chất điều hòa sinh trưởng sử dụng nghiên cứu, quan sát cho thấy khơng có tái sinh chồi từ callus bao phấn mướp đắng Trong đó, tỉ lệ tái sinh rễ từ callus mướp đắng đạt cao (89,7±5,24%) bổ sung 2,5 mg/l IBA vào môi trường nuôi cấy Tỉ lệ rễ đơn bội đạt 4% tổng số rễ tái sinh từ callus bao phấn mướp đắng giống Diago 26 Kiến nghị Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh mướp đắng đơn bội hoàn chỉnh từ mẫu rễ thu thu bao phấn mướp đắng in vitro Nghiên cứu biến động thành phần nồng độ chất điều hòa sinh trưởng bao phấn callus bao phấn q trình ni cấy in vitro để giải thích nguyên nhân không tái sinh chồi từ callus mướp đắng Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy trực tiếp tiểu bào tử (hạt phấn) tách từ bao phấn để tạo mướp đắng đơn bội nhằm giải vấn đề không phát sinh chồi từ callus mướp đắng 18 19 ... chưa có nghiên cứu ni bao phấn mướp đắng tạo đơn bội Xuất phát từ sở thực đề tài ? ?Nghiên cứu quy trình tạo Mướp đắng (Momordica charantia L. ) đơn bội bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn in vitro? ??... xử l? ? mẫu nụ hoa 4°C 24 l? ?m tăng tỉ l? ?? tạo callus từ bao phấn mướp đắng Trong đó, xử l? ? mẫu bao phấn sau cấy 32°C kìm hãm trình phát sinh callus từ bao phấn mướp đắng Môi trường nuôi cấy bao phấn. .. (mg /l) Tỷ l? ?? phát sinh callus ( %) 2,4-D (1, 0) + kinetin (0, 5) 2,4-D (1, 0) + kinetin (1, 0) 2,4-D (2, 0) + kinetin (2, 0) 2,4-D (1, 0) + TDZ (0, 5) 2,4-D (1, 0) + BAP (1, 5) 2,4-D (1, 5) + BAP (1, 0) NAA