Nghiên cứu tạo mảnh ghép mô mềm từ tế bào gốc mô mỡ và khung nâng đỡ sinh học

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐH Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH BÁO CÁO NGHIỆM THU NGHIÊN CỨU TẠO MẢNH GHÉP MÔ MỀM TỪ TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ VÀ KHUNG NÂNG ĐỠ SINH HỌC ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS HUỲNH DUY THẢO PGS.TS TRẦN LÊ BẢO HÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐH Y KHOA PHẠM NGỌC THẠCH BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU TẠO MẢNH GHÉP MÔ MỀM TỪ TẾ BÀO GỐC MÔ MỠ VÀ KHUNG NÂNG ĐỠ SINH HỌC CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) Huỳnh Duy Thảo CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/2016 Trần Lê Bảo Hà CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Cùng với phát triển khoa học - công nghệ, việc sử dụng phương pháp điều trị dựa tảng kỹ nghệ mô để điều trị số bệnh loại tổn thương biến giấc mơ tưởng khơng xảy trở thành thực tương lai gần Mặc dù vậy, nhiều điều cần phải làm, nhiều thứ để nghiên cứu, nhiên, rõ ràng lợi ích kết khơng thể phủ nhận mà kỹ nghệ mơ mang lại góp phần thúc đẩy ngành y học tái tạo phát triển Cơ thể người có hệ thống nội có khả tự tái tạo sửa chữa thơng qua tế bào gốc, tế bào gốc tìm thấy hầu hết loại mô thể Như vậy, việc kết hợp tế bào gốc loại giá thể chế tạo từ kỹ nghệ mô tạo loại vật liệu giúp hỗ trợ tham gia vào trình điều trị cho loại tổn thương tái tạo lại mô, quan sau chấn thương Đề tài nghiên cứu thực dựa kết hợp tế bào gốc trung mô (được thu nhận từ mô mỡ) hai loại giá thể (hay khung nâng đỡ) chế tạo từ Gelatin-Alginate (G-A) Fibrin để tạo mảnh ghép mô mềm, mảnh ghép mơ mềm sử dụng để thay tái tạo lại mô mềm thể Các tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ đánh giá theo tiêu chí International Society Cell Therapy (ISCT) Sau kết hợp với hai loại khung G-A Fibrin để tạo hai loại mảnh ghép mô mềm Hai loại mảnh ghép đánh giá số tiêu chí thỏa mãn cho mảnh ghép tạo từ kỹ nghệ mô để ứng dụng làm mảnh ghép Kết nghiên cứu tạo hai loại mảnh ghép từ kết hợp tế bào gốc trung mô khung nâng đỡ với phương pháp đánh giá cho loại khung cụ thể Kết hướng nghiên cứu tiệm cận với lĩnh vực y học tái tạo dựa kỹ nghệ mô phát triển ngày nhanh chóng sớm vào ứng dụng y học I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Along with the development of technology, the application of new therapies based on tissue engineering to treat a number of diseases and injuries that have helped dreams thought would never happen can be a reality in the near future However, much remains to be done, there are still many things to study However, it is clear that the benefits and undeniable results from tissue engineering has brought contribute to the development of regenerative medicine The human body has an internal system capable of selfregeneration and repair through stem cells, the stem cells can be found in almost every type of tissue in the body Thus, the combination of stem cells and other types of manufactured scaffold obtained from tissue engineering which will create a new material to help support or participate in the treatment process for the type of injury or reconstructed the tissues, organs after injury The study was conducted based on a combination of mesenchymal stem cells (which are derived from adipose tissue) and two types of scaffold (or frame support) are made from Gelatin-Alginate (GA) and Fibrin to create the soft tissue graft, the soft tissue graft can be used to replace or reconstruct the soft tissue in the body The mesenchymal stem cells obtained from fat tissue are evaluated according to the criteria of ISCT Then they are combined with two types GA and fibrin scaffold to create two types of soft tissue graft The type of graft were evaluated several criteria correspond to the graft created by tissue engineering The study results have created two types of grafts from the combination of mesenchymal stem cells and supportive framework for methods of assessment for each particular type of frame supports This result is one of the research directions approaching the field of regenerative medicine based on tissue engineering that is currently developing rapidly and soon go into the application in regenerative medicine II MỤC LỤC Tóm tắt đề tài/dự án (gồm tiếng Việt tiếng Anh) Mục lục I II Danh sách chữ viết tắt VI Danh sách bảng VII Danh sách hình VIII PHẦN MỞ ĐẦU (– 3) Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu tạo mảnh ghép mô mềm từ tế bào gốc mô mỡ khung nâng đỡ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Lê Bảo Hà – Ths Huỳnh Duy Thảo Mục tiêu 2.1 Tạo khung nâng đỡ phù hợp để mang tế bào gốc mô mỡ từ Gelatin-Alginat (khung G-A) fibrin (khung fibrin) 2.2 Tạo mảnh ghép mô mềm bằngkỹ nghệ mô từ tế bào gốc mô mỡ khung nâng đỡ sinh học Sản phẩm đề tài 3.1 Tế bào gốc từ mô mỡ 3.2 Quy trình tạo khung G-A 3.3 Quy trình tạo khung Fibrin 3.4 Quy trình tạo mảnh ghép mô mềm từ tế bào gốc mô mỡ khung nâng đỡ sinh học Đào tạo thạc sĩ Bài báo khoa học Báo cáo hội nghị khoa học So sánh sản phẩm đạt đăng ký đề tài nghiên cứu III CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.1.1 Tình hình nghiên cứu nước 1.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2 Kỹ nghệ mơ mềm 1.2.1 Kỹ nghệ mô 1.2.2 Sự phát triển kỹ nghệ mô mỡ tái tạo mô mềm 1.2.3 Các loại khung nâng đỡ thường sử dụng kỹ nghệ mô mỡ 10 hướng đến tái tạo mô mềm 12 1.3 Tế bào gốc mô mỡ 13 1.3.1 Đặc điểm sinh học mô mỡ 13 1.3.2 Tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ 14 1.3.3 Tiềm biệt hóa 15 1.4 Khung Fibrin 16 1.4.1 Tổng quan khung fibrin 16 1.4.2 Cấu trúc hóa học khung fibrin 17 1.4.3 Fibrinogen 18 1.4.4 Thrombin 19 1.4.5 Yếu tố XIII (FSF –Fibrin Stabilizing Factor) 19 1.4.6 Calcium Chloride 19 1.4.7 Hiện tượng phân hủy fibrin 19 1.4.8 Tính chất vật lý khung fibrin 20 1.4.8.1 Cấu trúc sợi khung fibrin 20 1.4.8.2 Đặc tính học khung fibrin 20 1.4.8.3 Đặc tính bám dính khung fibrin 21 1.5 Khung Gelatin-Alginate 22 1.5.1 Gelatin 22 1.5.2 Alginate 23 IV 1.5.3 Phương pháp tạo khung nâng đỡ gelatin-alginate 24 CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung 1: Phân lập, nuôi cấy xác định tế bào gốc trung mô từ 26 mô mỡ người 2.1.1 Thu nhận mô mỡ người 26 2.1.2 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ người 26 2.1.3 Định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ người 27 2.2 Nội dung 2: Tạo khung G-A khung Fibrin 28 2.2.1 Tạo khung nâng đỡ gelatine-alginate 28 2.2.1.1 Phương pháp đánh giá cấu trúc khung G-A 29 2.2.1.2 Phương pháp xác định độ hút nước khung G-A 29 2.2.1.3 Phương pháp đánh giá độ phân hủy in vitro khung G-A 30 2.2.1.4 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro khung G-A thử 30 nghiệm tiếp xúc trực tiếp 2.2.1.5 Phương pháp đánh giá độc tính in vitro khung G-A thử 31 nghiệm dịch triết 2.2.1.6 Phương pháp đánh giá tính tương hợp sinh học in vivo khung G-A 32 2.2.2 Tạo khung nâng đỡ fibrin 33 2.3 Nội dung 3: Tạo mảnh ghép từ tế bào gốc trung mô khung nâng 35 đỡ 2.3.1 Tạo mảnh ghép từ tế bào gốc mô mỡ khung G-A 35 2.3.2 Tạo mảnh ghép từ tế bào gốc mô mỡ khung fibrin 37 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 37 38 V CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung 1: Phân lập, nuôi cấy xác định tế bào gốc trung mô từ 38 mô mỡ người 3.1.1 Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ người 38 3.1.2 Đánh giá tăng trưởng tế bào gốc từ mô mỡ người 39 3.1.3 Định danh tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ người 41 3.2 Nội dung 2: Tạo khung G-A khung fibrin 47 3.2.1 Tạo khung gelatine-alginate 47 3.2.1.1 Phương pháp thực 47 3.2.1.2 Kết phân tích cấu trúc khung G-A 48 3.2.1.3 Kết phân tích thành phần hóa học khung G-A 50 3.2.1.4 Kết đánh giá khả hấp thu nước khung G-A 52 3.2.1.5 Kết đánh giá phân hủy in vitro khung G-A 53 3.2.1.6 Kết đánh giá độc tính in vitro khung G-A thử nghiệm 53 tiếp xúc trực tiếp 3.2.1.7 Kết đánh giá độc tính in vitro khung G-A thử nghiệm 55 dịch chiết 3.2.1.8 Khử trùng bảo quản khung G-A 55 3.2.2 Tạo khung fibrin 56 3.2.2.1 Thu nhận sàng lọc máu tạo khung fibrin 56 3.2.2.2 Tạo khung nâng đỡ fibrin 56 3.2.2.3 Đánh giá cấu trúc khung fibrin 57 3.2.2.4 Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn 59 3.2.2.5 Đánh giá độc tính in vitro khung fibrin tế bào nuôi cấy 59 3.3 Nội dung 3: Tạo mảnh ghép từ tế bào gốc trung mô khung nâng 61 đỡ 3.3.1 Kết tạo mảnh ghép từ khung G-A 61 3.3.1.1 Đánh giá kết cố định tế bào gốc trung mô khung G-A 61 VI 3.3.1.2 Kết đánh giá bám dính tăng trưởng tế bào gốc trung mô 61 khung G-A 3.3.1.3 Kết đánh giá tương hợp sinh học in vivo khung G-A 64 3.3.2 Kết tạo mảnh ghép từ khung fibrin 68 3.3.2.1 Kết đánh giá tăng trưởng tế bào gốc trung mô khung 68 fibrin 3.3.2.2 Kết đánh giá bám dính tế bào gốc trung mơ khung 71 fibrin CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 72 CHƯƠNG V: KIẾN NGHỊ 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC VII DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ G-A Gelatin - Alginate TBG Tế Bào gốc MSC Mesenchymal Stem Cell – Tế bào gốc trung mô hADSC Human Adipose-Derived Stem Cell - Tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ người PLGA Acid Polylactide-Co-Glycolic EDC 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide CFU Colony-Forming Unit – Đơn vị tạo cụm ISCT International Society Cell Therapy – Hiệp hội Liệu pháp Tế bào Quốc tế AP Alkaline Phosphatase MTT 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide VIII Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Nghiên cứu Y học  trong bào tương bắt đầu xuất hiện các hạt  lipid  nhỏ.  Sau  đó,  bên  trong  bào  tương  tế  bào  các hạt lipid tiếp tục kết tựu vào nhau  để tạo thành các hạt lipid lớn hơn và chiếm  gần  hết  bào  tương  tế  bào,  nhân  tế  bào  bị  đẩy ra phía ngoại vi. Tiến hành nhuộm Oil  Red O, các tế bào dương tính xuất hiện với  bên trong chứa rất nhiều hạt lipid màu đỏ  A và nhuộm  Nile  Red  cho  thấy  các  hạt  lipid  hình thành bên trong bào tương của tế bào  rất nhiều khi so sánh với tế bào đối chứng  khơng  cảm  ứng  biệt  hóa  tạo  tế  bào  mỡ  (hình 3).    B C   D E Hình 3: Biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ thành tế bào mỡ. (A). Tế bào đối chứng. (B). Sau 7 ngày ni trong  mơi trường biệt hóa, tế bào thay đổi hình dạng và bào tương bắt đầu tích trữ lipid. (C). Sau 14 ngày, càng  nhiều tế bào chuyển dạng thành tế bào mỡ và giọt lipid kết tựu vào nhau nhiều hơn. (D). Tế bào nhuộm Oil  Red, trong bào tương giọt lipid nhuộm màu đỏ của thuốc nhuộm. (E). Các giọt lipid xuất hiện đầy trong bào  tương và có xu hướng kết tựu vào nhau.  giá tế bào kỹ thuật Flow Cytometry (trắc lưu tế  Dựa vào khả năng biểu hiện các marker bề mặt  bào).  Kết  quả  cho  thấy,  quần  thể  tế  bào  khảo  Tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai, sẽ được  sát  biểu  hiện  một  số  marker  gồm  CD105,  thu nhận bằng enzyme Trypsin‐EDTA (0.25% ‐  CD73,  CD90,  CD45,  CD34,  CD14  và  HLA‐DR.  0.02%). Sau đó, tế bào sẽ được thu nhận bằng  Trong đó, các tế bào này được thực hiện phản  cách  quay  ly  tâm  ở  tốc  độ  3000  vịng/phút  ứng lặp lại 3 lần với kết quả cho trong bảng 1.  trong  5  phút.  Tế  bào  sẽ  được  rửa  2  lần  với  Sự  biểu  hiện  của  các  marker  được  thực  hiện  dung  dịch  PBS  để  tinh  sạch  và  để  tách  tế  bào  trong hình 4.  thành các tế bào đơn nhằm phục vụ cho đánh  138 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật – Bệnh Viện Chợ Rẫy ‐ Năm 2013  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013  Nghiên cứu Y học   Hình 4: Kết quả nhuộm Nile Red để xác định tế bào mỡ sau khi biệt hóa. (A). Mẫu tế bào đối chứng.  (B). Mẫu MSC sau khi cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ, kết quả cho thấy bên trong bào tương tế bào xuất  hiện rất nhiều các giọt lipid bắt màu đỏ cam, các giọt lipid này hiện diện trong hầu hết bào tương tế bào,  nhân tế bào bị đẩy lệch về một phía do sự tích tựu giọt lipid.       Hình 5:  Kết quả phân tích marker cho quần thể tế bào gốc từ mơ mỡ. Kết quả phân tích cho thấy,  quần thể tế bào âm tính hồn tồn với các marker CD45 và HLA‐DR (biểu hiện dương tính khơng q 2%).  Tế bào dương tính hồn tồn với các marker CD44, CD73, CD90 và CD105 (biểu hiện dương tính > 95%).   Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật – Bệnh Viện Chợ Rẫy ‐ Năm 2013 139 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 2 * 2013 Nghiên cứu Y học  Bảng 1: Kết quả khảo sát sự biểu hiện của các marker từ quần thể tế bào gốc mơ mỡ  STT Loại CD CD73 CD90 CD105 CD44 HLA-DR CD45 Lần 97.70 99.46 99.36 99.46 0.31 0.26 Lần 97.33 99.64 99.31 99.46 0.31 0.25 Lần 97.44 99.66 99.24 99.6 0.23 0.22 Giá trị trung bình (%) Độ lệch chuẩn (%) 97.49 0.19 99.59 0.11 99.30 0.06 99.51 0.08 0.28 0.05 0.24 0.02   KẾT LUẬN  Với  quần  thể  tế  bào  gốc  thu  nhận  từ  mô  mỡ  đã  phân  lập  và  ni  cấy  sau  lần  cấy  chuyền thứ hai. Chúng tơi đã đánh giá các chỉ  tiêu để xác định cho MSC, kết quả cho thấy các  tế bào ni cấy đều là các tế bào bám dính trên  chai ni, có hình dạng thon dài đặc trưng cho  tế bào gốc trung mơ. Thứ hai, quần thể tế bào  này có khả năng biệt hóa được thành 2 dịng tế  bào  khác  nhau  thuộc  nguồn  gốc  trung  mơ  đó  là ngun bào xương và tế bào mỡ với phương  pháp xác định đáng tin cậy chứng tỏ tế bào có  khả năng biệt hóa được thành các dịng tế bào  khác.  Thứ  ba,  chúng  tơi  đã  khảo  sát  sự  biểu  hiện  của  các  marker  dùng  để  xác  định  cho  quần  thể  MSC  từ  mô  mỡ,  kết  quả  cho  thấy  tế  bào  dương  tính  khá  cao  (trên  95%)  với  các  marker được CD73, CD90 và CD105. Đây là ba  marker phổ biến được chấp thuận để xác định  cho các MSC. Các tế bào này biểu hiện rất thấp  dưới  2%  các  marker  CD45  và  HLA‐DR.  Như  vậy, với kết quả khảo sát khả năng bám dính,  tiềm năng biệt hóa và sự biểu hiện các marker  bề mặt cho thấy quần thể tế bào ni cấy chính  là các MSC. Đây là nguồn tế bào gốc rất quan  trọng  và  tiềm  năng  cho  các  ứng  dụng  lâm  sàng. Tuy nhiên, để có thể ứng dụng các tế bào  này  một  cách  an  tồn  và  hiệu  quả,  cần  thực  hiện thêm các thí nghiệm khác để khảo sát sự  an  tồn  về  mặt  di  truyền  khi  thực  hiện  các  nghiên  cứu  ni  cấy  in  vitro  cũng  như  tiềm  năng  biệt  hóa  của  tế  bào  theo  thời  gian  ni  cấy và số lần nhân đơi thế hệ, để từ đó có thể  sử  dụng  các  tế  bào  này  trong  các  điều  trị  góp  phần  nâng  cao  chất  lượng  điều  trị  cho  người  bệnh.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  10 11 Coleman  SR  (2006).  Structural  fat  grafting:  more  than  a  permanent filler. Plast Reconstr Surg. 118:108S‐120S.  Dominici  M  et  al  (2006).  Minimal  criteria  for  defining  multipotent  mesenchymal  stromal  cells.  The  international  Society  for  Cellular  Therapy  position  statement.  Cytotherapy. 8:315‐317.  Katz  AJ,  Mesenchymal  cell  culture:  Adipose  tissue.  In:  Atala  A,  Lanza  R  (2002)  Method  of  Tissue  Engineering.  Academic Press San Diego.  Locke  M,  Windsor  J,  Dunbar  PR  (2009),  Human  adipose‐ derived  stem  cell:  isolation,  characterization  and  application in surgrey, ANZ Surgrey Journal, 79:235‐244.  Pittenger  MF,  Mackay  AM,  Beck  SC  et  al  (1999).  Multilineage potential of adult human mesenchymal stem  cell. Science; 284:143‐147.  Sen A et al (2001). Adipogenic potential of human adipose  derived  stromal  cells  from  multiple  donors  is  heterogenous. J Cell biochem. 81:312‐319.  Strem  BM  et  al  (2005).  Multipotential  differentiation  of  adipose  tissue‐derived  stem  cells.  The  Keio  journal  of  medicine, 54:132‐141.  Tran  CT,  Gargiulo  C,  Huynh  DT,  Huynh  MT,  Filgueira  L  and  Strong  DM  (2011).  Culture  and  differentiation  of  osteoblasts  on  coral  scafford  from  human  bone  marrow  mesenchymal  stem  cells.  Cell  and  Tissue  Banking.  12:247‐ 261.  Tran CT, Huynh DT, Nguyen PT, C Gargiulo C and Phan  KN,  et  al  (2010).  In  vitro  culture  and  differentiation  of  osteoblasts  from  human  umbilical  cord  blood.  Cell  and  Tissue Banking. 11:269‐280.  Wolter  TP,  Von  Heimburg  D,  Stoffels  I  et  al  (2005).  Cryopreservation  of  mature  human  adipocytes:  In  vitro  measurement of viability. Ann Plast Surg. 55:408‐413.  Zuk  P.A,  Zhu  M,  Ashjian  P.  et  al  (2002),  Human  adipose  tissue  is  a  source  of  multipotent  stem  cells,  Molecular  Biological Cell, 13:4279‐4295.     Ngày nhận bài: 18/01/2013  Ngày phản biện đánh giá bài báo: 5/03/2013  Ngày bài báo được đăng: 27/05/2013      140 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật – Bệnh Viện Chợ Rẫy ‐ Năm 2013  Research Article ejbps, 2015, Volume 2, Issue 7, 48-53 Tran et al SJIF Impact Factor 2.062 ISSN 2349-8870 European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences European Journal of Biomedical Volume: Issue: AND Pharmaceutical sciences 48-53 Year: 2015 http://www.ejbps.com GELATIN-ALGINATE SPONGE: A POTENTIAL SCAFFOLD FOR ADIPOSE TISSUE ENGINEERING Hao Thi Thu Nguyen1, Quan Minh To1, Thao Duy Huynh2, Toai Cong Tran2, Ha Le Bao Tran1* Department of Physiology and Animal Biotechnology, Faculty of Biology and Biotechnology, University of Science, Vietnam National University at Ho Chi Minh City, Vietnam Department of Histo-pathology, Embryology, Genetics and Biotechnology for Tissue Transplants, Pham Ngoc Thach Medical University, Ho Chi Minh City, Vietnam *Author for Correspondence: Ha Le Bao Tran Department of Physiology and Animal Biotechnology, Faculty of Biology and Biotechnology, University of Science, Vietnam National University at Ho Chi Minh City, Vietnam Article Received on 29/09/2015 Article Revised on 22/10/2015 Article Accepted on 16/11/2015 ABSTRACT Gelatin-alginate sponge (GA sponge) is one of the ideal materials to be studied and applied in soft tissue regeneration, especially in adipose tissue engineering This sponge is made from the combination of gelatin and alginate with crosslinking activity of 1-Ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Gelatin and alginate were mixed at ratio 8:2 with 0.3% EDC and freeze-dryed to form the GA sponge After that, GA sponge was evaluated the structure by Hematoxylin and Eosin staining method and scanning electron microscopy imaging, the components by Fourier Transform Infra Red, the water absorption, in vitro biodegradation by using collagenase; in vitro cytotoxicity towards human fibroblasts Finally, adipogenic differentiation potential of human adiposederived stem cells inside the GA sponge was studied The results show that the GA sponge with spongy and stable properties has high water absorption capacity, in vitro biodegradability, non-cytotoxicity Simultaneously, human adipose-derived stem cells can adhere and differentiate into fat cells within the GA sponge With these results, the GA sponge has properties suitable for applications in adipose tissue engineering KEYWORDS: Gelatin, Alginate, sponge, scaffold, tissue engineering, adipose derived stem cells INTRODUCTION In recent years, adipose tissue engineering has been investigated in many researches with the goal is replacing the traditional method of tissue regeneration.[5,17] This is a modern method, a potential development in aesthetic medicine as well as to heal defects in natural tissue regeneration Three important factors in tissue engineering are cells, scaffolds and growth factors In adipose tissue engineering, scaffolds can be made from many different materials and they need to have the properties required to ensure the stem cells can survive, adhere, proliferate and differentiate into fat cells and then regenerate tissue Gelatin and alginate occupy a large part in the field of regenerative medicine.[7, 23] Gelatin is derived from collagen so it is biocompatibility and biodegradability In addition, gelatin also contains arginine-glycine-aspartic molecule segment (RGD) which forms the ligands for binding to receptors on the cell membrane in order to promote adhesion, migration, proliferation and differentiation of cells.[10] Alginate polysaccharide does not cause an immune response and have biodegradability.[15, 20] Although GA sponge has been extensively studied in different ratio of mixing, the role of this sponge as scaffold for tissue engineering has not been studied.[5] www.ejbps.com We made GA sponge and evaluated the properties of GA sponge to use it as a scaffold for adipose tissue engineering MATERIALS AND METHODS Samples The GA sponge was made from the mixing of gelatin (Sigma) and alginate (Sigma) with crosslinking of 1Ethyl-(3-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) (Sigma) Human adipose derived stem cells (hADSCs) were supplied from the Laboratory of Department of Physiology and Animal Biotechnology, Faculty of Biology and Biotechnology, University of Science, Vietnam National University at Ho Chi Minh City Making of the GA sponge Gelatin and alginate is completely dissolved in distilled water at 50oC to create 1% gelatin and 1% alginate solutions These solutions were then mixed with the ratio of gelatin : alginate in volume and incubated at -80oC in 24 hours Next, these frozen blocks were incubated in 0.3% EDC for 24 hours at 4°C in dark condition and freeze-dried Finally, GA sponges were sterilized by irradiation in 25kGy and cut into small samples of size 3x3x3mm3 for all experiments 48 Tran et al European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences Structure of the GA sponge The structure of GA sponge was studied by scanning electron microscopy (SEM) and H&E staining The composition of the GA sponge The composition of GA82 sponge was analyzed by fourier transform infra red (FTIR) for determination of the existence of gelatin, alginate and the links between them in forming the GA sponge Water absorption ability of the GA sponge The GA sponges were weighed to determine initial weight - dry weight (Wd) Then, sponges were soaked in 2ml distilled water, incubated at 37°C and continuous shaken (100 rpm) for hour, hours, hours, 12 hours, 18 hours and 24 hours The excess water of sponges was removed on filter paper and weighed for wet weight (Ww) The experiment was repeated in times The increase of sample weigh is the volume of water impregnated into the sponge, the degree of water absorption was calculated by the formula Cytotoxicity of the GA sponge Toxicity of GA sponge was assessed by direct contact method according to ISO 10993-5: 2009 for assessing toxicity in vitro Cultured hDASCs reached 80% confluence of dish GA sponge was placed directly on the surface of cells in the culture dish After 24 hours, we put out the sponge and observed the appearance of cell damage in the area around the sponge The experimental results were compared with cell samples without contact to GA sponge Latex rubber that caused cytotoxic towards cells was used as positive group Toxicity was evaluated by cell damage under the table of ISO 109935: 2009.[21] Table Reactivity grades for the direct contact test Grade Reactivity Description of reactivity zone None No detectable zone around or under specimen Slight Some malformed or degenerated cells under specimen Mid Zone limited to the area under the specimen Moderate A zone extending specimen size up to 1.0 cm Severe The zone extends farther than 1.0 cm beyond specimen *The achievement of a numerical grade greater than is considered a cytotoxic effect In vitro biodegradation of the GA sponge The GA sponges were weighed to determine original mass Then, the sample was shaken in ml 2U/ml collagenase with a speed of 80rpm at 37°C After hour, hours, hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours, samples were dried and reweighed The percent of the remaining weight was calculated versus the original mass The adipogenic differentiation of hADSCs inside the GA sponge hADSCs were seeded into the GA sponge with 5x10 cells/sample of size 3x3x3mm3 and cultured in adipogenic induced medium containing dexamethasone, indomethacin, insulin and isobutyl - methylxanthine at 37°C, 5% CO2 in 21 days Oil Red O staining was conducted to observe intracellular lipid droplets of hADSCs inside the GA sponge hADSCs cultured in the plastic dish were used as control RESULTS Structure of the GA sponge Peptide bonds formed between gelatin and alginate with the EDC crosslinking substance had made the stable GA sponge structure (Fig 1) There were multi-layer inserted random (Fig 2B) along with fibers unevenly (Fig 2A) The GA sponge structure with pore size in the range 50100μm is suitable for adhesion and proliferation of cell www.ejbps.com Figure Structure of the GA sponge (A) The GA sponge after freeze drying (B) The GA sponge was cut into small samples of the size 3x3x3mm3 49 Tran et al European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences (B) FTIR analysis of the GA sponge before (B1) and after (B2) irradiation Figure Morphology of the GA sponge (A) The HE staining of the GA sponge (x100) (B) SEM image shows the surface of the GA sponge (x600) The properties of the GA sponge to be a scaffold for tissue engineering The chemical composition of the GA sponge Gelatin is characterized by amide I group with C = O stretching peak at 1639 cm-1, amide II with N-H bending peak in 1542cm- Alginate has significant absorption bands related to O-H hydroxyl group (3490, 3433cm-1), ether C-O-C (1106, 1078, 1062, 1052 cm-1) and carboxyl - COO- (2926, 1636, 1418cm-1) FTIR result of the sponge has the peak 1637cm-1 of the amide I group and amide II 1543cm-1, 1637cm-1 of the carboxyl group, and 1028cm-1 of ether (Fig 3A) Thus, all the characteristics of gelatin and alginate are manifest in the spectrum of GA proved crosslinking substance - EDC had formed the bonds between two polymers in the GA sponge The GA sponge after sterilized by irradiation in 25kGy was also analyzed by FTIR The results showed that the absorption peak of GA sponge remains after irradiation (Fig 3B) Thus, the method of sterilization by irradiation causes no change in functional groups of the GA sponge The water absorption of the GA sponge The water absorption diagram of the GA sponge showed water absorption of this sponge during one hour Water absorption speed of the samples was rapid and reached a water saturation point for hour (Fig 4) With this property, medium can easily go into this sponge and support for the proliferation as well as differentiation of cells that cultured inside of the sponge Figure Graph of water absorption of the GA sponge at different periods of hour In vitro biodegradation of the GA sponge The decomposition rate of the sponge in collagenase is slow in the initial period from hours to 12 hours because of the closest links within the GA sponge (Fig 5) When gelatin is decomposed, the remaining alginate part lost the links that affects the mechanical force inside the sponge Thereby, the sponge lost much weight in the later time points Thus, the capable of biodegradation of the GA sponge with decomposition rate is suitable for the cells to proliferate and secrete the substrate to form a new extracellular matrix Therefore, GA sponge is suitable to be a scaffold in tissue engineering Figure Diagram of in vitro biodegradation of the GA sponge in collagenase Figure Infrared spectroscopy of the GA sponge (A) FTIR analysis of gelatin, alginate and the GA sponge www.ejbps.com In vitro cytotoxicity of the GA sponge After 24 hours, the GA sponge is put out of the surface of ADSCs, the cells below the contact area with the GA sponge are normal as the control group, only a few cells die There was no unusual phenomenon in the area 50 Tran et al European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences around the location of the GA sponge versus the control sample (Fig 6) According to the ISO 10993-5: 2009, this sponge is not toxic to cells adipogenic medium After the period of days, 14 days, 21 days, the sponge can contain cells positive with Oil red O dye The result showed that some small lipid droplets were formed within cells at 7th day (Fig 8B) After 14 and 21 days, cells gradually accumulate larger lipid droplets (Fig 8C, D, E, F) Based on the location of lipid droplets, we can determine the position of the cell inside the sponge However, only a small number of cells may be able to be induced for adipogenic differentiation There was no same phenomenon in the control group that the sponge and cells without induction after 21 days in culture medium (Fig 8A) Figure Morphology of ADSCs after 24 hours by in vitro toxic assessment of the GA sponge (A) ADSCs after 24 hours of placing the GA sponge on the surface of them (B) ADSCs after 24 hours without contact to the GA sponge (control) In vitro adipogenic differentiation of hADSCs hADSCs cultured in adipogenic medium have differentiated into fat cells with the big lipid droplets positive with Oil Red O dye inside cells after 21 days In control cells, without induction, there was no differentiation (Fig 7) Figure hADSCs were stained with Oil Red O dye after 21 days (A) ADSCs in culture medium without induction were negative with dye (200X) (B) ADSCs in adipogenic medium were positive with dye (400X) Adipogenic differentiation of hADSCs inside the GA sponge hADSCs were seeded inside the sponge and cultured After 1-day incubation, samples were placed in www.ejbps.com 51 Tran et al European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences Figure 8: hADSCs within the GA sponge shows positive to the Oil Red O dye (A) The GA sponge without hADSCs after 21 days in medium culture (x200) (B) The GA sponge with hADSCs after days in adipogenic medium (x200) (C) The GA sponge with hADSCs after 14 days in adipogenic medium (x40) (D) The GA sponge with ADSCs after 14 days in adipogenic medium (x200) (E) The GA sponge with ADSCs after 21 days in adipogenic medium (x40) (F) The GA sponge with ADSCs after 21 days in adipogenic medium (x200) DISCUSSION Adipose tissue engineering has been increasingly widespread developed as one of therapies for soft tissue regeneration The study about suitable scaffolds for applications in tissue engineering is an important strategy for developing this new treatment A suitable scaffold for tissue engineering must have the following characteristics: external geometry, surface properties, porosity and pore size, interface adherence and biocompatibility, degradation characterization, mechanical competence.[7] Compared with many different scaffolds were applied in adipose tissue engineering, including synthetic polymers such as poly lactic acid (PLA), poly glycolic acid (PGA), poly lacticco-glycolic acid (PLGA), poly ethylene glycol, flouropolymers, silicones, ; and natural polymers such as collagen, fibrin, gelatin, hyaluronan, matrigel, silk, ; GA sponge made from gelatin- a biocompatible material and does not cause an immune response, supporting for adhesion cells but degrades rapidly in the body; combined with alginate- a polysaccharide does not cause an immune response and it is not being degraded by enzymes in the body So this sponge can have accordant characteristics with the criteria of a scaffold in tissue engineering, especially in adipose tissue engineering In this study, the GA sponge was created and evaluated the characteristics whether it is a potential scaffold for applications in adipose tissue engineering? We have conducted the initial experiments, the results showed that GA sponge had a porous structure with the high water absorption and biodegradation ability, non-toxicity to cells and it is the space for adhesion and differentiation into adipose cells in vitro of human adipose-derived stem cells The GA sponge structure with a diameter of pores about 10-100µm is suitable for cell ingrowth Because pore size is also a very important factor, it should not be www.ejbps.com too small to prevent cellular penetration and extracellular matrix production, and it also not be too big that can affect the stability of its structure High pore density within the GA sponge provides a large surface area to support the growth of cells inside With such a pore size, the amount of water is absorbed into the GA sponge about 8-10 times the initial mass, this high water absorption capability demonstrate that the culture medium can be enough provided for cells inside the GA sponge Thus, the porous structure of GA sponge will support the activities of the cell as well as ensuring the metabolism between cells and cells, between cells inside and outside the GA sponge FTIR analysis results showed the presence of peaks characteristic of gelatin and alginate inside GA sponge with new links formed by EDC Using EDC to support the formation of new links had studied in many researches.[4] This will make the structure of GA sponge becomes more stable When assessing the biodegradable ability of GA sponge in collagenase in vitro, it biodegraded slowly from the surface to the internal structure, the size become smaller but the bulk structure is maintained thanks to the new links between gelatin and alginate The scaffold was gradually degraded to be replaced by newly grown tissue remodeling Therefore, this type of degrading scaffolds provides longer mechanical stability for the tissue to regenerate The applications of a scaffold in tissue engineering need the support of stem cells, so first of all, it is necessary to analyze the toxicity of GA sponge to the cells in vitro Experimental results showed that GA sponge is not toxic to human adipose-derived stem cells according to the toxic levels of ISO 10993-5:2009 So, we seeded cells into the GA sponge and evaluated in vitro differentiation of hADSCs - a potential source of stem cells usually used in adipose tissue engineering The appearance of the component of gelatin that is biocompatible and contains RGD peptides will enhance cell adhesion in GA sponge Observated under inverted microscope, there were many differentiated cells inside the GA sponge with big lipid droplets in the cytoplasm which were positive for Oil Red O staining after 21 days in induction medium, similar to the results of the in vitro differentiation of hADSC in culture dishes However, only partially differentiated fat cells were observed inside the GA sponge and positive with Oil Red O dye Therefore, more studies should be performed to improve the GA scaffold to enhance adhesion and differentiation of cells within this 3D scaffold Moreover, when traditional methods in soft tissue replacement had many disadvantages, applications of tissue engineering by an available scaffold which is made from nature with the easily graphic creating and these mentioned characteristics will be developed more and more.[5] CONCLUSION Our study has evaluated many properties of the GA sponge in vitro and in vivo The results showed that gelatin-alginate sponge could be a natural scaffold for soft tissue engineering with porous stable structure, good ability in water absorption, in vitro biodegradation, no 52 Tran et al European Journal of Biomedical and Pharmaceutical Sciences toxicity to cells and capable of supporting for cell adhesion and differentiation, suitable for many researches and applications in soft tissue engineering This research will be a basis for many researches to evaluate the proliferation, differentiation in vivo of stem cells inside this sponge ACKNOWLEDGEMENTS This research is funded by Department of Science and Technology at Ho Chi Minh City REFERENCES Ahearne M, Yang Y, and Liu K (Mechanical characterisation of hydrogels for tissue engineering applications) Topics in Tissue Engineering, 2008; 4: 1-16 Cao N (Fabrication of alginate hydrogel scaffolds and cell viability in calcium-crosslinked alginate hydrogel), 2012 Choi J H, Gimble J M, Lee K, Marra K G, Rubin J P, Yoo J J, Vunjak-Novakovic G and Kaplan D L (Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration) Tissue Engineering Part B Reviews, 2010; 16(4): 413-426 Choi J S, et al (Fabrication of porous extracellular matrix scaffolds from human adipose tissue) Tissue Engineering Part C: Methods, 2009; 16(3): 387-396 Choi Y S, Hong S R, Lee Y M, et al (Study on Gelatin-Containing Artificial Skin: I Preparation and Characteristics of Novel Gelatin-Alginate Sponge) Biomaterials, 1999; 20(5): 409-417 Davidenko N, et al (Collagen–hyaluronic acid scaffolds for adipose tissue engineering) Acta biomaterialia, 2010; 6(10): 3957-3968 Dhandayuthapani B, Yoshida Y, Maekawa T and Kumar D S (Polymeric scaffolds in tissue engineering application: a review) International Journal of Polymer Science, 2011 Dodson M et al (Cell supermarket: Adipose tissue as a source of stem cells) J Genomics, 2012; 1: 3944 Flynn L, Prestwich G D, Semple J L, et al (Adipose Tissue Engineering with Naturally Derived Scaffolds and Adipose-Derived Stem Cells) Biomaterials, 2007; 28(26): 3834-3842 10 Gómez-Guillén M, Giménez B, López-Caballero M A and Montero M (Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review) Food Hydrocolloids, 2011; 25(8): 1813-1827 11 Gomillion C T and Burg K J (Stem cells and adipose tissue engineering) Biomaterials, 2006; 27(36): 6052-6063 12 Gorgieva S and Kokol V (Preparation, characterization, and in vitro enzymatic degradation of chitosan‐gelatine hydrogel scaffolds as potential biomaterials) Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2012; 100(7): 1655-1667 www.ejbps.com 13 Gregoire F M, Smas C M, and Sul H S (Understanding adipocyte differentiation) Physiological reviews, 1998; 78(3): 783-809 14 Lee J M, Edwards H H L, Pereira C A, et al (Crosslinking of Tissue-Derived Biomaterials in 1Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimide (Edc)) Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 1996; 7(9): 531-541 15 Lee K Y and Mooney D J (Alginate: properties and biomedical applications) Progress in polymer science, 2012; 37(1): 106-126 16 Lu T, Li Y, and Chen T (Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering) International journal of nanomedicine, 2013; 8: 337 17 Monfort A and Izeta A (Strategies for human adipose tissue repair and regeneration) 2012 18 Niemelä S, et al (Adipose tissue and adipocyte differentiation: Molecular and cellular aspects and tissue engineering applications) Topics in Tissue Engineering, 2008; 4: 1-26 19 Ofner III C M and Bubnis W A (Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices) Pharmaceutical research, 1996; 13(12): 1821-1827 20 Pawar S N and Edgar K J (Alginate derivatization: a review of chemistry, properties and applications) Biomaterials, 2012; 33(11): 3279-3305 21 Standard I., 10993-5 (Biological evaluation of medical devices–Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization)., 2009 22 Tran C T, et al (Adipose tissue can be generated in vitro by using adipocytes from human fat tissue mesenchymal stem cells seeded and cultured on fibrin gel sheet) Cell and tissue banking, 2013; 14(1): 97-106 23 Van Vlierberghe S, Dubruel P, and Schacht E (Biopolymer-based hydrogels as scaffolds for tissue engineering applications: a review) Biomacromolecules, 2011; 12(5): 1387-1408 24 Wu X, et al (Preparation of aligned porous gelatin scaffolds by unidirectional freeze-drying method) Acta biomaterialia, 2010; 6(3): 1167-1177 53 TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TRONG LĨNH VỰC CÔNG NGHỆ TÁI TẠO MƠ Huỳnh Duy Thảo1, Trần Lê Bảo Hà2, Trần Cơng Toại1 Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Bộ môn Sinh lý học người động vật, ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc phát triển vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, từ nghiên cứu khoa học ứng dụng lâm sàng y học Nhiều loại tế bào gốc thể nghiên cứu triển khai ứng dụng Tuy nhiên, tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells – MSC) thu nhận từ mô trưởng thành tủy xương, mơ liên kết, tuyến tiêu hóa … phần phụ thai máu cuống rốn, cuống rốn [18] tế bào gốc đa tiềm năng, có khả tự đổi biệt hóa thành tế bào thuộc dịng trung mơ ngun bào xương, tế bào mỡ tế bào sụn điều kiện in vitro phát triển thành mô xương, mỡ sụn in vivo [12,18] Do có tiềm biệt hóa kết hợp với việc dễ dàng phân lập nuôi cấy làm cho MSC trở thành nguồn tế bào gốc ứng dụng quan trọng công nghệ mô y học tái tạo Mặc dù MSC có nhiều tiềm ứng dụng chúng quần thể tế bào hiếm, chiếm khoảng 0.001%-0.01% toàn tế bào đơn nhân tủy xương [12,18] Do đó, MSC cần phải có quy trình thu nhận phù hợp để phát triển in vitro trước có ứng dụng y học [11] Trong số nguồn mô dùng để thu nhận MSC, bật mơ mỡ loại mơ có đặc điểm thuận lợi tiến hành thu nhận, nghiên cứu ứng dụng: thứ nhất, việc thu nhận đơn giản, xâm lấn nên gây đau đớn cho bệnh nhân so với việc thu nhận tủy xương Thứ hai, có chứa tế bào trơn thành mạch, tế bào nội mô, nguyên bào sợi … đặc biệt MSC [12] Các MSC dễ dàng phân lập, nuôi cấy tăng sinh in vitro cảm ứng biệt hóa thành tế bào dòng tế bào khác [3,17] Thứ bà, mô mỡ chứa MSC với tỉ lệ cao, gam mô mỡ chứa 105 MSC [14] Thứ tư, tiềm biệt hóa MSC thu từ mơ mỡ chịu ảnh hưởng tuổi người hiến mơ [1,9] Mơ ghép nói riêng vật liệu cấy ghép nói chung ngày sử dụng phổ biến y học Đối với bệnh lý khuyết xương việc điều trị sử dụng mơ ghép tự thân, mô ghép đồng loại, mô ghép dị loại, vật liệu có nguồn gốc polymer, gốm, thủy tinh sinh học…Yêu cầu chung loại vật liệu cần có độ bền học cao hạn chế đến mức thấp việc kích ứng phản ứng miễn dịch thể (5) Bên cạnh đó, để cải thiện chất lượng mảnh ghép nhà nghiên cứu tạo mảnh ghép có mang tế bào xương hay tế bào tiền thân tạo xương để tạo mơ ghép xương vừa có đặc tính học mô xương vừa mang tế bào để giúp q trình tái tạo sửa chữa mơ xương diễn nhanh chóng hiệu [2,6,13] Bên cạnh đó, nhu cầu sử dụng loại mơ mềm để phục vụ cho nhu cầu phẫu thuật mà đặc biệt phẫu thuật thẩm mỹ ngày quan tâm Nhu cầu vật liệu ghép ngày cao kết hợp vật liệu ghép với tế bào gốc hướng nghiên cứu lý tưởng khả thi Do để thu nhận ứng dụng MSC từ mô mỡ cách hiệu quả, tiến hành phân lập, nuôi cấy định danh MSC thu từ mơ mỡ người Từ đó, tiến hành nghiên cứu nuôi cấy MSC từ mô mỡ kết hợp với hai loại giá thể san hô fibrin để tạo hai loại mảnh ghép mô cứng mô mềm, hướng đến ứng dụng nghiên cứu sau ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: Mô mỡ người thu nhận từ việc chọc hút mỡ quy trình phẫu thuật thẩm mỹ Mẫu mô thu nhận từ người hiến khỏe mạnh, đồng ý hiến mô để tiến hành nghiên cứu có xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV VDRL San hơ tự nhiên (Porites lutea) thu nhận từ viện Hải Dương Học Nha Trang Máu ngoại vi dùng để tạo giá thể fibrin từ huyết người Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm thực phương pháp thực nghiệm mô tả Thu nhận mô mỡ Mẫu mô thu nhận điều kiện vơ trùng phịng mổ Sau đó, mẫu vận chuyển nhanh chóng phịng thí nghiệm Phân lập ni cấy tế bào gốc từ mô mỡ Mô mỡ cho vào tube 50ml khoảng 20-30ml dịch mô mỡ cho tube Sau bổ sung hỗn hợp enzyme Dispase-Collagenase vào tube với tỉ lệ (1 mẫu: enzyme), mẫu mô ủ enzyme nhiệt độ 370C, thời gian 90 phút Sau đó, ly tâm thu nhận phần cặn lắng đáy chai Bổ sung môi trường nuôi vào tube huyền phù phần cặn lắng đáy chai Lọc phần dịch tế bào qua phễu lọc tế bào (cell strainer, BD FalconTM) với đường kính 70 μM Sau thu phần cặn lắng đáy chai bổ sung dung dịch ly giải hồng cầu để loại bỏ hồng cầu lẫn tạp dịch tế bào Sau đó, quay li tâm thu phần cặn lắng, bổ sung môi trường nuôi đếm mật độ tế bào với dung dịch Trypan blue buồng đếm Neubauer Tế bào nuôi chai nuôi T25 cm2 (Corning) ủ tủ nuôi nhiệt độ 370C 5% CO2 Tiềm biệt hóa Để khảo sát tiềm biệt hóa tế bào, tiến hành thu nhận tế bào kể từ sau lần cấy chuyền thứ hai Các tế bào thử nghiệm để cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương tế bào mỡ Quy trình biệt hóa thành ngun bào xương từ tế bào gốc mô mỡ sau: tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai chuyển lên chai nuôi sau ngày nuôi cấy thay môi trường cảm ứng tạo nguyên bào xương gồm DMEM/F12, 10% FBS, 10-7M Dexamethasone, 10mM/ml -Glycerol phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml FGF9, 10-7M vitamin D2 kháng sinh [5] Kết sau 14 ngày nuôi cấy quan sát kính hiển vi đảo ngược để đánh giá thay đổi mặt hình thái Tiến hành nhuộm Alizarin Red (AR), Von Kossa (VK) để đánh giá khả tạo chất xương Alkaline phosphatase (AP) để đánh giá hoạt tính enzyme đặc trưng cho tế bào xương Ngoài ra, thực phản ứng RT-PCR để khảo sát biểu gien Osteocalcin (là gien sử dụng để xác định cho tế bào xương) Quy trình biệt hóa thành tế bào mỡ từ tế bào gốc mô mỡ sau: tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai chuyển lên chai nuôi sau ngày nuôi cấy thay môi trường cảm ứng tạo tế bào mỡ gồm DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D-Panto (17 μm), Human insulin (66 nM), Triiodo-L-thyronine (1nM), Human transferrin (10μg/ml) [18] Kết sau 14 ngày nuôi cấy quan sát kính hiển vi đảo ngược để đánh giá thay đổi mặt hình thái Tiến hành nhuộm Oil Red O để đánh giá tích tựu giọt lipid bên tế bào nhuộm hóa mơ miễn dịch huỳnh quang Nile Red (là phương pháp nhuộm đặc hiệu sử dụng để xác định cho tế bào mỡ) Tạo mô ghép dùng để tái tạo mô xương từ san hô MSC Tách tế bào dung dịch Trypsin-EDTA (Gibco) Dịch tế bào sau tách chuyển lên giá thể san hô nuôi cấy môi trường cảm ứng tạo xương Thay môi trường ngày/ lần Sau 14 ngày, tiến hành đánh giá lại mảnh ghép Tạo mô ghép dùng để tái tạo mô mềm từ fibrin MSC Tách tế bào dung dịch Trypsin-EDTA (Gibco) Dịch tế bào sau tách chuyển lên giá thể fibrin nuôi cấy môi trường cảm ứng tạo mỡ Thay môi trường ngày/ lần Sau 14 ngày, tiến hành đánh giá lại mảnh ghép KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ Các tế bào sau phân lập từ mô mỡ bắt đầu xuất bám dính sau hai ngày ni cấy mơi trường ni Các tế bào bám dính riêng lẻ, có hình dạng thon, dài giống với hình thái nguyên bào sợi Những tế bào bám dính đáy chai nuôi Sau tuần nuôi cấy, tế bào tăng trưởng phát triển mạnh, tạo thành cụm (CFU) chai nuôi Sau 14 ngày nuôi cấy, tế bào đạt đến mật độ phù hợp để cấy chuyền (chiếm khoảng 75-80% diện tích bề mặt chai ni) Hình Phân lập ni cấy tế bào gốc từ mô mỡ (A) Tế bào bắt đầu tăng trưởng sau ngày nuôi cấy (B) Tế bào tăng trưởng sau ngày nuôi cấy (C) Tế bào nhuộm với thuốc nhuộm giemsa sau 10 ngày ni cấy Tiềm biệt hóa Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành nguyên bào xương Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào mơi trường tạo xương, tế bào bắt đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài giống với nguyên bào sợi, tế bào bắt đầu xuất dạng hình thái đa diện chế tiết chất xương Trong chai nuôi xuất nốt xương dạng kết tựu chất xương đặc trưng in vitro Sau 14 ngày nuôi cấy, tế bào biểu protein chất xương Osteocalcin biểu enzyme đặc trưng AP A B C Hình Biệt hóa MSC từ mơ mỡ thành ngun bào xương (A) mẫu tế bào chưa biệt hóa (B) nhuộm AP (D) Nhuộm AR Tất nhuộm dương tính với thuốc nhuộm (vật kính X10) (E) Thực phản ứng RTPCR với gien Osteocalcin (khung màu trắng) biểu hai mẫu nghiên cứu (OST1; OST2) so sánh với mẫu chứng (MSC) Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành tế bào mỡ Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào mơi trường tạo tế bào mỡ, tế bào bắt đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài giống với nguyên bào sợi, tế bào bắt đầu xuất dạng hình trịn, bên bào tương bắt đầu xuất hạt lipid nhỏ Sau đó, bên bào tương tế bào hạt lipid tiếp tục kết tựu vào để tạo thành hạt lipid lớn chiếm gần hết bào tương tế bào, nhân tế bào bị đẩy phía ngoại vi Tiến hành nhuộm Oil Red O, tế bào dương tính xuất với bên chứa nhiều hạt lipid màu đỏ nhuộm Nile Red cho thấy hạt lipid hình thành bên bào tương tế bào nhiều so sánh với tế bào đối chứng không cảm ứng biệt hóa tạo tế bào mỡ A B C (hình 3) Hình Biệt hóa tế bào gốc mơ mỡ thành tế bào mỡ (A) Tế bào đối chứng nhuộm Giemsa (B) Tế bào nhuộm Oil Red sau ngày ni mơi trường biệt hóa, tế bào thay đổi hình dạng bào tương bắt đầu tích trữ lipid nhuộm màu đỏ với thuốc nhuộm (C) Nhuộm Nile Red cho tế bào mỡ sau biệt hóa, kết cho thấy bào tương tế bào chứa nhiều hạt lipid bắt màu đỏ cam, hạt lipid chiếm hầu hết diện tích tế bào, nhân tế bào bị đẩy lệch phía tế bào Tạo mô ghép từ MSC giá thể san hô Mẫu san hơ có mang MSC sau biệt hóa thành nguyên bào xương xử lý dung dịch cố định (Neutral Buffer Formalin 10%) nhuộm Giemsa H&E Chúng tiến hành nhuộm khối san hô với thuốc nhuộm Fast Red violet LB salt (sigma), MSC biệt hóa thành ngun bào xương tế bào phản ứng lại với thuốc nhuộm bào tương xuất màu hồng, hoạt động enzyme alkaline phosphatase Đây enzyme sử dụng phổ biến để định danh cho nguyên bào xương A B C D Hình Đánh giá khả bám dính, phát triển biệt hóa MSC giá thể san hô (A) Mẫu san hô được chụp SEM kích thước 200µm, khơng ni tế bào (B) Mẫu san hơ chụp SEM (100µm) có mang MSC biệt hóa thành nguyên bào xương, MSC tạo lớp phát triển bên phía ngồi hốc san hô (C) Nhuộm H&E, tế bào phát triển phân bố bên khối san hô (D) Nhuộm AP, tế bào dương tính với thuốc nhuộm chứng tỏ biểu en zyme AP Điều cho thấy MSC biệt hóa thành nguyên bào xương giá thể san hô Tạo mô ghép từ MSC giá thể fibrin Mẫu fibrin có mang MSC sau biệt hóa thành tế bào mỡ xử lý dung dịch cố định (Neutral Buffer Formalin 10%) nhuộm H&E A B C D Hình Kết ni cấy cảm ứng biệt hóa hADSC thành tế bào tạo mỡ khung fibrin (A) Tế bào cảm ứng thành tế bào tạo mỡ in vitro, quan sát kính hiển vi đảo ngược (20X) (B) Tế bào nhuộm Oil red O trực tiếp khung fibrin (4X) (C) (D) Tế bào nhuộm Oil red O vật kính (20X) (40X) KẾT LUẬN Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ phân lập nuôi cấy, chúng tơi đánh giá quần thể tế bào có khả biệt hóa thành dịng tế bào khác thuộc nguồn gốc trung mơ ngun bào xương tế bào mỡ với phương pháp xác định đáng tin cậy Các MSC thu từ mô mỡ tiến hành phân lập ni cấy giá thể Chúng có khả bám dính, tăng trưởng nhanh biệt hóa thành nguyên bào xương tế bào mỡ điều kiện nuôi cấy in vitro Kết đem lại hướng ứng dụng sử dụng san hơ ghép thay xương có bổ sung tế bào nuôi cấy mô mềm từ giá thể fibrin MSC, hướng ứng dụng công nghệ mô vật liệu y sinh học tương lai TÀI LIỆU THAM KHẢO Brian M Strem et al (2005) Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells The Keio journal of medicine, 54:132-141 Carl A Gregory (2008), Mesenchymal stem cells: from culture to clinic, Stem Cell Repair and Regeneration, Imperial College Press, Singapore, 2: 21-45 Coleman SR (2006) Structural fat grafting: more than a permanent filler Plast Reconstr Surg 118:108S120S Cong Toai Tran, Ciro Gargiulo, Huynh Duy Thao, Huynh Minh Tuan, Luis Filgueira and D Michael Strong (2011) Culture and differentiation of osteoblasts on coral scafford from human bone marrow mesenchymal stem cells Cell and Tissue Banking 12:247-261 Davide Zaffe.(2005) Some considerations on biomaterials and bone Micron, 36:583–592 F Chen et al (2007), Segmental bone tissue engineering by seeding osteoblast precursor cells into titaniummesh-coral composites scaffolds, Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 36: 822-827 F Chen, S Chen, K Tao, X Feng, Y Liu, D Lei, T Mao.(2004) Marrow derived osteoblasts seeded into porous natural coral to prefabricate a vascularized bone graft in the shape of human mandibular ramus: experimental study in rabbits Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, 42:532-537 Fulin Chen, Tianqiu Mao, Kai Tao, Shujun Chen, Guicong Ding, Xiaoming.(2002) Bone graft in the shape of Human mandibular condyle reconstruction via seeding marrow-derived osteoblast into porous coral in a nude mice model J Oral Maxillofac Surg, 60:1155-1159 Jo et al (2009) Comparison neural cell differentiation of human adipose mesenchymal stem cells derived from young and old age Dev Repord 13:227-237 10 Katz AJ, Mesenchymal cell culture: Adipose tissue In: Atala A, Lanza R (2002) Method of Tissue Engineering Academic Press San Diego 11 Michelle Locke, John Windsor, P Rod Dunbar (2009), Human adipose-derived stem cell: isolation, characterization and application in surgrey, ANZ Surgrey Journal, 79:235-244 12 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell Science; 284:143-147 13 Ralph E Holmes (1979), Bone regenaration within a coralline hydroxyapatite implant, Plastic and Reconstructive Surgery, 63 :626-633 14 Sen A et al (2001) Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogenous J Cell biochem 81:312-319 15 Tran Cong Toai, Huynh Duy Thao, Nguyen Phuong Thao, Ciro Gargiulo and Phan Kim Ngoc, et al (2010) In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood Cell and Tissue Banking 11:269-280 16 Trần Giao Hòa, Đỗ Thu Hằng.(2002) Bước đầu đánh giá kết lâm sàng việc sử dụng chế phẩm san hô Việt Nam để điều trị sang thương xương Tuyển tập cong trình nghiên cứu khoa học Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược TP.HCM, 131-138 17 Wolter TP, Von Heimburg D, Stoffels I et al (2005) Cryopreservation of mature human adipocytes: In vitro measurement of viability Ann Plast Surg 55:408-413 18 Zuk P.A, Zhu M, Ashjian P et al (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells, Molecular Biological Cell, 13:4279-4295