Nghiên cứu chế tạo tấm tế bào sụn từ tế bào gốc mô mỡ và màng chân bì ứng dụng điều trị tổn thương bề mặt sụn khớp trên mô hình thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MƠ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MƠ HÌNH THỎ LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẶNG TRẦN QUÂN NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TẾ BÀO GỐC MƠ MỠ VÀ MÀNG CHÂN BÌ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN MƠ HÌNH THỎ NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH MÃ SỐ: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trần Công Toại PGS.TS Ngô Quốc Đạt Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2022 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT ii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Công nghệ mô sụn 1.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ 1.3 Giá thể sử dụng công nghệ mô sụn 15 1.4 Yếu tố tăng trưởng công nghệ mô 19 1.5 Công nghệ tạo tế bào 20 1.6 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 21 1.7 Mơ hình động vật đánh giá vật liệu ghép 22 1.8 Các phương pháp đánh giá trình lành thương mô sụn 24 1.9 Các nghiên cứu liên quan 26 CHƯƠNG 33 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Thiết kế nghiên cứu 33 2.2 Đối tượng nghiên cứu 33 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 33 2.4 Quy trình nghiên cứu 34 2.5 Đạo đức nghiên cứu 46 CHƯƠNG 47 KẾT QUẢ 47 3.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ 47 3.2 Tạo tế bào sụn từ tế bào gốc trung mô mỡ thỏ màng chân bì 53 3.3 Kết đánh giá tiềm tái tạo mô sụn in vivo mảnh ghép tế bào sụn mô hình thỏ 64 CHƯƠNG 74 BÀN LUẬN .74 4.1 Phân lập, nuôi cấy định danh tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ thỏ 74 4.2 Tạo tế bào sụn từ tế bào gốc trung mơ mỡ thỏ màng chân bì 78 4.3 Bàn luận kết ghép tế bào sụn mơ hình thỏ 85 KẾT LUẬN .89 KIẾN NGHỊ 91 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Đặng Trần Quân ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH – VIỆT TIẾNG VIỆT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BN Bệnh nhân CS Cộng TBG Tế bào gốc TBGTM Tế bào gốc trung mô TIẾNG ANH Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt ADSC Adipose-derived Stem Cells Tế bào gốc từ mô mỡ BMSC Bone Marrow Stem Cells Tế bào gốc từ tủy xương Cell scraper Dụng cụ bóc tách tế bào Fibroblastic-Colony Forming Đơn vị tạo cụm nguyên bào sợi CFU CM DMEM/F12 Units Conditioned medium Mơi trường điều hịa Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 DMSO Dimethyl sulfoxide ECM Extracellular Matrix EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EV Extracellular Vesicles Túi ngoại bào FBS Fetal Bovine Serum Huyết phơi bị Flow cytometry Kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy FDA Food and Drugs Aministration Cục quản lý thực phẩm thuốc FGF Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi Chất ngoại bào iii GMP Good Manufacturing Practices Thực hành sản xuất tốt HA Hyaluronic Acid Acid hyaluronic HBsAg Hepatitis B surface Antigen Kháng nguyên bề mặt viêm gan B HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C H&E Haematoxyline and Eosine HIV IGF ISCT ISO Human Immuno-deficiency Virus gây suy giảm miễn dịch Virus người Insullin-like growth factor Yếu tố tăng trưởng giống insullin International Society for Cellular Hội liệu pháp Tế bào Quốc Tế Therapy International Organization for Standardization PBS Phosphate Buffered Saline PLA Processed lipoaspirate RT-PCR Tổ chức Quốc tế Tiêu chuẩn hoá Đệm phốt phát Real time Polymerase chain reaction SEM Scanning electron microscopy Kính hiển vị điện tử quét SAL Sterility assurance level Độ đảm bảo vô trùng TGF Transforming growth factor Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng iv DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Tiềm biệt hóa TBGTM thu nhận từ mơ mỡ Hình 1.2 Hai giả thuyết tái tạo sụn khớp liên quan đến tế bào gốc 12 Hình 1.3 Tiềm biệt hóa TBGTM thành tế bào sụn 14 Hình 3.1 Hình ảnh phân lập mẫu mơ mỡ 47 Hình 3.2 Đồ thị tăng trưởng tế bào thu nhận từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ ba 49 Hình 3.3 Tế bào gốc bám dính bề mặt chai ni 50 Hình 3.4 Kết biệt hóa TBGTM từ mơ mỡ thỏ in vitro 51 Hình 3.5 Đánh giá biểu dấu ấn bề mặt tế bào gốc từ mô mỡ thỏ 53 Hình 3.6 Sự biểu gien sox9, col2a1, col1a2, colX, acan, runx2 cảm ứng biệt hóa tạo sụn Hình 3.7 Kết thu nhận giá thể màng chân bì da người 54 56 Hình 3.8 Kết đánh giá độc tính màng chân bì TBGTM vịng 48 ni cấy Hình 3.9 Kết ni TBGTM màng chân bì 57 58 Hình 3.10 Kết chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ sau biệt hóa tạo sụn 59 Hình 3.11 Kết chuyển TBGTM lên màng chân bì mốc ngày thứ 14 sau biệt hóa tạo sụn 59 Hình 3.12 Cấu trúc mơ học nhuộm H&E tế bào sụn cuộn TBGTM lần 60 Hình 3.13 Cấu trúc mô học nhuộm H&E Safranin O tế bào sụn sau chuyển TBGTM lần Hình 3.14 Cấu trúc mơ học nhuộm H&E Safranin O tế bào 61 v sụn sau chuyển TBGTM lần 62 Hình 3.15 Tấm tế bào sụn quan sát KHV điện tử quét (SEM) 63 Hình 3.16 Hình ảnh mổ ghép tế bào sụn thỏ 65 Hình 3.17 Hình ảnh thu nhận mẫu ghép để đánh giá mô học 65 Hình 3.18 Kết khảo sát mơ học tế bào sụn thỏ sau tháng 68 Hình 3.19 Kết khảo sát mô học tế bào sụn thỏ sau tháng 70 Hình 3.20 Kết khảo sát mô học tế bào sụn thỏ sau tháng 72 Hình 3.21 Kết nhuộm Safranin O tế bào sụn thỏ 73 Hình 4.1 Kết đánh giá tiềm biệt hóa TBGTM từ mô mỡ thỏ tác giả Helena Debiazi Zomer Tao-Chen Lee 76 Hình 4.2 So sánh kết thu nhận giá thể màng chân bì với tác giả khác 81 Hình 4.3 Kết mơ học tế bào sụn từ kết hợp TBGTM mỡ màng chân bì tác giả Ken Ye cộng 84 vi DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Công cụ đánh giá sửa chữa sụn Hiệp hội sửa chữa sụn quốc tế (ICRS) 25 Bảng 2.1 Danh sách đoạn mồi khảo sát gien đặc hiệu TBGTM 37 Bảng 2.2 Danh sách đoạn mồi khảo sát gien tạo sụn 39 Bảng 3.1 Thống kê mật độ tế bào thu mẫu mô mỡ tiến hành phân lập 47 Bảng 3.2 Sự tăng sinh tế bào thu nhận từ mô mỡ 48 Bảng 3.3 Kết đánh giá biệt hóa TBGTM từ mơ mỡ thỏ in vitro 52 Bảng 3.4 Đánh giá biểu dấu ấn bề mặt tế bào gốc từ mô mỡ thỏ 53 Bảng 3.5 Tóm tắt số đặc điểm thỏ trình nghiên cứu 66 Bảng 3.6 Thỏ bị hủy ghép 67 Bảng 4.1 So sánh biểu dấu ấn đặc hiệu TBGTM từ mỡ thỏ phương pháp đo tế bào dòng chảy tác giả nước 77 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Bổ sung thuốc nhuộm vào đĩa tế bào ủ 45 phút nhiệt độ phòng, điều kiện tối - Rửa lại lần nước cất - Kết nhuộm dương tinh chai nuôi xuất màu đỏ có hình thành canxi Thuốc nhuộm: - Alizarin Red: 2g - Nước cất: 100ml Quy trình: - Loại bỏ môi trường nuôi, rửa lại với PBS lạnh - Cố định tế bào với NBF 10% lạnh 45 phút - Loại bỏ dung dịch cố định rửa lại với nước cất lần - Loại bỏ nước rửa để yên 15 phút - Nhuộm với thuốc nhuộm 30 phút Kết quả: Tế bào dương tính với Alizarin Red bắt màu màu hồng đậm Tiến hành biệt hóa tạo tế bào mỡ - Mẫu tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba sử dụng để tiến hành cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ mơi trường biệt hóa StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco™) - Tiến hành nuôi mẫu tủ ủ ấm với nhiệt độ 37oC, 5% CO2 Thay môi trường ni lần/tuần trì khoảng thời gian từ – tuần Trong suốt q trình ni cấy không cấy chuyền tế bào - Sau 14 – 21 ngày nuôi cấy, tiến hành nhuộm tế bào với thuốc nhuộm Oil Red O (Sigma) để đánh giá khả biệt hóa thành tế bào tạo mỡ thơng qua việc tích tụ giọt mỡ bên bào tương tế bào - Hòa tan 0,5g bột Oil Red O 100ml Isopropanol - Loại bỏ môi trường ni, bổ sung 300 µl dung dịch thuốc nhuộm Oil Red O cho giếng khoảng 15 phút - Rửa chai nuôi lần với nước cất khoảng phút Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Quan sát, chụp ảnh đánh giá kết Tế bào dương tính bên bào tương xuất giọt mỡ bắt màu đỏ đậm Thuốc nhuộm: - Oil red O: 300mg - Isopropanol: 100ml Quy trình: - Loại bỏ mơi trường ni, rửa lại với PBS lạnh - Cố định tế bào với NBF 10% lạnh 45 phút - Loại bỏ dung dịch cố định rửa lại với nước cất lần - Loại bỏ nước rửa để yên 15 phút - Nhuộm với thuốc nhuộm 15 phút Kết quả: Tế bào dương tính với Oil Red bắt màu màu đỏ đậm bên bào tương Tiến hành biệt hóa tạo tế bào sụn sụn - Mẫu tế bào sau lần cấy chuyền thứ ba sử dụng để tiến hành cảm ứng biệt hóa thành tế bào sụn mơi trường biệt hóa StemPro®Chondrogenesis Differentiation Kit - Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất - Tiến hành nuôi mẫu tủ ủ ấm với nhiệt độ 37oC, 5% CO2 Tiến hành thay môi trường cảm ứng tạo nguyên bào sụn lần/ tuần Trong suốt thời gian không nhân khối tế bào - Sau 14 – 21 ngày nuôi cấy, tiến hành nhuộm tế bào với thuốc nhuộm Alcian Blue để đánh giá kết biệt hóa tạo nguyên bào sụn qua hoạt động chết tiết chất nguyên bào sụn hình ảnh mơ học theo quy trình nhà sản xuất kit Thuốc nhuộm: - 60 ml Ethanol (98 - 100%) - 40 ml Acetic Acid (98 - 100%) - 10 mg Alcian Blue GX Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Quy trình: - Loại bỏ môi trường nuôi, rửa lại với PBS lạnh - Cố định tế bào với NBF 10% lạnh 45 phút - Loại bỏ dung dịch cố định rửa lại với nước cất lần - Loại bỏ nước rửa để yên 15 phút - Nhuộm với thuốc nhuộm 15 phút Kết quả: Tế bào dương tính với Alcian blue bắt màu màu xanh dương 3.3 Dựa vào khả biểu dấu ấn bề mặt Các tế bào sau lần cấy chuyền thứ mang tách chiết RNA EasySpin ™ (iNtRON Biotechnology, Hàn Quốc) Chúng sử dụng RT-PCR để khuếch đại DNA mục tiêu (PCR Biosystems, Vương quốc Anh) với đoạn mồi đặc hiệu cho gien CD14, CD34, CD45, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GADPH) (Bảng 1) Các sản phẩm khuếch đại quan sát phương pháp điện di gel agarose 1,5% nhuộm ethidium bromide (Sigma, USA) 3.3.1 Quy trình tách chiết mRNA Nguyên tắc: mRNA tổng số diện nhân tế bào chất Màng tế bào màng nhân phá vỡ nhờ Easy Blue mRNA phân tách với protein, xác tế bào, DNA chloroform tủa với dung dịch isopropanol Thực hiện: Quy trình thực theo hướng dẫn nhà sản xuất - Cụm tế bào thu nhận cách ủ với trypsin/EDTA phút 37oC Sau bổ sung mơi trường ni DMEM/F12 có bổ sung 10% FBS huyền phù để tách tế bào khỏi bề mặt chai ni, ly tâm 3000 vịng/phút phút - Bổ sung 1ml Easy Blue vào cụm tế bào, vortex – 10 phút - Bổ sung 200 µl chloroform vào Eppendorf chứa Easy Blue tế bào, đảo nhẹ 2-3 lần - Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút, thu dịch Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh - Bổ sung isopropanol theo tỉ lệ 1:1, đảo nhẹ 2-3 lần, ủ nhiệt độ phòng 10 phút - Ly tâm 13000 vòng/phút 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu cặn - Bổ sung ethanol 700, huyền phù - Li tâm 7500 vịng/phút phút, thu cặn, làm khơ - Thêm 30µl H2O, huyền phù - Nồng độ RNA xác định máy BioPhotometer Plus (Eppendorf) Đánh giá kết quả: mRNA thu với nồng độ độ tinh cao với 1,8< OD280/OD260, OD260/OD230< 2,0 3.3.2 Quy trình khuếch đại gien mục tiêu Nguyên tắc: mRNA sử dụng làm mạch để tổng hợp thành cDNA cách sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Đoạn mồi chuyên biệt cho gien sử dụng để khuếch đại gien quan tâm Thực hiện: Quy trình thực theo hướng dẫn kit ONE-STEP RT-PCR premix Cặp mồi thiết kế công cụ NCBI/Primer tool Bảng PL1.1 Thành phần phản ứng RT-PCR Thành phần Mẫu RNA Nồng độ cuối 1500ng Thể tích (μl) Mồi xuôi 400nM 0,4 Mồi ngược 400nM 0,4 ONE-STEP RT-PCR premix 1x RTase 1IU 0,5 H 2O 1,7 Tổng thể tích phản ứng 10 Sau đặt phản ứng, khuếch đại gien mục tiêu thực theo chu trình nhiệt sau: Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng PL1.2 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR Bước Nhiệt độ Phiên mã ngược Biến tính 450C 15 phút 950C phút 950C 15 giây Gradient (Phụ lục 2) 15 giây 680C 20 giây 720C phút Khuếch đại (x40) Kéo dài Thời gian - Sản phẩm sau khuếch đại nạp vào giếng gel 1,5% Agarose/TAE 1X điện di với điện cực 110V, 400mA, 45 phút - Gel nhuộm ethium bromide, 10 phút - Kết đọc gel thu nhận máy iBOX Đánh giá kết quả: Sự biểu gien mục tiêu thể thông qua vạch sáng phát gel điện di (n=3) Bảng PL1.3 Danh sách đoạn mồi khảo sát gien đặc hiệu TBGTM Đoạn mồi (5’-3’) Gien Độ dài Tham sản phẩm khảo PCR (bp) Gapdh Mồi AGACACGATGGTGAAGGTCG 164 xuôi Mồi NM_0010 82253.1 CTTGCCGTGGGTGGAATCAT ngược CD14 Mồi TGCCTAAGGGACTGCCTG 132 xuôi Mồi NM_0010 82195.2 CAGGGACCAGGAACGGATT ngược CD34 Mồi CATCCTGGGCACTACTGGC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 115 XM_0082 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xi Mồi 68472.2 GCATGTGCAGACTCCTTTCC ngược CD44 Mồi AGGTTTGGTGGAAGACCTGG 162 xuôi Mồi XM_0027 09048.3 CTTCCTCCTCTGCCATGAGT ngược CD45 Mồi CAATTACCTGGACACCTCCTC 221 xuôi Mồi XM_0082 68698.2 CTGACAGCTTGAAGCACTTC ngược CD73 Mồi GAGCTCACGATCCTGCACAC 142 xuôi Mồi XM_0173 45272.1 CTTGGCGGATCTGTTGCACT ngược CD90 Mồi CTCTGTGCTCAGAGACAAGC 135 xuôi Mồi XM_0027 22718.3 CCAACCAGTCACAGGGAAAG ngược CD105 Mồi CGCTCTGGTGCATCTACTCG 108 xuôi Mồi XM_0082 51029.2 CGATGCTGTGGTTCGTGCT ngược CD106 Mồi TCCCCGAATCCAGATCTCTTGC xuôi Mồi 134 NM_0010 82152.1 CTCGCTCCTCACCTTCCCAT ngược Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bảng PL1.4 Nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi cho gien đặc trưng TBGTM Gien Gapdh CD14 Nhiệt độ 57 57 CD34 CD45 CD44 CD73 CD90 57 55 57 58 55 CD105 CD106 58 59 bắt cặp (0C) 3.4 Khảo sát biểu gien tạo sụn Bảng PL1.5 Danh sách đoạn mồi khảo sát gien tạo sụn Đoạn mồi (5’-3’) Gien Độ dài Tham sản phẩm khảo PCR (bp) Sox-9 Mồi AGCTCACCAGACCTTGAGAC 197 xuôi Mồi XM_0082 71763.2 GTTGGGTACCAGTTGCCTTC ngược Col I Mồi CAATGGTGGCACCCAGTTTG 258 xuôi Mồi NM_0011 95668.1 GTGCAGCCATCGACAAGAAC ngược Col II Mồi GGCTGGAGGATTTGACGAGA 135 xuôi Mồi NM_0011 95671.1 CCAGGGTTGCCTTGAAATCC ngược Col X Mồi GTCCTTCTGGACCACCAGGA 100 xuôi Mồi XM_0027 14724.3 GGCTTCCCAGTGGCTGATAG ngược Aggrecan Mồi TGGGTGTCAGGACCGTGTAC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 155 XM_0082 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh xi Mồi 51723.2 CGTCTGGACCGTGATGTCCT ngược Runx2 Mồi GATGACACTGCCACTTCTGAC 165 xuôi Mồi XM_0082 62992.2 GTGGCTGGATAGTGCATTCG ngược Bảng PL1.6 Nhiệt độ bắt cặp đoạn mồi cho gien tạo sụn Gien Nhiệt độ bắt Gapdh Sox9 57 56 Col I Col II Col X 57 56.5 58 cặp (0C) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Acan 59 Runx2 56 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC QUY TRÌNH TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ TBGTM MỠ THỎ VÀ MÀNG CHÂN BÌ Quy trình thu nhận giá thể màng chân bì da người Quy trình thiết kế theo quy trình thực chuẩn (Standard Operation Procedure – SOP), mô tả phương pháp thu nhận màng chân bì từ da người hiến 1.1 Thu nhận màng chân bì da người Bước 1: Cắt lọc - Dùng dao loại bỏ mô thừa mô mỡ, mạch máu, giữ lại phần chân bì thượng bì - Mơ da cắt thành mảnh có kích thước 3x3 cm Bước 2: Loại bỏ biểu mô tế bào bên - Mô da xử lý với dd: NaCl 1M, EDTA, dd nhược trương, ddSDS, PBS, dựa theo qui trình [25] số cải tiến từ nhóm nghiên cứu - Sau lần xử lý với dung dịch trên, mẫu mơ quay ly tâm lạnh 3000 vịng/ phút, lặp lại lần, nhằm làm mẫu mô Bước 3: Xử lý đông lạnh đông khô - Mẫu mô sau xử lý bảo quản theo qui trình đơng lạnh, đem đơng khơ: - Bảo quản mẫu mô tủ lạnh 40C vịng 30 phút, -200C vịng giờ, sau chuyển sang bảo quản nhiệt độ -800C vòng 24 - Đơng khơ mẫu chân bì áp suất 0.4mbar vòng 48 Bước 4: Khử trùng bảo quản - Mẫu mơ đóng gói đem khử trùng tia gamma với liều chiếu 25kGy nhiệt độ 40C Trung tâm nghiên cứu triển khai công nghệ xạ Với liều chiếu đảm bảo độ đảm bảo vô trùng - Bảo quản màng chân bì nhiệt độ phịng Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 1.2 Đánh giá giá thể màng chân bì sau thu nhận 1.2.1 Đánh giá cấu trúc mô học giá thể Giá thể màng chân bì sau thu nhận mang đánh giá cấu trúc mô học phương pháp xử lý tiêu nhuộm H&E quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) Kết nhuộm H&E: Mô liên kết bắt màu từ hồng đến đỏ, khơng cịn diện tế bào giá thể sau thu nhận Quan sát hình ảnh màng chân bì da kính hiển vi điện tử quét: - Quan sát bề mặt mẫu chân bì với mức độ phóng đại khác - Quan sát cấu trúc lỗ hổng 1.2.2 Đánh giá độc tính tế bào Màng chân bì da ni mơi trường huyết có chứa TBGTM từ mỡ thỏ: - Màng chân bì da ngâm dung dịch PBS - Dùng dao cắt màng chân bì da thành mảnh hình vng có kích thước 1x1 cm, ngâm PBS - Tách TBGTM khỏi chai nuôi, quay ly tâm màng chân bì với dịch tế bào thu nhỏ dịch tế bào lên màng chân bì với mật độ 104 tế bào/ cm2 Nuôi chai nuôi tiệt trùng Bổ sung 5ml môi trường nuôi - Sử dụng mơi trường huyết bị FBS 10%, thay môi trường ngày - Chai nuôi giữ tủ ấm 37oC, CO2 5% - Quan sát hình ảnh TBGTM, kiểm tra tình trạng nhiễm khuẩn – nấm sau ngày, ngày Quy trình chuyển TBGTM lên giá thể màng chân bì 2.1 Quy trình thực - TBGTM sau cấy chuyền lần thứ nuôi đĩa giếng, mật độ tế bào phủ kín bề mặt đĩa ni thay mơi trường ni mơi trường biệt hóa sụn (StemPro™ Adipogenesis Differentiation Kit) Mơi trường biệt hóa Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh thay ngày - Chuẩn bị đĩa nuôi TBGTM mơi trường biệt hóa lúc Sau ngày cảm ứng biệt hóa tạo sụn, màng chân bì đưa vào đĩa để tiến hành chuyển lớp TBGTM lên màng Lớp TBGTM bóc tách khỏi đĩa nuôi lực học cuộn quanh mảnh màng chân bì chuẩn bị sẵn Sau tế bào tiếp tục ni mơi trường biệt hóa sụn Quan sát hình thái cấu trúc lớp TBGTM bám dính lên màng chân bì kính hiển vi đảo ngược - Đến ngày thứ 14, tiến hành chuyển màng chân bì bên đĩa sang đĩa 2, tiến hành bóc lớp TBGTM bên đĩa cuộn quanh màng chân bì lần thứ Sau tế bào sụn tiếp tục nuôi môi trường biệt hóa sụn đến ngày thứ 21 - Tấm tế bào sụn sau mang chụp SEM nhuộm mô học để đánh giá đặc điểm cấu trúc tế bào học 2.2 Đánh giá cấu trúc mô học tế bào sụn − Nhuộm mô học (H&E Trichrome) : để đánh giá cấu trúc tế bào sụn, phân bố tế bào bên tế bào − Chụp SEM: đánh giá cấu trúc bề mặt, diện bám dính tế bào bề mặt giá thể − Nhuộm Safranin-O: để đánh diện nguyên bào sụn bên tế bào Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC XÂY DỰNG MƠ HÌNH ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM TỔN THƯƠNG BỀ MẶT SỤN KHỚP TRÊN THỎ BẰNG MẢNH GHÉP TỪ TBGTM MỠ THỎ VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI Nguyên tắc thiết lập quy trình ghép thực nghiệm thỏ Quy trình thiết kế theo quy trình thực chuẩn (Standard Operation Procedure – SOP), mô tả phương pháp xây dựng mơ hình điều trị thực nghiệm ghép thỏ tế bào sụn từ kết hợp TBGTM thu nhận từ mơ mỡ màng chân bì từ lớp chân bì da người Để xây dựng mơ hình điều trị thực nghiệm tổn thương sụn thỏ cần phải có TBGTM thu nhận từ mơ mỡ màng chân bì từ lớp chân bì da người thực ghép mảnh ghép vào vùng tổn thương sụn thỏ Phương pháp thực thực nghiệm – mơ tả Đối với mơ hình này, tiến hành thu nhận mơ mỡ thỏ, sau tiến hành ni cấy định danh TBGTM Tiếp theo tạo mảnh ghép kết hợp màng chân bì TBGTM Mảnh ghép sau ghép vào đầu xương cẳng chân thỏ Do đó, mơ hình xây dựng dựa quy trình nghiên cứu: - Thứ nhất, quy trình phân lập, ni cấy định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ, nhằm mục đích thu nhận nguồn tế bào ghép để tạo tế bào sụn - Thứ hai, quy trình tạo tế bào sụn từ kết hợp giá thể màng chân bì TBGTM, nhằm mục đích tạo tế bào sụn công nghệ mô để ứng dụng việc tái tạo tổn thương bề mặt sụn thỏ - Thứ ba, quy trình ghép tế bào sụn có mang tế bào tạo sụn (nguyên bào sụn) vùng đầu xương cẳng chân thỏ, nhằm đánh giá hiệu tiềm mảnh ghép lĩnh vực tái tạo tổn thương sụn Đây giai đoạn nghiên cứu bỏ qua theo tiêu chuẩn nước quốc tế mảnh ghép tiến hành thực nghiệm người phải thực nghiên cứu, đánh giá hiệu mơ hình động vật trước triển khai thực lâm sàng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Xử lý tất thành phần mơ mỡ hóa chất vật liệu truyền nhiễm bệnh Mang găng găng vơ trùng q trình vận chuyển thao tác xử lý mẫu Xử lý mẫu tủ thao tác đạt tiêu chuẩn cho yêu cầu nuôi cấy tế bào người động vật Quy trình ghép thực nghiệm thỏ 2.1 Chuẩn bị dụng cụ ✓ Nồi hấp khử trùng (Nuaire) ✓ Hệ thống thao tác phẫu thuật động vật ✓ Hệ thống chuồng trại chăm sóc động vật sau phẫu thuật ✓ Găng sạch, Găng vô trùng, Gạc vô trùng ✓ Bơm tiêm (Vinahankook) ✓ Kéo cong, kéo thẳng ✓ Nẹp tách ✓ Nẹp, vít phẫu thuật ✓ Mũi khoan phẫu thuật xương ✓ Dao mổ phẫu thuật ✓ Chỉ khâu phẫu thuật ✓ Cồn sát khuẩn 70o ✓ Betadine ✓ Gentamicine 2.2 Quy trình thực 2.2.1 Tiến hành tạo tế bào sụn: − Chọn thỏ đực khoảng tháng tuổi, cân nặng từ 2,0 – 2,5 kg, nuôi điều kiện dinh dưỡng chăm sóc Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh − 30 phút trước tiến hành phẫu thuật lấy mô mỡ, thỏ tiêm 0,5 ml Atropin sulfate, tiến hành cạo lông vùng da bụng thỏ, sát trùng vùng phẫu thuật betadine − Gây mê thỏ Zoletil® 50 với liều 10 mg/kg, cố định thỏ vào bàn tiểu phẫu − Dùng dao phẫu thuật rạch da bụng, bóc tách lấy mô mỡ vùng da Mô mỡ sau lấy đựng tuýp 50 ml, chuyển phịng thí nghiệm để thực theo quy trình thu nhận TBGTM − Khâu lại da phẫu thuật, sát trùng lại vết khâu betadine Thỏ sau chuyển chuồng chăm sóc hậu phẫu − Màng chân bì thu nhận theo quy trình cắt thành miếng hình trịn, kích cỡ khoảng 0,5 cm2 − TBGTM sau thu nhận từ mô mỡ nhân khối, cấy chuyền đến lần thứ (khoảng 14 ngày) chuyển lên đĩa nuôi giếng nuôi môi trường cảm ứng biệt hóa tạo sụn Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tạo sụn, lớp TBGTM chuyển lên màng chân bì chuẩn bị sẵn trước đó, đến ngày thứ 21 sau biệt hóa tiến hành ghép mảnh ghép lên thỏ 2.2.2 Tiến hành ghép tế bào sụn mô hình thỏ − Chọn thỏ đực khoảng tháng tuổi, cân nặng từ 2,0 – 2,5 kg, nuôi điều kiện dinh dưỡng chăm sóc − Thực nhóm thí nghiệm song song nhau: o Nhóm 1: Gối trái tạo tổn thương bề mặt sụn không ghép mảnh ghép, gối phải tạo tổn thương bề mặt sụn ghép giá thể màng chân bì khơng có mang tế bào o Nhóm 2: Gối trái tạo tổn thương bề mặt sụn không ghép mảnh ghép, gối phải tạo tổn thương bề mặt sụn ghép tế bào sụn Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh − 30 phút trước tiến hành phẫu thuật ghép, thỏ tiêm 0,5 ml Atropin sulfate, tiến hành cạo lông vùng đầu gối thỏ, sát trùng vùng phẫu thuật betadine − Gây mê thỏ Zoletil® 50 với liều 0.1 ml/kg, cố định thỏ vào bàn tiểu phẫu − Sử dụng dao mổ phẫu thuật để bọc lộ phần da bám xương Bộc lộ phần đầu khớp xương đầu gối − Sử dụng mũi khoan lõi có đường kính mm khoan vào vùng đầu gối xương cẳng chân Lấy lõi xương sụn loại bỏ phần bề mặt sụn khớp, phần xương sụn đặt trở lại lỗ khoan − Đầu gối chân trái sau tạo tổn thương bề mặt sụn khâu lại lớp da Đầu gối chân phải tiến hành ghép màng chân bì khơng mang tế bào mảnh ghép tế bào sụn chuẩn bị sẵn Sau dùng phẫu thuật khâu phần mơ da để cố định vị trí ghép khâu lại vết mổ − Sát trùng lại vết mổ Betadine, chích kháng sinh Baytril 5% với liều lượng 0,1 ml/kg thể trọng ngày liên tục vòng ngày để chống nhiễm trùng vết mổ chích kháng viêm glucortin 20 với liều 0,1 ml/kg thể trọng ngày liên tục vòng ngày để kháng viêm giảm đau − Quá trình phẫu thuật ghép chăm sóc hậu phẫu có tư vấn giám sát bác sĩ thú y Các thỏ ghép chăm sóc ni dưỡng với chế độ dinh dưỡng suốt trình nghiên cứu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn