Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm lâm sàng màng sinh học từ cellulose vi khuẩn trị tổn thương mất da

1 PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài: Xây dựng qui trình sản xuất thử nghiệm lâm sàng màng sinh học từ cellulose vi khuẩn trị tổn thương da Chủ nhiệm đề tài: GS.TS Nguyễn Văn Thanh Đồng chủ nhiệm đề tài: TS Huỳnh Thị Ngọc Lan Cơ quan chủ trì: ĐH Y Dược TP HCM Thời gian thực hiện: 24 tháng Kinh phí duyệt: 870 triệu Kinh phí cấp: 600 triệu đồng theo TB số: TB 284 / TBKHCN ngày 11 tháng 12 năm 2007 Mục tiêu - Xây dựng qui trình sản xuất màng sinh học từ cellulose vi khuẩn phối hợp với họat chất tái sinh mô dầu mù u tinh dầu tràm trà Úc trị tổn thương da với qui mô 1500 màng/ lô - Xây dựng tiêu chuẩn sở kiểm nghiệm màng - Thử nghiệm lâm sàng màng sinh học đến hết giai đoạn để làm sở cho việc điều trị tổn thương da màng sinh học Nội dung Xây dựng qui trình sản xuất màng trị tổn thương da từ cellulose vi khuẩn phối hợp với hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u tinh dầu tràm trà Úc: Chúng xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu xây dựng qui trình qui mơ sản xuất 1500 màng / lô ✦ Chuẩn bị nguyên liệu xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu: • Nguyên liệu nuôi cấy tạo màng cellulose bán thành phẩm: nguồn nguyên liệu để nuôi cấy Acetobacter xylinum nước dừa già, nguồn protein, đường glucose loại muối khoáng, nguồn nước dừa già cần phải xử lý kiểm soát chất lượng trước sử dụng cần xây dựng tiêu chuẩn nước dừa khô mặt vi sinh Nước dừa đạt tiêu chuẩn xử lý cho đưa tiệt trùng • Nguyên liệu tạo màng thành thành phẩm - Hoạt chất tái sinh mô: chiết xuất từ dầu mù u, xây dựng tiêu chuẩn họat chất bao gồm tiêu chuẩn lý hóa, thành phần acid béo thử khơng gây kích ứng da - Tinh dầu tràm trà Úc: xây dựng tiêu chuẩn tinh dầu tràm trà Úc bao gồm tính kháng khuẩn vi khuẩn hay gây nhiễm vết thương tính kích ứng da - Bao nhơm sử dụng để đóng gói - Các loại hóa chất sử dụng tinh chế màng: hóa chất tinh khiết ✦ Xây dựng qui trình với qui mơ sản xuất 1500 màng /lơ • Xây dựng qui trình tạo màng cellulose thơ từ vi khuẩn Acetobacter xylinum qui mô 1500 màng / lô - Xây dựng qui trình nhân giống vi khuẩn: sử dụng phương pháp ni cấy động với thể tích từ lít đến 30 lít giống Khảo sát thơng số động học trình nhân giống để đạt khả tăng trưởng khoảng 100 lần, từ sử dụng để nhân giống cho 200 lít đến 400 lít mơi trường tạo màng cellulose - Xây dựng qui trình ni cấy tạo màng cellulose thô: khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tạo màng BC điều kiện ni cấy tĩnh Qui trình thực hộp nhựa kích thước 22m x 12cm x 10cm Mỗi mẻ nuôi cấy sử dụng khoảng 200 hộp nhựa/ mẻ với số màng thu khoảng 1500 màng kích thước 10 cm x 10 cm • Xây dựng qui trình tinh chế màng cellulose thô qui mô 1500 màng / mẻ: màng cellulose thơ có màu vàng nhạt bên chứa vi khuẩn Acetobacter xylinum tạp chất mơi trường ni cấy Vì cần phải phá vỡ tế bào vi khuẩn lọai độc tố Màng cellulose sau tinh chế có màu trắng trong, đạt độ tinh khiết cao, đạt tiêu chuẩn nghiên cứu để chế tạo màng trị tổn thương da khơng kích ứng da, có khả cản khuẩn, có độ bền học cao có khả hút dịch • Xây dựng qui trình kiểm tra chất lượng sản phẩm cỡ mẫu 250 mẫu: kiểm tra chất lượng màng bán thành phẩm, màng thành phẩm theo tiêu chuẩn chất lượng sở đặt với phương pháp kiểm nghiệm qui định Dược điển Việt nam Dược điển có uy tín khác • Xây dựng qui trình tạo màng trị bỏng thành phẩm ACETUL: màng cellulose tinh khiết phối hợp với hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u tinh dầu tràm trà Úc tá dược Màng thành phẩm đóng gói bao PE bao nhơm sau tiệt trùng tia gamma Theo dõi độ ổn định sản phẩm: màng ACETUL theo dõi đặc tính màng khả kháng khuẩn, khả thấm hút dịch, khả cản khuẩn thành phần hoạt chất tái sinh mô điều kiện tự nhiên (nhiệt độ phòng) thời gian năm Thử nghiệm lâm sàng: thử nghiệm lâm sàng giai đoạn - Lập hồ sơ thử nghiệm lâm sàng đăng ký với Bộ Y tế - Thử nghiệm lâm sàng giai đọan 1: thử nghiệm 30 người khỏe mạnh nhằm thiết lập đánh giá sơ tính an tịan chế phẩm người - Thử nghiệm lâm sàng giai đọan 2: thử nghiệm lâm sàng qui mô vừa 50 bệnh nhân bị bỏng độ nhằm đánh giá hoạt động trị liệu, tính an toàn thuốc bệnh nhân, chế độ điều trị thích hợp Chương TỔNG QUAN 1.1 Sử dụng loại màng che phủ vết thương da Việc điều trị vết thương da tổn thương bỏng thật thách đố lớn Ngay Mỹ có đến 12 000 nạn nhân chết năm bỏng nguyên nhân da khác Vào tháng cao điểm, hàng ngày Viện bỏng Quốc gia phải điều trị cho khoảng 200 bệnh nhân bị vết thương bỏng, tai nạn giao thông, tai nạn nghề nghịêp [8] Các tai nạn nêu tạo thương tích nặng nề Chấn thương bỏng làm gia tăng thẩm thấu nước, protein chất điện giải, dẫn đến tăng tiết dịch, tạo điều kiện gia tăng nhiễm trùng vết thương Tiến trình lành vết thương da tùy thuộc nhiều vào trình điều trị chăm sóc vết thương Một yếu tố quan trọng khơng thể thiếu q trình điều trị sử dụng loại vật liệu che phủ vết thương.[72] Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh vết thương hay vết bỏng chóng lành giữ điều kiện thích hợp, nghĩa cần có lớp màng bảo vệ vết thương (wound dressing) Một lớp màng bảo vệ có ý nghĩa lớn việc giữ cho vết thương tránh khỏi nhiễm trùng, có độ ẩm thích hợp, kích thích lành sẹo, bảo vệ tế bào hình thành quan trọng hạn chế tình trạng nước chất điện giải liên tục bay từ bề mặt vết thương.[24],[39] Điều giúp cải thiện toàn trạng vết thương Đáp ứng nhu cầu này, có nhiều loại màng nghiên cứu chế tạo chứng minh hiệu thực tế điều trị 1.2 Các loại băng sử dụng che phủ vết thương Băng vết thương phải có chức sau: [25],[52],[74] (1) Có khả hút dịch rỉ độc tố bề mặt vết thương (2) Duy trì mơi trường ẩm cho vết thương; (3) Hấp phụ mùi; (4) Cho phép thơng khí; (5) Tạo cách nhiệt; (6) Có khả cản vi khuẩn, bảo vệ vết thương khỏi nhiễm khuẩn; (7) Có tác động làm vết thương (loại bỏ mô chết tiểu phân lạ); (8) Khơng độc, khơng kích ứng; (9) Lấy dễ dàng khỏi vết thương, không gây tổn thương Dựa nguồn gốc vật liệu, người ta chia màng làm loại: băng gạc thiên nhiên, băng tổng hợp, băng sinh học Theo chế tác động phân loại băng sau: [17],[19] Bảng 1.1 Phân loại băng vết thương theo chế tác động Loại băng Băng truyền thống Đặc tính Các loại băng truyền thống có khả che phủ vết thương, khả thấm hút cản khuẩn (băng gạc) Chế phẩm tương tác Màng tổng hợp dạng phần lớn suốt, nước khí oxy có khả thấm qua, ngăn cản vi khuẩn (hyaluronic acid, hydrogel, màng dạng bọt…) Các chế phẩm có hoạt Các loại băng có chứa chất có hoạt tính làm lành vết thương tính sinh học (hydrocolloids, alginat, collagen, chitosan…) (Bioactive products ) Băng truyền thống Băng gạc làm từ sợi cotton thiên nhiên dạng gạc vải Thường dùng làm lớp che phủ cho vết thương tiết dịch nhiều, vết thương nhầy nhớt, xước da, vết bỏng nhẹ Ưu điểm băng gạc khơng gây bít vết thương, thơng thống, gạc có nhiều khuyết điểm khơng cản khuẩn, gạc hút dịch rỉ vết thương nhanh trở nên khô, gây đau đớn cho bệnh nhân thay băng, tác dụng kích thích mau lành vết thương Băng gạc phối hợp với chất khác vaselin, chất sát khuẩn … Băng tổng hợp Băng tổng hợp xem chế phẩm tương tác Băng tổng hợp gồm lọai: băng gạc dạng sợi polymer giống loại băng gạc truyền thống, băng dán vết thương (như băng dán kẽm), dạng màng polymer Các polymer tổng hợp có nguồn gốc từ sản phẩm dầu hỏa Polymer tổng hợp có nhiều ưu điểm có khả bám dính, che phủ toàn viền vết thương, dễ dàng sử dụng, nhược điểm thiếu đặc tính sinh học thúc đẩy tiến trình liền vết thương thơng qua kích thích tế bào liên quan Những màng dùng che phủ vết bỏng sâu vết loét da Chúng tạo môi trường trơ kiểm soát nhiệt độ độ ẩm vết thương đồng thời có khả cản khuẩn Các loại băng có chứa chất kháng khuẩn Các băng loại gồm có dạng gạc, vải, lưới từ sợi polymer tổng hợp tẩm thêm chất kháng khuẩn iodin, hợp chất bạc, sulfamid [12],[47],[49] Những chất có khả sát khuẩn mạnh phổ rộng Các loại băng có chứa chất sát khuẩn thích hợp cho vết thương pha viêm pha tăng sinh vết thương nhiễm khuẩn nặng Các polymer dạng màng film Màng film loại màng đồng nhất, bao gồm lớp polymer, mặt bên phủ chất dính Các polymer thường sử dụng là: polyurethan, polyethylen, polycaprolacton Màng film thích hợp cho vết thương nơng Tuy nhiên thiếu khoang hấp thu, không cho nước khí ra, gây tích tụ dịch tiết vết thương lớp màng, đồng thời cho phép vi khuẩn xâm nhập vào bề mặt vết thương Chính thế, chúng không phù hợp với vết thương rộng Một số loại màng film từ polyurethan như: Tegaderm® (3M Health Care Ltd.), Opsite Wound® (Smith & Nephew plc.) Màng kép Màng gồm hai hay nhiều lớp Lớp thiết kế để tạo độ bền, độ đàn hồi kiểm soát thoát nước Trong lớp thiết kế để tạo độ bám dính cao độ đàn hồi màng Granuflex, Biobrane Màng dễ dàng dính chặt vào bề mặt vết thương để phát huy tác dụng tăng sinh mô liên kết, mạch máu đồng thời lại gây nguy nhiễm trùng kéo dài giai đoạn co hẹp khép kín miệng vết thương.[13] Băng thấm bán thấm tổng hợp: gồm có băng hydrogel băng hydrocolloid Băng hydrogel: mạng lưới chiều làm từ polymer ưa nước (có thể chứa tới 90 % - 95 % nước).[34] Chúng làm từ vật liệu gelatin polysaccharid liên kết với polymer Các polymer thường sử dụng polyethylene oxid, polyacrylamid polyvinylpyrolidin Màng hút nước có khả làm mát, làm giảm đau nên thường sử dụng sơ cứu bị bỏng nhiệt Trên vết thương khô, màng hydrogel có khả tạo mơi trường ẩm ướt làm cho vết thương mau lành Một số loại màng hydrogel có chứa hoạt chất có tác động ® tiến trình lành vết thương màng Carrasorb chứa acetylat mannan có tác dụng kích thích yếu tố IL – 1, TNF -
; màng TegadermTM có chứa acid hyaluronic chondrotin sulfat liên kết với glucosaminoglycan Những chất có tác dụng kích thích tạo thành mơ hạt làm tăng biểu bì hóa.[41] Băng Hydrocolloid: hỗn hợp thành phần dính đàn hồi Trong carboxy methyl cellulose dùng làm tác nhân hút dịch rỉ vết thương phổ biến Một số sản phẩm thị trường như: Duoactive® (Convatec Co.), Absocure® (Nitto Medical Corp.), Duoderm Các loại băng khơng dính chặt vào vết thương nên thay băng khơng làm tổn thương biểu bì Ngồi sau thấm hút dịch từ vết thương loại băng tổng hợp tạo mơi trường ẩm có lợi cho vết thương.[29],[30],[31] Màng có cấu trúc hạt: số loại màng cịn có cấu trúc từ hạt tự nhiên phối hợp với sợi polymer calcium alginat, chitin, dextran polymer, vải từ than hoạt Màng alginat: thành phần alginat natri chiết xuất từ tảo nâu Alginat natri tan nước, chuyển thành muối calci khơng tan Màng dùng trị bỏng, viêm loét chân vết thương nhiễm trùng chấn thương Một số sản phẩm màng alginat thị trường như: KaltoStat® (Convatec Co.), Sorbsan® (Alcare Company) [28],[62],[70] Màng chitin: chitin hợp chất cao phân tử cấu tạo N-acetyl D- Glucosamin thành phần lớp vỏ lồi giáp xác Chitin làm thành nhiều dạng dạng xốp, sợi cotton, dạng lớp, dạng sợi đan lại Nhược điểm màng khơng thấm hút dịch dính vào vết thương.[21],[53] Màng maltodextrin: maltodextrin có cấu trúc D- glucose polysaccharide Tính ưa nước dạng bột làm cho chúng bị lôi vào sâu bên vết thương hòa tan dịch rỉ bám vào vết thương từ làm gia tăng khả thấm hút dịch.[78] Các loại băng tổng hợp vơ định hình Hydrogel vơ định hình: thành phần giống băng hydrogel, ngoại trừ polymer không liên kết để tạo thành phiến, chứa lượng nhỏ collagen, alginate phức hợp carbohydrate Chúng tạo độ ẩm cho vảy khô vết thương tạo điều kiện thuận lợi giúp vảy tự phân hủy Do độ nhớt hydrogel ưa nước nên khó giữ chúng vết thương Tuy nhiên, chúng có tốc độ phủ đầy biểu mơ đóng kín vết thương so sánh với băng hydrocolloid Băng tổng hợp dạng hơi: tạo thành lớp màng mỏng có khả thấm xịt vào vết thương Băng tổng hợp dạng bọt: tạo thành màng xốp sử dụng Đặc tính màng xốp độ xốp, cách ly tăng bám dính vết thương Những polymer polyurethane dùng để tạo bọt bền sau tiếp xúc với vết thương Những vật liệu lấp đầy khoang vết thương Chúng mềm, có bề mặt xốp, có khả thấm hút tiếp xúc với vết thương Dịch rỉ mảnh vụn tế bào hấp thu giữ lại màng xốp Sự trao đổi nước khí điều chỉnh thay đổi thể tích phần polymer mật độ liên kết Một bất lợi dạng sức bền căng thiếu cấu trúc toàn vẹn Màng sinh học: màng sinh học có nguồn gốc từ mơ tự nhiên, gồm nhiều dạng, kết hợp collagen, elastin lipid Hiện nay, nhiều loại polymer sinh học collagen, fibrin, fibronectin, acid hyaluronic dùng làm màng che phủ vết thương da [32] Không giống polymer tổng hợp, polymer sinh học trơ với vết thương chúng đóng vai trị quan trọng tiến trình làm lành vết thương da Màng sinh học có khả năng: (1) Giữ ẩm tốt; (2) Giảm protein chất điện giải dịch tiết vết thương; (3) Cản khuẩn; (4) Giảm đau; (5) Tái tạo mô, giảm thời gian làm lành vết thương, đặc biệt vết thương sâu rộng; (6) Ức chế tạo thành nguyên bào sợi mức, giảm co rút vết thương Một số loại màng sinh học điển màng collagen, màng ối đơng khơ ® Màng collagen thiết kế dạng gel (Collasate , …) dạng màng sợi không sợi, dạng hạt (Collamend TM Veterinary Products Laboratory, Phoenix, AZ…), cấu trúc lỗ xốp Sử dụng màng collagen dạng sợi từ bò cho thấy bề mặt vết thương trở nên khơ bị nước màng khơng cịn tác động màng thấm hút Với dạng cấu trúc lỗ xốp cho phép mô tái tạo vật liệu, theo thời gian mô bị tổn thương mô cấy tiếp xúc chặt chẽ với tách rời Cuối mô cấy bị thoái hoá thay mơ sẹo bình thường Để tạo collagen dạng xốp, người ta đông khô collagen type I xử lý trước cách khử nước, chiếu xạ chất hoá học carbodiimid, glutaraldehyd, formaldehyd, diisocyanat Tuy nhiên, có mặt tác nhân chất giải phóng từ phân hủy làm cản trở tiến trình lành vết thương Màng collagen phối hợp với kháng sinh [65] Màng ối đông khô: cho tác dụng tốt ứng dụng lâm sàng Màng ối có số tác dụng điều trị vết thương da:[7] - Có tác dụng kích thích mơ hạt để chuẩn bị cho ghép da tự thân - Kích thích biểu bì hóa vết thương nơng - Tăng sinh mạnh mẽ mao mạch cải thiện ghép để tiếp nhận tốt da ghép - Giữ cho vết thương ẩm - Hấp thu dịch rỉ, giảm dịch, điện giải, protein, lượng bốc - Có hiệu kháng khuẩn tương đương mảnh ghép da tự thân 1.3 Chọn lựa loại băng thích hợp cho vết thương Khơng có loại băng đơn giản thích hợp cho tất loại vết thương tất giai đoạn tiến trình lành vết thương Vì sử dụng số loại băng khác phối hợp để giúp cho trình lành vết thương giai đoạn khác tiến trình lành vết thương da Việc lựa chọn loại băng bác sĩ điều trị định dựa vào tính chất vết thương tính chất loại băng Giá loại băng ảnh hưởng đến việc lựa chọn Bảng 1.2 cho số ví dụ việc lựa chọn băng điều trị vết thương da [19],[73] 10 Bảng 1.2 Các loại băng thích hợp cho số dạng vết thương Loại băng Loại vết thương Vết thương sạch, tiết dịch nhiều trung bình Vết thương sạch, khơ, tiết dịch • Băng gạc paraffin • Băng dạng sợi tổng hợp Băng plastic dạng film có lỗ • • Băng dạng film có khả thấm hút thơng thống Vết thương sạch, có tiết dịch tạo mơ hạt • Hydrocolloid • Băng dạng bọt xốp • Alginat Vết thương bị che phủ lớp nhày, có nhiễm trùng • Hydrocolloid • Hydrogel • Băng tẩm chất kháng khuẩn Vết thương khô đóng vảy • Hydrocolloids • Hydrogels 1.4 Sử dụng cellulose vi khuẩn chế tạo màng trị tổn thương da Một số loài vi khuẩn thuộc chi khác có khả tổng hợp cellulose (gọi bacterial cellulose) Acetobacter, Achromobacter, Aerobacter, Rhizobium Trong loài trên, Acetobacter xylinum vi khuẩn tạo cellulose hữu hiệu 1.4.1 Đặc tính cellulose vi khuẩn 1.4.1.1 Cấu trúc 126 điều trị, vết thương dễ hóa mủ, màng bị tan rữa dịch tiết nhiễm khuẩn đặc biệt với vùng tỳ đè bệnh nhân bỏng sâu, diện rộng.[7],[9] Nguyên liệu chế tạo màng trị bỏng Acetul từ màng BC tinh chế, hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u tinh dầu tràm trà Úc Các nghiên cứu chế tạo màng cellulose từ Acetobacter xylinum nhằm mục đích tạo vật liệu có nhiều đặc tính lý tưởng cho việc chế tạo màng trị bỏng Màng BC có nhiều đặc tính lý tưởng để chế tạo màng trị bỏng Màng BC tinh chế qua kết nghiên cứu cho thấy có nhiều ưu điểm, thích hợp để chế tạo màng trị bỏng lý tưởng Các tính chất như: khả che phủ tốt, cản khuẩn hồn tồn, giữ ẩm có tính thơng thống (vẫn cho nước ra), độ bền học cao gặp nước đặc tính mà khơng phải vật liệu có Hơn màng BC có nguồn gốc từ sản phẩm sinh học đắp lên vết thương khơng giải phóng tạp chất vào vết thương, khơng gây kích ứng Trên giới có số sản phẩm sử dụng màng BC để trị bỏng vết thương da Tuy nhiên sản phẩm sử dụng màng BC tinh chế tác dụng màng BC dừng lại số tính chất che phủ, cản khuẩn, tạo môi trường ẩm cho vết thương [56] Kết nghiên cứu cho thấy màng BC có độ bền học cao nằm giới hạn 3,03 ± 0,1 kN/m, xé màng không bị rách Hơn màng BC không bị phân rã gặp nước, độ ẩm cao 70 % có khả thấm hút dịch tốt Độ ẩm thích hợp có ảnh hưởng tích cực đến q trình liền sẹo tỷ lệ tái tạo biểu bì có liên quan trực tiếp đến tình trạng ẩm ướt vết thương Để hở, vết thương khô, tái tạo biểu bì chậm vết thương ẩm băng kín Sự di chuyển tế bào sừng bên lớp vảy tiết khô thường chậm so với vùng ẩm ướt băng kín, mức di chuyển tế bào biểu bì nằm gần với bề mặt vết thương nhanh Sự hình thành vảy tiết bị ức chế bề mặt vết thương giữ ẩm lớp băng kín Khi vết thương có đủ độ ẩm, bề mặt da che kín, lớp biểu bì di chuyển nhanh đáy vết thương ẩm ướt [24],[39] Bệnh nhân có sẹo nông hơn, nhỏ hơn, nhẵn mềm mại hơn, thường bị nhiễm khuẩn Sử dụng màng BC có độ ẩm 70 % thích hợp cho đặc tính màng có vai 127 trò việc giữ ẩm che phủ cho vết thương Với màng có độ ẩm thấp khả thấm hút dịch giảm đáng kể, chí hoàn toàn trường hợp độ ẩm từ - % Khả che phủ tốt màng BC thể khả cản khuẩn 100 % nhỏ trực tiếp huyền trọc vi khuẩn lên màng Với đặc tính màng BC có khả bảo vệ vết thương, tránh xâm nhiễm vi khuẩn, tình trạng nhiễm trùng bệnh viện nguy lớn cho vết thương bỏng Tuy nhiên để có khả cản khuẩn đạt độ bền học cao trình chế tạo màng địi hỏi qui trình ni cấy lên men A xylinum không phép nhiễm vi khuẩn lạ, môi trường nuôi cấy không lẫn tạp học Đây điều khác biệt việc chế tạo BC sử dụng chế tạo màng trị bỏng vết thương so với BC dùng công nghệ thực phẩm Các nghiên cứu sử dụng hoạt chất phối hợp bao gồm tìm hoạt chất phối hợp để làm tăng khả điều trị bỏng màng BC bao gồm hoạt chất có tính kháng khuẩn hoạt chất có tác dụng kích thích việc tái tạo tế bào tiến trình lành vết thương Sử dụng tinh dầu tràm trà Úc Tính kháng khuẩn màng trị bỏng có vai trị đặc biệt quan trọng trình lành vết thương tổn thương bỏng nhiễm khuẩn làm cho trình lành vết thương bị chậm lại Tuy nhiên việc sử dụng rộng rãi loại kháng sinh chống nhiễm khuẩn làm gia tăng đề kháng kháng sinh đặc biệt chủng Staphylococcus aureus đề kháng methicillin, Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa đề kháng gentamycin Vì người ta nghĩ đến việc sử dụng chất sát khuẩn để ngăn chặn nhiễm khuẩn vết thương iodine, hợp chất bạc, sulfamid Những chất có khả sát khuẩn mạnh phổ rộng Từ sở gần có số cơng trình nghiên cứu phối hợp màng BC với nano bạc.[69] Tuy nhiên kết dừng mức nghiên cứu, chưa có chế phẩm thị trường Trong đề tài nghiên cứu, phối hợp hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn tinh dầu tràm trà Úc với màng BC Đây điểm đề tài mà chưa có cơng trình nghiên cứu 128 Tinh dầu tràm trà Úc có tinh chất kháng khuẩn mạnh vi khuẩn thường gây nhiễm vết bỏng vết thương da Hoạt chất hoàn toàn có nguồn gốc từ thiên nhiên khơng gây độc cho thể nghiên cứu để sử dụng kháng khuẩn, kháng viêm vết thương da.[15],[16],[59] Tinh dầu tràm trà Úc có thành phần terpinen - -ol có tác dụng kháng khuẩn, thành phần khác tinh dầu gây kích ứng da Hơn tinh dầu tràm trà Úc cịn có tính kháng khuẩn vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng methicillin loại vi khuẩn có kháng sinh điều trị Việc sử dụng tinh dầu tràm cịn có tác dụng tá dược hỗ trợ việc giúp khử mùi hôi vết thương nhiễm khuẩn Với nồng độ MIC thấp vi khuẩn thử nghiệm (MIC Staphylococcus aureus 0,0032 ml, Pseudomonas aeruginosa 0,064 ml) nồng độ đạt dễ dàng trình chế tạo màng Lựa chọn nồng độ tinh dầu 10 % phối hợp với hoạt chất tái sinh mơ tá dược nồng độ tối đa khơng gây kích ứng đồng thời nồng độ đạt MIC Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Tác dụng kháng khuẩn tinh dầu tràm trà Úc (trên mẫu thử nghiệm) có tác dụng kìm khuẩn Sau 48 bị ức chế, vi khuẩn phát triển trở lại Tuy nhiên T.T.O ức chế tăng trưởng vi khuẩn so với mẫu chứng Sử dụng hoạt chất tái sinh mô Để thúc đẩy nhanh trình liền vết thương, sử dụng hoạt chất tái sinh mô chiết từ dầu mù u phối hợp với màng BC Dầu mù u dược liệu sử dụng nhiều dân gian để trị vết thương ngồi da, có tính chất kích thích tái tạo mơ hạt, làm vết thương mau lành Hoạt chất giúp vết thương mau lành dầu mù u acid béo Các acid béo khơng no có dầu mù u hoạt chất đóng vai trị kích thích tái tạo biểu mơ vết bỏng nơng kích thích tái tạo mơ hạt vết bỏng sâu Nghiên cứu độc tính bán cấp hoạt chất tái sinh mô cho thấy không độc chuột thử nghiệm Trong mơ hình thử nghiệm này, hoạt chất tái sinh mô sử dụng đường tiêm da mà không dùng đường uống thử nghiệm độc tính bán cấp khác Cơ sở việc lựa chọn cách sử dụng thực tế hoạt chất 129 đắp trực tiếp lên tổn thương da, khơng qua q trình hấp thu đường tiêu hóa Hơn dầu mù u theo cách sử dụng truyền thống dân gian dùng da chưa có sở dầu hấp thu qua đường tiêu hóa Vì việc tiêm trực tiếp da chuột cho kết độc tính xác Với liều tiêm 0,01 ml HCTSM / 10 g chuột tương đương liều 50 ml / ngày cho người có trọng lượng 50 kg Đây liều tương đối cao mà thực tế khơng đạt đến liều sử dụng Tuy nhiên với liều khơng xuất độc tính bán cấp chuột Về khả tái tạo biểu mô, làm mau lành vết thương, kết thử nghiệm vết cắt 2,5 cm da đầu thỏ (cùng tất phần mô da lộ xương) cho thấy hoạt chất tái sinh mô làm vết thương mau lành hẳn so với lô chứng: lô điều trị đường kính vết thương chi cịn lại 0,69 cm (còn 27 % so với vết cắt ban đầu) lơ chứng cịn lại 1,18 cm (cịn 47 % so với vết cắt ban đầu) Sử dụng mô hình cắt da đầu thỏ quan sát rõ tác động kích thích tái tạo tồn phần mô da phần biểu mô Trường hợp khơng dùng chất kích thích tái tạo mơ (lơ chứng) tiến trình lành vết thương xảy tự nhiên với phần mơ hạt co lại vết thương chậm Trường hợp nhiễm trùng, vết thương cịn để lộ xương Thử nghiệm tính kích ứng da hoạt chất thực theo USP 28 chuyên đề “Thử nghiệm tính kích ứng da loại dầu thực vật”.[75] Việc lựa chọn phương pháp dựa sở: hoạt chất sử dụng tiếp xúc trực tiếp với vết thương bị da, nên với phương pháp việc tiêm da hoạt chất thử nghiệm cho kết sát với thực tế sử dụng Kết thử nghiệm tính kích ứng da cho thấy hoạt chất tái sinh mô tinh dầu tràm 10 % khơng gây kích ứng da Trong dầu mù u cịn kích ứng da chưa loại hết nhựa, thành phần gây kích ứng Các nghiên cứu trước cho thấy cần nồng độ hoạt chất 50 % phối hợp với tá dược có tác dụng tái sinh mô Việc phối hợp hoạt chất với màng BC tổng hợp nhiều yếu tố có lợi cho tiến trình lành vết thương Đó tác dụng hoạt chất khả màng BC khả che phủ ngăn ngừa ngoại nhiễm, bám dính tốt vào vết thương tạo môi trường ẩm đặc biệt độ tinh cao màng không đưa tạp chất học vào vết thương Chính đơn giản phối hợp hoạt chất 130 với loại vải gạc thơng thường khơng thể có màng điều trị với nhiều điểm thuận lợi cho bệnh nhân Tạo màng trị bỏng Acetul Chế tạo màng trị bỏng Acetul từ màng BC tinh chế hoạt chất đặt vấn đề mấu chốt tìm tá dược thích hợp để biến màng BC có tính thân nước trở nên vừa thân nước vừa thân dầu Thử nghiệm số tá dược tìm tá dược thích hợp Đã tìm tá dược khơng độc hại phép sử dụng vết thương bỏng, từ khảo sát tìm tỷ lệ phối hợp hoạt chất màng BC với lượng tá dược thấp có tác dụng (các thơng tin tá dược mô tả Hồ sơ sản phẩm thử lâm sàng) Nồng độ tá dược sử dụng phối hợp % Việc tăng cao nồng độ tá dược không giúp cho màng thấm hút nước hoạt chất tái sinh mô nhiều Tá dược giúp cho màng BC có khả vừa thấm hút hoạt chất tái sinh mô, tinh dầu vừa thấm hút nước đồng thời giúp màng phục hồi khả thấm hút nước màng Acetul bị khơ, màng có khả giữ ẩm tốt màng BC khơ khả phục hồi tính thấm hút nhiều Đây ưu điểm tá dược khơng có tá dược này, trình sử dụng trường hợp vết thương tiết nhiều dịch sau chuyển sang trạng thái khơ, màng dễ bị dính vào vết thương Các đặc tính lý hóa màng BC tinh chế màng Acetul Màng BC tinh chế màng Acetul có tính chất thấm hút dịch, cản khuẩn, che phủ vết thương tốt có khả cho nước tạo thơng thống cho vết thương Trong thử nghiệm khả thấm hút dịch, sử dụng mơ hình khác để thử nghiệm màng BC tinh chế màng Acetul Với màng BC tinh chế, thử nghiệm đơn giản cho màng ngâm nước với màng Acetul khơng thể áp dụng mơ hình màng Acetul chứa tá dược vừa thân nước vừa thân dầu, ngâm nước việc thành phần màng khó khăn việc xác định trọng lượng màng sau thấm hút nước Vì mơ hình thử nghiệm tạo thạch bán lỏng (chứa tới 99 % nước) sử dụng, sau đặt màng Acetul bề mặt thạch này, từ màng dễ dàng thấm hút nước từ thạch 131 Trong thử nghiệm khả cho thoát nước, màng BC tinh chế màng Acetul tốc độ thoát nước nhanh màng khô Đặc biệt màng BC tinh chế khơ nhanh Như khơng có tá dược hỗ trợ, khả bám dính hút ẩm màng nhiều màng đạt trạng thái khô Thử nghiệm khả cản khuẩn màng, để chứng minh khả cản khuẩn tuyệt đối màng, sử dụng mơ hình nhỏ trực tiếp huyền trọc vi khuẩn lên bề mặt màng Acetul Nếu màng tác dụng cản khuẩn, sau xuyên qua màng vi khuẩn tiếp tục phát triển thạch, cần phải chọn chủng vi khuẩn hiếu khí tùy ý Cũng có giả thiết, khả cản khuẩn vi khuẩn di động nhanh so với vi khuẩn không di động Để giải đáp nghi vấn này, thử nghiệm chọn vi khuẩn thử nghiệm có đặc điểm sau: (1) thường gây nhiễm vết bỏng (Pseudomonas aeruginosa), (2) có kích thước nhỏ (Streptococcus hemolyticus), (3) di động hiếu khí tùy ý (Proteus mirabilis) Kết cho thấy màng BC tinh chế màng Acetul có khả cản tất vi khuẩn Kết phù hợp với kết nghiên cứu nước người ta sử dụng màng BC màng lọc vô trùng chứng minh màng BC tinh chế đạt độ đồng tinh cao Thử nghiệm đo pH màng Acetul cho thấy pH màng đạt khoảng 6,31 ± 0,132 pH da bình thường vào khoảng 5,5 Khi bị bỏng, vết thương trạng thái nhạy cảm, chế phẩm sử dụng cần đạt yêu cầu pH để khơng gây xót rát da pH khơng thích hợp Với pH khoảng trên, màng Acetul khơng gây kích ứng da dùng đắp vào vết thương Các tác dụng sinh học màng Acetul Thử nghiệm khả kháng khuẩn màng Acetul in vitro nhằm kiểm soát chất lượng màng cách nhanh chóng Sử dụng hai phương pháp phương pháp khuếch tán môi trường rắn phương pháp đếm sống Phương pháp thứ có tính chất định tính kháng khuẩn cách quan sát vùng vô khuẩn với phương pháp đếm sống có khả đánh giá mức độ kháng khuẩn Màng Acetul có khả ức chế tăng trưởng vi khuẩn thử nghiệm thời điểm 24 132 Số lượng vi khuẩn S aureus giảm từ 1,5 x 105 3,4 x 102 Tuy nhiên sau 48 vi khuẩn tăng trưởng trở lại 2,5 x 104 Băng nano bạc thể tác dụng kháng khuẩn mạnh vi khuẩn thử nghiệm Như màng Acetul có khả ức chế tăng trưởng vi khuẩn không đạt khả diệt khuẩn Điều đòi hỏi tiếp tục nghiên cứu thêm hoạt chất có tính sát khuẩn mạnh để đạt tác dụng cách hoàn thiện Thử nghiệm khả làm mau lành vết thương màng Acetul in vivo cho thấy lô điều trị màng Acetul cho kết vết bỏng lành nhanh với diện tích vết thương cịn lại 1,57 % so với diện tích ban đầu Lơ điều trị màng BC phối hợp với hoạt chất tái sinh mô cho kết tốt với diện tích vết bỏng cịn lại 1,93 % lơ đắp màng BC cịn lại 10,8 % lơ chứng cịn 23,58 % Các xét nghiệm tế bào động vật thử nghiệm không thấy tế bào bất thường sử dụng màng Acetul Tính ổn định màng Tính ổn định màng xác định dựa tính ổn định thành phần màng Tính ổn định màng BC Với cấu trúc cellulose, sau thời gian bảo quản đặc tính thay đổi độ bền học khả cản khuẩn, cần kiểm sốt hai đặc tính màng Kết cho thấy màng bảo quản điều kiện nhiệt độ phịng sau 30 tháng có độ bền học X =3,12 ± 0,13 kN/m so với độ bền tiêu chuẩn đặt B = 3,15 ± 0,1 kN/m Tất màng thử nghiệm giữ đặc tính cản khuẩn Như độ bền học khả cản khuẩn màng BC tinh chế không bị thay đổi bảo quản nhiệt độ phòng sau 30 tháng Tính ổn định hoạt chất Hoạt chất tái sinh mô, với thành phần acid béo, có acid béo khơng no có biến đổi thời gian bảo quản nằm giới hạn cho phép Các acid không no acid linoleic có hàm lượng từ 29,31 % giảm 28,11 %, acid 133 eicosenoic giảm từ 0,26 % cịn 0,18 % Tuy nhiên kiểm tra hoạt tính sinh học hoạt chất tái sinh mô sau bảo quản 30 tháng mơ hình cắt da đầu thỏ, với lô điều trị hoạt chất tái sinh mô bảo quản 30 tháng cho tác dụng mau lành vết thương rõ rệt: đường kính vết thương lại vết thương 0,73 cm lô chứng 1,18 cm Tinh dầu tràm trà Úc có tính ổn định Trong khoảng thời gian 24 tháng, tính kháng khuẩn tinh dầu không thay đổi thể giá trị MIC ức chế vi khuẩn thử nghiệm MIC S aureus 0,0032 ml, P aeruginosa 0,064 ml Tuy nhiên sau 30 tháng giá trị MIC tăng gấp lần cho thấy hiệu lực kháng khuẩn giảm nhiều Vì để có tác dụng ức chế vi khuẩn, hạn sử dụng màng Acetul giới hạn 24 tháng cần tiếp tục khảo sát thành phần tinh dầu bị biến đổi theo thời gian Đánh giá hiệu điều trị màng trị bỏng lâm sàng Trong điều trị vết thương, vật liệu che phủ cần đạt tiêu chuẩn: vơ khuẩn, khơng gây dị ứng, an tồn sử dụng, thời gian bị đào thải dài, đàn hồi tốt, không gây ảnh hưởng đến cử động, che phủ tốt, ngăn chặn nước, điện giải qua vết thương có tác dụng giảm đau Bên cạnh số đặc tính màng có tác dụng hỗ trợ cho q trình lành vết thương có khả ức chế phát triển vi khuẩn, kích thích liền vết thương khơng gây sẹo phì đại, giá thành phù hợp Dễ sử dụng, dễ bảo quản đặc tính làm nâng cao giá trị sử dụng màng Trên thực tế, loại băng che phủ vết thương trước hết cần phải giữ độ ẩm thích hợp, trì nhiệt độ vết thương, bảo vệ tế bào, tăng cường tái tạo mạch máu biểu mơ hóa, giảm đau chống lại xâm nhiễm vi khuẩn Màng Acetul hydrogel tự nhiên có đặc tính tốt hydrogel sản xuất từ polymer tổng hợp thành phần nước chiếm tỷ lệ cao (70 %), thấm hút tốt, bền môi trường ẩm, độ tinh khiết cao Màng BC cung cấp mơi trường ẩm thích hợp cho trình lành vết thương Với đặc điểm mỏng, mềm mại, đắp vào vết thương màng Acetul bám dính làm giảm đau đớn cho bệnh nhân, giảm số lần thay băng, ngăn chặn thoát dịch, huyết tương, tạo điều kiện thuận lợi cho trình biểu mơ hố liền sẹo Khi kết hợp với thành phần làm tăng khả 134 kháng khuẩn màng BC vật liệu che phủ thích hợp với loại vết thương bỏng, loét vết thương cần phải thay băng thường xuyên Với bỏng sâu cần phải phẫu thuật thời gian liền vùng lấy da liên quan đến ngày nằm điều trị bệnh nhân, đặc biệt bệnh nhân bỏng nặng yêu cầu vùng lấy da phải lành nhanh để chuẩn bị lấy da ghép cho lần sau Trong nghiên cứu này, vùng lấy da (nhóm 1) cho thấy: màng Acetul bám dính vào tổn thương, khả thấm dịch tốt, 35/40 bệnh nhân đắp màng lần, không gây đau rát Màng khô sau 4,5 ± 1,6 có độ mềm cần thiết để bệnh nhân vận động sớm tương đương với nhóm chứng đắp băng nano bạc Với chất cellulose tự nhiên nên màng mỏng, mềm mại, đắp vào vết thương màng Acetul bám dính làm giảm đau đớn cho bệnh nhân, giảm số lần thay băng, ngăn chặn thoát dịch, huyết tương, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình biểu mơ hóa lành sẹo Màng dễ dàng bóc bỏ, khơng làm tổn thương đến lớp tế bào tái tạo Tác dụng chống viêm, giảm đau màng Acetul Khi bị bỏng, chỗ vết bỏng có phản ứng viêm cấp với triệu chứng điển hình sưng, nóng, đỏ, đau, xuất tiết Phản ứng viêm có lợi cho trình sinh học liền vết thương bỏng, đáp ứng viêm mức cản trở cho liền vết thương sau Phù nề mức dẫn tới tình trạng ứ trệ tuần hồn, đặc biệt vi tuần hồn, gây tình trạng thiếu oxy mơ, gây rối loạn chuyển hóa tế bào vùng thương tổn lân cận, từ giải phóng chất trung gian chuyển hóa làm giãn mạch tăng tính thấm, làm phù nề xung huyết mạnh Mặt khác, dịch phù bỏng khoảng khe kẽ phần mềm vùng tổn thương bỏng lân cận nơi chứa hoạt chất trung gian, sản phẩm chuyển hóa, chất có chất gây cảm giác đau histamine, bradykinine…chúng cảm ứng kích hoạt sợi thần kinh thống giác gây nên cảm giác đau Bên cạnh đó, phản ứng viêm mức gây chèn ép thụ thể thần kinh góp phần gây đau bỏng 135 Khi lấy mảnh da mỏng với độ dày 0,2 – 0,25 mm tương đương vết bỏng độ II, III chỗ có biểu viêm cấp với biểu sưng, nóng, đỏ đau xuất tiết.[5] Theo dõi lâm sàng nhóm đắp màng Acetul tình trạng viêm nề giảm dần hết sau – ngày tương đương với nhóm chứng che phủ băng nano bạc Nhóm (vết thương bỏng nơng) tình trạng viêm nề giảm với độ II từ ngày thứ đến ngày thứ Số lần thay băng 1,7 ± 0,3 ngày Tổn thương bỏng độ III viêm nề giảm từ ngày thứ đến ngày thứ 5, số lần thay băng 3,5 ± 1,1 ngày Màng bám vào vết thương tốt nên có tác dụng che phủ tránh kích thích từ bên ngồi, giảm số lần thay băng đau đớn cho bệnh nhân, giữ độ ẩm thích hợp cho trình lành vết thương Một biểu khác trình viêm tình trạng dịch rỉ viêm xuất tiết bề mặt vết thương bỏng Kết thử nghiệm cho thấy vùng nghiên cứu đắp màng Acetul, dịch tiết giảm ngày thứ bỏng độ II ngày thứ bỏng độ III Màng bám dính vào vết thương, tương đương với nhóm chứng đắp băng nano bạc Kết nghiên cứu thu tương ứng với kết xét nghiệm tế bào tiêu áp với số lượng tế bào viêm giảm sau ngày nghiên cứu vùng Tuy nhiên, số lượng tế bào viêm (SLTBV) / Đơn vị diện tích (ĐVDT) nhóm chứng đắp băng nano bạc giảm rõ rệt (21,3 ± 7,1 xuống 12,6 ± 4,1 so với 23,1 ± 6,2 xuống 8,6 ± 2,5) Dịch tiết giảm phản ánh trình viêm giảm, điều kiện thuận lợi cho trình lành vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn chỗ Theo dõi lâm sàng, nhóm đắp màng Acetul tình trạng viêm nề giảm dần hết sau – ngày tương đương với nhóm chứng che phủ băng nano bạc Màng bám vào vết thương tốt nên có tác dụng che phủ tránh kích thích từ bên ngoài, giảm số lần thay băng đau đớn cho bệnh nhân, tạo độ ẩm thích hợp cho q trình lành vết thương Tác dụng kích thích biểu mơ hố lành vết thương màng Acetul Qua nghiên cứu vùng lấy da (nhóm 1) cho thấy: với khả bám dính tốt vào vết thương, màng Acetul có tác dụng che phủ, ngăn cản xâm nhập vi khuẩn, giảm thoát dịch thể, giảm đau, phục hồi trình tái tạo lành vết thương Thời 136 gian lành vết thương vùng lấy da 11,6 ± 1,6 ngày tương đương với nhóm chứng đắp băng nano bạc 10,5 ± 1,5 ngày với p