Nghiên cứu quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu huyết thanh ứng dụng trong ngoại kiểm test nhanh helicobacter pylori

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ THANH TRÚC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH ỨNG DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM TEST NHANH HELICOBACTER PYLORI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NGUYỄN THỊ THANH TRÚC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH ỨNG DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM TEST NHANH HELICOBACTER PYLORI Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS TRẦN THIỆN TRUNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả NGUYỄN THỊ THANH TRÚC i MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng viii Danh mục sơ đồ xi Danh mục biểu đồ xi ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát vi khuẩn Helicobacter pylori 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn 1.1.3 Kháng nguyên độc tố 1.1.4 Các yếu tố nguy đường lây 1.1.5 Miễn dịch 1.1.6 Dịch tễ học nhiễm H pylori 1.1.7 Tầm quan trọng việc chẩn đoán nhiễm H pylori 10 1.1.8 Phương pháp chẩn đoán nhiễm H pylori 11 1.2 Ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm (EQA) 15 1.2.1 Định nghĩa 15 1.2.2 Phương thức áp dụng ngoại kiểm 16 1.2.3 Vị trí tầm quan trọng ngoại kiểm 17 1.2.4 Mẫu ngoại kiểm 18 1.3 Tình hình ngoại kiểm giới Việt Nam 21 1.3.1 Trên giới 21 1.3.2 Tại Việt Nam 22 1.3.3 Tình hình ngoại kiểm test nhanh 22 i 1.4 Phương pháp bảo quản mẫu ngoại kiểm 24 1.4.1 Phương pháp đông khô 24 1.4.2 Phương pháp đông lạnh 25 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Thời gian nghiên cứu 26 2.2 Địa điểm nghiên cứu 26 2.3 Thiết kế nghiên cứu 26 2.4 Đối tượng nghiên cứu 26 2.5 Tiêu chí chọn mẫu 26 2.5.1 Tiêu chuẩn đưa vào 26 2.5.2 Tiêu chuẩn loại trừ 26 2.6 Cỡ mẫu 27 2.7 Xử lý số liệu 27 2.8 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 28 2.9 Tiến hành thử nghiệm: 30 2.9.2 Kỹ thuật chuyển đổi huyết tương thành huyết 32 2.9.3 Đánh giá độ đặc hiệu kháng thể IgG kháng H pylori 33 2.9.4 Xác định đặc tính mẫu 33 2.9.5 Phân phối mẫu 34 2.9.6 Bảo quản mẫu 34 2.10 Phương pháp đánh giá tính đồng độ ổn định mẫu 35 2.10.1 Đánh giá tính đồng 35 2.10.2 Đánh giá độ ổn định 37 2.11 Phương pháp ELISA đánh giá độ đặc hiệu kháng thể IgG kháng H pylori 39 2.11.1 Vật liệu cần thiết 39 2.12 Kiểm soát sai lệch 42 2.12.1 Kiểm soát sai lệch lựa chọn 42 v 2.12.2 Kiểm sốt sai lệch thơng tin 42 2.12.3 Sai lệch phương pháp xử lý mẫu 42 2.12.4 Kiểm soát sai lệch kết 42 2.13 Vấn đề y đức 43 2.14 Tính ứng dụng 43 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 44 3.1 Kết sản xuất thử nghiệm mẫu huyết chứa kháng thể IgG kháng H pylori dùng ngoại kiểm test nhanh 44 3.1.1 Kết sàng lọc mẫu huyết sau thu thập 44 3.1.3 Kết xác định đặc tính mẫu huyết 48 3.2 Kết đánh giá tính đồng 50 3.2.1 Bộ mẫu dương tính 51 3.3 Kết đánh giá độ ổn định 55 3.3.1 Kết đánh giá độ ổn định dài hạn 55 3.3.2 Kết đánh giá độ ổn định ngắn hạn 66 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 71 4.1 Sản xuất thử nghiệm mẫu huyết chứa kháng thể IgG-H pylori 71 4.1.1 Sàng lọc tác nhân HBsAg, Anti-HCV Anti-HIV 1/2 73 4.1.2 Đánh giá độ đặc hiệu kháng thể IgG kháng H pylori 74 4.1.3 Xác định đặc tính mẫu nhiều loại sinh phẩm 76 4.2 Tính đồng mẫu sản xuất phương pháp đông khô đông lạnh 78 4.3 Độ ổn định mẫu sản xuất theo nhiệt độ thời gian 79 KẾT LUẬN 83 KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt BYT Bộ Y tế CLXN Chất lượng xét nghiệm ĐHYD Đại học Y Dược HTTĐL Huyết tương tươi đơng lạnh KN Kháng ngun KT Kháng thể PXN Phịng xét nghiệm TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam UTDD Ung thư dày Tiếng Anh CIM Current Infection Marker (Dấu ấn nhiễm trùng tại) COI Cut-off index (Giá trị điểm cắt) CRM Certificate Reference Material (Mẫu chuẩn chứng nhận) EIA Enzyme Immunoassay (Xét nghiệm miễn dịch men) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme) EQA External Quality Assessment (Ngoại kiểm tra) IQC Internal Quality Control (Nội kiểm tra) i IARC International Agency for Research on Cancer (Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế) ISO International Organization for Standardization (Tổ chức quốc tế tiêu chuẩn hóa) NPV Negative Predictive Value (Giá trị tiên đoán âm) OD Optical Density (Mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại kiểu gen) PPV Positive Predictive Value (Giá trị tiên đoán dương) QC Quality Control (Kiểm soát chất lượng) RCPAQAP The Royal College of Pathologists of Australasia Quality Assurance Programs (Chương trình đảm bảo chất lượng Đại học Hồng gia bệnh học-Úc) RM Reference Material (Mẫu chuẩn) Se Sensitivity (Độ nhạy) Sp Specificity (Độ đặc hiệu) WHO World Heath Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) i DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn Helicobacter pylori Hình 1.2 Tình hình nhiễm H pylori giới Hình 1.3 Xét nghiệm sắc ký miễn dịch với kit ASSURE® H pylori Rapid Test 15 Hình 1.4 Các phương thức ngoại kiểm tra 16 Hình 3.1 Kết sàng lọc mẫu huyết 45 Hình 3.2 Mẫu huyết âm tính với IgG-H pylori sau chuyển đổi 46 Hình 3.3 Xác định đặc tính mẫu 48 Hình 3.4 Xử lý mẫu phương pháp đơng khô 50 ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Độ nhạy, độ đặc hiệu kit ELISA 13 Bảng 2.1 Số lượng mẫu sản xuất 27 Bảng 2.2 Thiết bị máy móc 28 Bảng 2.3 Hóa chất, thuốc thử 29 Bảng 2.4 Dụng cụ vật tư tiêu hao 29 Bảng 2.5 Phân phối mẫu 34 Bảng 3.1 Kết sàng lọc nguyên liệu ban đầu 44 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ đặc hiệu xét nghiệm ELISA 47 Bảng 3.3 Bảng đánh giá đặc tính mẫu sinh phẩm test nhanh 49 Bảng 3.4 Bảng đánh giá đặc tính mẫu sinh phẩm ELISA 49 Bảng 3.5 Kết đánh giá tính đồng mẫu KD 51 Bảng 3.6 Kết đánh giá tính đồng mẫu LD 52 Bảng 3.7 Kết đánh giá tính đồng mẫu KA 53 Bảng 3.8 Kết đánh giá tính đồng mẫu LA 54 Bảng 3.19 Độ ổn định dài hạn mẫu KD80 lưu trữ -80ºC 55 Bảng 3.10 Độ ổn định dài hạn mẫu KD20 lưu trữ -20ºC 56 Bảng 3.11 Độ ổn định dài hạn mẫu LD80 lưu trữ -80ºC 57 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ MẪU LD KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT BỘ MẪU LD 10 Lần 2.902 2.7 2.857 2.814 2.749 2.845 2.852 2.715 2.84 2.974 Lần 2.671 2.58 2.869 2.688 2.715 2.837 2.777 2.7 2.837 2.851 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 2 10 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sum 5.5727692 5.28 5.7261538 5.5015385 5.4646154 5.6815385 5.6292308 5.4153846 5.6769231 5.8246154 SS 0.11994 0.05311 0.17304 Average 2.7863846 2.64 2.8630769 2.7507692 2.7323077 2.8407692 2.8146154 2.7076923 2.8384615 2.9123077 Variance 0.0267338 0.0072 7.574E-05 0.0079574 0.0005728 2.959E-05 0.0028414 0.0001183 4.734E-06 0.007574 df MS F P-value F crit 0.01333 2.50927 0.08402 3.02038 10 0.00531 19 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ MẪU KA KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT BỘ MẪU KA 10 Lần 0.278 0.272 0.278 0.275 0.271 0.278 0.254 0.25 0.249 0.244 Lần 0.269 0.254 0.266 0.265 0.259 0.253 0.262 0.268 0.251 0.257 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count 2 10 ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups Total Sum 0.5479042 0.5269461 0.5449102 0.5404192 0.5299401 0.5314371 0.5164671 0.5179641 0.5 0.501497 SS 0.001 0.001 0.002 Average 0.2739521 0.2634731 0.2724551 0.2702096 0.2649701 0.2657186 0.2582335 0.258982 0.25 0.2507485 df MS 0.0001 10 0.0001 19 Variance 4.034E-05 0.0001614 7.171E-05 5.491E-05 7.171E-05 0.0003238 2.801E-05 0.0001614 4.482E-06 9.076E-05 F P-value 1.39 0.307 F crit 3.02 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh BỘ MẪU LA KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỒNG NHẤT BỘ MẪU LA 10 Lần 0.275 0.289 0.272 0.268 0.274 0.272 0.258 0.266 0.278 0.269 Lần 0.257 0.269 0.269 0.268 0.189 0.266 0.292 0.275 0.32 0.323 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance 2 2 2 2 0.532 0.558 0.542 0.535 0.463 0.538 0.551 0.542 0.598 0.266 0.279 0.271 0.268 0.231 0.269 0.275 0.271 0.299 0.000170414 0.0002 4.73373E-06 0.003599435 1.89349E-05 0.000572781 4.26036E-05 0.000862722 10 0.592 0.296 0.001449704 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Between Groups Within Groups Total 0.006 0.007 0.013 10 19 7E-04 7E-04 0.994 0.499 3.02 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 03 BẢNG PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH DÀI HẠN SAU TUẦN, TUẦN VÀ 12 TUẦN (KIỂM ĐỊNH T–TEST) BỘ MẪU KD lƣu trữ -80°C (KD80) t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances 2.607784431 Bộ mẫu KD80 sau 04 tuần Mean 2.722029625 Variance 0.00596737 Observations 19 Pooled Variance 0.005351757 Hypothesized Mean Difference df 22 t Stat 1.803163464 P(T