Nghiên cứu quy trình sản xuất thực nghiệm mẫu huyết thanh chẩn đoán bệnh gạo heo (cysticercus celulosae) sử dụng trong ngoại kiểm

` BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỰC NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN BỆNH GẠO HEO (CYSTICERCUS CELULOSAE) SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỰC NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH CHẨN ĐỐN BỆNH GẠO HEO (CYSTICERCUS CELULOSAE) SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM NGÀNH: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số: 8720601 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ QUANG HUY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2018 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu hồn tồn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sán dải heo (Taenia solium) .3 1.2 Ấu trùng sán dải heo (Cysticercus cellulosae) 1.3 Khái quát chung ngoại kiểm 23 1.4 Mẫu ngoại kiểm 33 1.5 Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng mẫu ngoại kiểm 37 1.6 Tình hình cung cấp ngoại kiểm giới nước 40 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Thiết kế nghiên cứu 42 2.2 Cỡ mẫu 42 2.3 Đối tượng nghiên cứu .42 2.4 Tiêu chuẩn chọn mẫu 42 2.5 Phương pháp thu thập số liệu 43 2.6 Kỹ thuật xét nghiệm .44 2.7 Quá trình sản xuất mẫu ngoại kiểm (hình 2.10) .47 2.8 Vấn đề y đức 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .59 3.1 Thu thập nguyên liệu 59 3.2 Đánh giá nguyên liệu ban đầu 59 3.3 Chia nhỏ, bảo quản 62 3.4 Đánh giá chất lượng mẫu sản xuất 63 3.5 Đánh giá tác động hai yêu tố nhiệt độ thời gian 68 iv 3.6 Xây dựng quy trình tạo mẫu ngoại kiểm 71 CHƯƠNG BÀN LUẬN 74 4.1 So sánh kỹ thuật ELISA với kỹ thuật western – blot .74 4.2 Quy trình sản xuất thử nghiệm mẫu ngoại kiểm 76 4.3 Chất lượng mẫu huyết sau sản xuất 79 KẾT LUẬN 83 KIẾN NGHỊ 84 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt Bệnh viện BV CEIA Erythroimmunoadsortion by capture CRM Certified Reference Material ĐHYD Vật liệu ngoại kiểm chứng nhận Đại Học Y Dược EITB Electroimmunotransfer blot Miễn dịch điện di ELISA Enzym Linked Immunosorbent Assay Phản ứng liên kết enzym EQA External Quality Assessment Ngoại kiểm tra chất lượng IEC International Electrotechnical Commissom Ủy ban kỹ thuật điện quốc tế ISO International Standard Organization Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế KN Kháng nguyên KST Ký sinh trùng KT Kháng thể NTDs Neglected Tropical Diseases Bệnh nhiệt đới bị lãng quên OD Optical density Mật độ quang học QA Quality Assurance Đảm bảo chất lượng QC Quality Control Kiểm tra chất lượng RM Reference Material Vật liệu ngoại kiểm T solium Taenia solium Sán dải heo TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TP HCM Thành phố Hồ Chí Minh WB Western blot Điện di miễn dịch WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Đốt sán Taenia solium .3 Hình 1.2 Đầu sán Taenia solium trưởng thành Hình 1.3 Trứng sán Taenia solium Hình 1.4 Chu trình lây nhiễm Taenia solium Hình 1.5 Những vùng có tỷ lệ cao nhiễm Cysticercus cellulosae, 2009 10 Hình 1.6 Kỹ thuật ELISA .16 Hình 1.7 Kỹ thuật Western blot 18 Hình 1.8 Hình ảnh băng Western blot 22 Hình 1.9 Protein GP50 băng Western blot 22 Hình 1.10 12 thành tố hệ thống quản lý chất lượng .24 Hình 1.11 Quy trình hoạt động phòng xét nghiệm 25 Hình 1.12 Vị trí ngoại kiểm đảm bảo chất lượng xét nghiệm 26 Hình 1.13 Các chương trình ngoại kiểm tồn cầu WHO .28 Hình 1.14 Sơ đồ kiểm tra độ thành thạo .30 Hình 1.15 Quy trình thực chu kỳ ngoại kiểm 31 Hình 1.16 Q trình đơng khơ Viện Hàn Lâm Khoa Học Cơng Nghệ 36 Hình 2.1 Quy trình kỹ thuật ELISA .45 Hình 2.2 Thu thập huyết .48 Hình 2.3 Tách chiết huyết 48 Hình 2.4 Sàng lọc mẫu với xét nghiệm nhanh .49 Hình 2.5 Kết xét nghiệm nhanh .49 Hình 2.6 Chia lơ đơng lạnh đông khô 50 Hình 2.7 Đơng lạnh mẫu huyết 51 Hình 2.8 Đông khô mẫu huyết 52 Hình 2.9 Quy trình sản xuất mẫu huyết 53 Hình 2.10 Q trình đánh giá tính đồng .55 Hình 2.11 Quá trình đánh giá độ ổn định .57 vii Hình 3.1 Kết kết hợp KN – KT Cysticercosis 61 Hình 3.2 Biểu đồ thể ảnh hưởng nhiệt độ đến mẫu đơng khơ 68 Hình 3.3 Biểu đồ thể ảnh hưởng nhiệt độ lên mẫu đông lạnh .69 Hình 3.4 Xu hướng thay đổi mẫu đông khô theo thời gian 70 Hình 3.5 Xu hướng thay đổi mẫu đông lạnh theo thời gian 70 Hình 3.6 Đánh giá độ ổn định ngắn hạn .71 viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Độ nhạy độ đặc hiệu 20 Bảng 1.2 Phản ứng chéo kỹ thuật ELISA chẩn đoán Taenia solium 21 Bảng 1.3 So sánh kỹ thuật WB kỹ thuật ELISA .23 Bảng 1.4 Mối quan hệ giữ nhiệt độ áp suất .37 Bảng 2.1 Máy móc trang thiết bị .44 Bảng 2.2 Dụng cụ vật tư tiêu hao 44 Bảng 2.3 Hóa chất sử dụng kỹ thuật ELISA .45 Bảng 2.4 Hóa chất sử dụng kỹ thuật Western blot 46 Bảng 2.5 Quy trình làm test nhanh .49 Bảng 2.6 Biến thiên nhiệt độ đánh giá độ ổn định ngắn hạn 56 Bảng 3.1 Kết sàng lọc test nhanh HbsAg, Anti-HCV, HIV 1/2 59 Bảng 3.2 Kết trị số OD ban đầu mẫu 60 Bảng 3.3 Kết Western blot (WB) 60 Bảng 3.4 Chia nhỏ mẫu huyết 62 Bảng 3.5 Phân lô mẫu huyết theo nhiệt độ 62 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ đồng 63 Bảng 3.7 Trị số OD mẫu sau tháng .64 Bảng 3.8 Trị số OD mẫu sau tháng .65 Bảng 3.9 Trị số OD mẫu sau tháng .66 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nghiên cứu thực nghiệm thực tế, để phát điều trị thành công bệnh người, động vật, thực vật, chẩn đoán ban đầu ln đóng vai trị thiết yếu Khoa học phát triển, việc chẩn đoán điều trị bệnh dễ dàng sử dụng máy móc, kỹ thuật đại, giúp cơng tác khám chữa bệnh nhanh chóng, hiệu Tuy nhiên, q trình thao tác xảy sai sót, dẫn đến sai lệch kết xét nghiệm Vì vậy, đảm bảo chất lượng xét nghiệm vấn đề đáng quan tâm, việc hướng đến liên thông kết phịng xét nghiệm Q trình ngoại kiểm cần mẫu kiểm đạt tiêu chuẩn chất lượng, an toàn, đồng ổn định Hiện nay, sở nước chưa sản xuất sinh phẩm, dùng để kiểm tra chất lượng xét nghiệm miễn dịch chẩn đoán bệnh ký sinh trùng đặc biệt bệnh gạo heo (cysticercocis) nói riêng Vì thế, phòng xét nghiệm nước chưa chưa xây dựng chương trình ngoại kiểm huyết học Bệnh sán trưởng thành (taeniasis) bệnh gạo heo (cysticercosis) phân bố rộng rãi Việt Nam, gây nguy hại cho sức khoẻ, đặc biệt chứng rối loạn thần kinh nghiêm trọng Loài Taenia Việt Nam bao gồm T asiatica, T saginata, T.solium T solium gây bệnh gạo heo người [48] Theo Burneo, Garcia Takayanagui O.M (2001), giới có khoảng 20 triệu người nhiễm gạo heo 50.000 người chết năm bệnh [53] [32] [62] Theo tài liệu WHO, bệnh phổ biến nước châu Á, châu Phi châu Mỹ La Tinh, tỷ lệ 0,7% - 22,6% [2] [6] [10] [11] [14] [50] Ngoại trừ bệnh da chẩn đoán trực tiếp phương pháp sinh thiết Cysticercus cellulosae quan khó chẩn đốn Vì vậy, nhà khoa học nghiên cứu tìm nhiều kỹ thuật huyết học chẩn đoán để phát kháng thể kháng gạo heo như: miễn dịch huỳnh quang, ngưng kết hồng cầu, miễn dịch hấp phụ gắn enzym (ELISA) Western blot Y văn giới ghi nhận tác giả Costa J.M (1986), Wang K.H (1993), Simac C 1995, Vaz A.T (1996), Dekumyoy P (1998), Silva A.D (2000), Bueno E.C (2000), Das S (2002), Bragazza (2002) điều chế kháng nguyên từ gạo heo để dùng kỹ thuật ELISA [42] [51] Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... KIỀU MỸ NGỌC MINH TÂM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT THỰC NGHIỆM MẪU HUYẾT THANH CHẨN ĐOÁN BỆNH GẠO HEO (CYSTICERCUS CELULOSAE) SỬ DỤNG TRONG NGOẠI KIỂM NGÀNH: KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số: 8720601... hiệu Xuất phát từ thực tiễn, với mong muốn sản xuất mẫu huyết kiểm chuẩn đảm bảo chất lượng, sử dụng ngoại kiểm xét nghiệm ký sinh trùng, chúng tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu quy trình sản xuất thực. .. trình sản xuất thực nghiệm mẫu huyết chẩn đoán bệnh gạo heo (Cysticercus cellulosae) sử dụng ngoại kiểm. ” Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Western blot để xác định mẫu chuẩn Kết nghiên cứu không nhằm nâng