Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây lan một lá nervilia fordii

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TP.HCM TRUNG TÂM ƯƠM TẠO DOANH NGHIỆP NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NĂM 2016 Xây dựng quy trình nhân giống in-vitro lan (Nervilia fordii) CHỦ NHIỆM: ThS Phan Thị Hồng Thủy CN Nguyễn Văn Toàn THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2016 MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu loài lan (Nervilia fordii) Vị trí phân loại Đặc điểm sinh học 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Hoạt tính chất chứa Lan 1.4 Công dụng sử dụng y học cổ truyển 1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống in-vitro Lan CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10 2.1 Địa điểm, thời gian vật liệu nghiên cứu 10 Địa điểm thời gian thực .10 Vật liệu, thiết bị 10 2.2 Nội dung nghiên cứu 10 Nội dung 1: Xây dựng qui trình vơ mẫu Lan (Nervilia fordii) 10 Nội dung 2: Nghiên cứu thành phần môi trường tạo cụm chồi Lan 12 Nội dung 3: Nghiên cứu thành phần môi trường tái sinh Lan 13 i Nội dung 4: Nghiên cứu thành phần môi trường tạo rễ tạo hoàn chỉnh Lan .14 2.3 Phương pháp thí nghiệm 15 Phương pháp khử trùng mẫu chồi 15 Phương pháp nuôi cấy tạo chồi 16 Phương pháp nuôi cấy tái sinh từ chồi in vitro 16 Phương pháp rễ tạo hoàn chỉnh .16 Phương pháp thu thập số liệu 16 Các tiêu theo dõi 17 Phương pháp phân tích số liệu 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Nội dung 1: Xây dựng qui trình vơ mẫu Lan (Nervilia fordii) 19 Ảnh hưởng thời gian khử trùng Thủy ngân 0,1% mẫu thân củ Lan 19 Xác định môi trường cảm ứng tạo chồi từ thân củ Lan 20 3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu thành phần môi trường tạo cụm chồi Lan 23 Ảnh hưởng BA đến khả tạo cụm chồi Lan 23 Ảnh hưởng BA đến tái sinh chồi từ thân rễ Lan 25 3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu thành phần môi trường tái sinh Lan 27 Ảnh hưởng NAA đến khả tái sinh .27 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu thành phần môi trường tạo rễ tạo hoàn chỉnh Lan 28 Ảnh hưởng NAA IBA đến khả rễ tạo in vitro hoàn chỉnh 28 ii 3.5 Kết đề tài 28 3.6 Chi phí sản xuất 28 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 4.1 Kết luận 29 4.2 Kiến nghị 29 PHỤ LỤC I 30 PHỤ LỤC II 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CT Công thức ĐC Đối chứng CV% Hệ số biến động (Correlation of Variance) LSD0,05 Sai khác tối thiểu có ý nghĩa P - 0, 05 MS Murashige Skoog, 1962 BA 6-benzyladenin IBA indol-3-acetic acid NAA 1-naphthylacetic acid iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm thời gian khử trùng thân củ Lan HgCl2 0,1% 11 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng BA, NAA đến khả cảm ứng tạo chồi từ thân củ Lan 12 Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng BA mơi trường cảm ứng tạo cụm chồi 12 Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng NAA đến khả tái sinh Lan 13 Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng NAA IBA đến rễ chồi Lan 14 Bảng 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến hiệu khử trùng mẫu 19 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nồng độ BA NAA đến khả tạo chồi từ thân củ Lan 21 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ BA đến hình thành cụm chồi cụm thân rễ Lan 23 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA đến khả tái sinh chồi từ thân rễ Lan 26 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Lan N Fordii .6 Hình 3.1 Thân củ Lan môi trường vô mẫu .20 Hình 3.2 Chồi hình thành từ thân củ Lan nghiệm thức CT2 (a Chồi hình thành sau 1,5 tháng theo dõi; b Chồi hình thành sau tháng theo dõi) 22 Hình 3.3 Thân rễ hình thành từ mẫu Lan (a Thân rễ hình thành sau tháng theo dõi; b Thân rễ hình thành sau tháng theo dõi) .22 Hình 3.4 Các giai đoạn hình thành Lan qua đường từ thân rễ (a Giai đoạn thân rễ; b Giai đoạn biệt hóa thân rễ thành chồi non; c Cây Lan hoàn chỉnh) 23 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ BA đến trình tạo cụm thân rễ Lan (a BA 1mg/l; b BA 2mg/l; c BA mg/l) 24 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ BA đến phát triển thân rễ Lan (a BA 1mg/l; b BA mg/l; C BA 3mg/l) .25 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ thân rễ Lan (a BA 0mg/l; b BA 0,1mg/l; c BA 0,3 mg/l; d BA 0,5 mg/l; d BA 0,7mg/l) .27 Hình 3.8 Chồi Lan phát triển từ thân rễ sau tháng nuôi cấy .27 PHẦN MỞ ĐẦU Thông tin đề tài Chủ nhiệm Họ tên: Nguyễn Văn Toàn Năm sinh: 1983 Nam/Nữ: nam Học vị: Cử nhân Chuyên ngành: Sinh học Năm đạt học vị: 2006 Chức vụ: Trưởng phịng Hỗ trợ cơng nghệ tế bào Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, Tp.HCM Điện thoại quan: 08 62646103 Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: 120, đường 489, ấp 2, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP.HCM Điện thoại: 01212816981 Email: vantoanttut@gmail.com Chủ nhiệm Họ tên: Phan Thị Hồng Thủy Năm sinh: 05/02/1987 Nam/Nữ: Nữ Học vị: Thạc sỹ Chuyên ngành:Công nghệ Sinh học Năm đạt học vị: 2014 Chức vụ (nếu có): Chun viên phịng Hỗ trợ cơng nghệ tế bào thực vật Tên quan công tác: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp NNCNC Địa quan: Ấp 1, xã Phạm Văn Cội, huyện Củ Chi, TP HCM Điện thoại quan: 08 62646103 ; Fax: 08 62646104 Địa nhà riêng: 201 Nguyễn Văn Khạ - Phú Hịa Đơng- Củ Chi - HCM Điện thoại nhà riêng: ĐTDĐ: 01212525584 E-mail: hongthuyitb@gmail.com Cơ quan chủ trì: Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp Nông nghiệp Công nghệ cao Cán phối hợp chính: Chữ Họ tên TT (Học vị chức Chuyên ngành Cơ quan công tác danh KH) ký xác nhận tham gia đề tài Trung tâm Ươm tạo Công nghệ sinh Doanh nghiệp Nông KS Lê Thị Sang học nghiệp Công nghệ cao TP.HCM Trung tâm Ươm tạo CN Trịnh Thị Công nghệ sinh Doanh nghiệp Nông Minh Trâm học nghiệp Công nghệ cao TP.HCM 2 Tính cấp thiết đề tài Suy giảm diện tích rừng kèm theo suy giảm hay biến thảm thực vật quý điều tất yếu diễn ngày đất nước Tình trạng khai thác rừng bừa bãi lấy lâm sản phục vụ đời sống chưa kiểm sốt triệt để dẫn đến những lồi dược liệu q bị bào mịn dần Vì lợi ích kinh tế, phận người dân khai thác những dược liệu quý kim tuyến, chè đắng, lan đem bán sang Trung Quốc, làm cạn kiệt lồi dược liệu q Ở Việt Nam có khoảng lồi chi Nervilia gồm: Nervilia punctata (Blume) Makino, Nervilia aragoana Gaudich, Nervilia crociformis (Zoll & Moritzi) Seidenf, Nervilia gracilis Aver, Nervilia fordii (Hance) Schltr, Nervilia macroglossa (Hook f.) Schltr, Nervilia marutana S.W Gale et S.K Wu, Nervilia plicata (Andrews) Schltr ,Cây Nervilia Roptrostemom phát vào năm 1828 (Viện Dược liệu, 2003; Võ Văn Chi, 2012) Các loài lan loài nguy cấp Sách đỏ Việt Nam (2007), nằm danh mục thực vật nghiêm cấm khai thác sử dụng theo nghị định số 48/2002/NĐ-CP ngày 22-4-2002 Danh mục thực vật, động vật hoang dã quý chế độ quản lý bảo vệ Theo nghiên cứu từ Viện Dược liệu, Việt Nam có 144 lồi thuốc thuộc diện quý bị suy giảm nghiêm trọng cần bảo tồn nước ta (Nguyễn Văn Tập, 2006) Một số lồi nhóm này, gần nghiên cứu bảo tồn nguyên vị (In -situ) chuyển vị (Ex- situ) thành cơng, chí đưa vào trồng thêm chỗ Sâm Ngọc Linh vùng núi Ngọc Linh, Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus), Ngũ gia bì hương (A gracilistylus), Sì to (Valeriana jatamansi), Dền tng (Gynostemma pentaphylla) tiến hành Lào Cai, Hà Giang Vĩnh Phúc, Ba kích (Morinda officinalis ) trồng Phú Thọ, Quảng Ninh, Hịa Bình, Quảng Nam Thanh Hóa… Với chiến lược trì, bảo tồn nhân giống dược liệu quý hiếm, nay, Việt Nam phát động nhà khoa học tìm hiểu, nghiên cứu nhân giống những lồi có nguy tuyệt chủng Để hồn thiện chiến lược này, ni cấy mô tế bào thực vật công cụ hữu ích giúp nhà khoa học, nhà nghiên cứu tiến gần công bảo tồn nhân nhanh nguồn dược liệu quý hiếm, giúp tìm cách chữa trị những bệnh hiểm nghèo cho người Tuy nhiên, Lan (N fordii ) – lồi dược liệu q cịn chưa nghiên cứu nhiều tính mới, tính khó nghiên cứu bảo tồn lồi Lan (Nervilia fordii) (Hance) Schltr., thuộc họ Lan- Orchidaceae Theo phương pháp nhân giống truyền thống gieo hạt vào mùa xuân, nhân từ mẹ Với phương pháp hệ số nhân thấp nguồn hạt thu không nhiều Xuất phát tự thực tế nguồn quý bị khai thác bừa bãi, nguồn dược tính quý Lan chưa phát triển cách bền vững Chỉ dùng biện pháp nhân giống truyền thống không đáp ứng yêu cầu trì, bảo tồn phát triển nguồn dược liệu Do đó, cần thiết có qui trình nhân giống in-vitro ứng dụng công nghệ tế bào thực vật sản xuất đại trà trì nguồn gen quý tự nhiên Trên sở cơng trình nghiên cứu nhân giống in vitro những thuộc họ (họ Orchidaceae) tiên hành thực đề tài “Xây dựng quy trình nhân 26 Đối với Lan lá, hình thức sinh sản sử dụng để nhân giống tự nhiên Do đó, thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành thử nghiệm nồng độ BA đoạn thân rễ nhằm tạo chồi hình thành Lan Bảng 3.4 Ảnh hưởng BA đến khả tái sinh chồi từ thân rễ Lan CT BA (mg/l) Tỉ lệ tái sinh chồi (%) CT1 0b CT2 0.1 0b CT3 0.3 45a CT4 0.5 0b CT5 0.7 0b LSD 4,6 CV(%) 14,6 Qua khảo sát cho thấy nồng độ thích hợp BA cho hiệu cảm ứng hình thành chồi từ thân rễ Lan Cụ thể những nghiệm thức chứa BA 0; 0,1; 0,5 0,7 mg/l không cho hiệu hình thành chồi Trong những nghiệm thức thân rễ không phát triển (nghiệm thức BA 0mg/l), thân rễ hình thành đoạn thân rễ (nghiệm thức BA 0,1; 0,5 0,7 mg/l) Chỉ có nghiệm thức với nồng độ BA 0,3 mg/l cho hiệu cảm ứng tạo thành chồi từ thân rễ Lan a b c 27 d e Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ BA đến khả tái sinh chồi từ thân rễ Lan (a BA 0mg/l; b BA 0,1mg/l; c BA 0,3 mg/l; d BA 0,5 mg/l; d BA 0,7mg/l) 3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu thành phần môi trường tái sinh Lan Ảnh hưởng NAA đến khả tái sinh Từ nguồn mẫu chồi Lan cảm ứng từ thân rễ, tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng NAA đến khả tái sinh Các chồi Lan cấy chuyền qua môi trường bổ sung BA 1mg/l, NAA nghiệm thức thí nghiệm với nồng độ từ 0- 4mg/l Sau tháng theo dõi, ghi nhận kết sau: tất nghiệm thức thí nghiệm (nghiệm thức đối chứng với NAA 0mg/l; nghiệm thức thí nghiệm với NAA 1, 3mg/l), chồi Lan phát triển bình thường, cuống kéo dài bắt đầu mở lớn sau tháng nuôi cấy Như NAA khơng ảnh hưởng đến q trình phát triển chồi Lan để hình thành Lan hồn chỉnh, có BA có tác dụng lên trình Hình 3.8 Chồi Lan phát triển từ thân rễ sau tháng nuôi cấy 28 3.4 Nội dung 4: Nghiên cứu thành phần mơi trường tạo rễ tạo hồn chỉnh Lan Ảnh hưởng NAA IBA đến khả rễ tạo in vitro hoàn chỉnh Đối với những lồi có thân rễ Lan lá, rễ có nhiệm vụ lấy chất dinh dưỡng từ giá thể để cung cấp ni tồn cây, thân rễ có nhiệm vụ dự trữ chất dinh dưỡng sinh sản Khi rễ bị hủy hoại (chết thối rữa…), thân rễ có nhiệm vụ cung cấp chất dinh dưỡng cho để tồn tại, phát triển hình thành rễ Trong thí nghiệm này, nghiên cứu ảnh hưởng NAA IBA đến hình thành rễ Lan Sau tháng theo dõi, chưa ghi nhận kết khả cảm ứng tạo rễ chồi Lan mơi trường thí nghiệm bổ sung nồng độ NAA IBA 3.5 Kết đề tài Quy trình nhân giống in vitro Lan 3.6 Chi phí sản xuất Bảng 3.5: Chi phí sản xuất cho 1.000 giống Lan in vitro TT Chi tiết Đơn giá Đơn vị Nguyên vật liệu sản xuất 300.000 /1000 Công lao động 400.000 /1000 Điện, nước 1.000.000 /1000 Tổng chi phí 1.700.000 /1000 29 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Xây dựng thành cơng qui trình nhân giống in vitro Lan - Nồng độ thời gian khử trùng thích hợp để khử trùng củ lan HgCl2 0,1% thời gian 7,5 phút - Môi trường cảm ứng tạo chồi môi trường MS+ 1mg/l BA + 0,5 mg/l NAA - Môi trường cảm ứng tạo thân rễ nhân nhanh cụm than rễ môi trường MS+1 mg/l BA - Môi trường cảm ứng tạo chồi từ thân rễ môi trường MS+ 0,3 mg/l BA - Nuôi mẫu chồi cảm ứng từ thân rễ thân củ Lan điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux Sau khoảng tháng Lan có mở hồn tồn hình thành Lan in vitro 4.2 Kiến nghị - Hoàn thiện quy trình trồng chăm sóc Lan giai đoạn hậu nuôi cấy mô - Chuyển giao quy trình cơng nghệ cho doanh nghiệp tham gia chương trình ươm tạo cá nhân có nhu cầu 30 PHỤ LỤC I Quy trình nhân giống in vitro Lan Thân củ khỏe mạnh Lan Khử trùng: HgCl2 7,5 phút Môi trường cảm ứng tạo thân rễ: MS + BA 1mg/l Môi trường cảm ứng tạo chồi: MS + BA 1mg/l + NAA Môi trường nhân cụm thân rễ: 0,5mg/l MS + mg/l BA Môi trường tái sinh thân rễ thành chồi: MS + 0,3 mg/l BA Cây Lan in vitro Diễn giải qui trình Bước (Khử trùng mẫu): Lựa chọn thân củ Lan khỏe mạnh, bệnh, giai đoạn ngủ Rửa củ Lan vòi nước nhằm loại bỏ hết đất 31 bụi bẩn Tiến hành khử trùng với cồn 70o 30 giây, sau khử trùng với dung dịch HgCl2 0,1% 7,5 phút Rửa lại nước tiệt trùng Bước (Cảm ứng tạo chồi thân rễ): Cấy mẫu củ Lan khử trùng qua môi trường cảm ứng tạo chồi (MS+ 1mg/l BA + 0,5 mg/l NAA) qua môi trường cảm ứng tạo thân rễ (MS+1 mg/l BA) Nuôi cấy mẫu điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng: 2000 lux Bước (Nhân nhanh cụm thân rễ): Cấy chuyền mẫu thân rễ in vitro qua môi trường nhân cụm thân rễ (MS+1mg/lBA) Nuôi cấy mẫu điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng: 2000 lux Bước (Cảm ứng tạo chồi từ thân rễ): Cắt cụm thân rễ thành đoạn, đặt môi trường cảm ứng tạo chồi (MS+ 0,3 mg/l BA) Nuôi cấy mẫu điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng: 2000 lux Bước (Tạo Lan in vitro): Nuôi mẫu chồi cảm ứng từ thân rễ thân củ Lan điều kiện nhiệt độ 25 ± 2oC, thời gian chiếu sáng 12h, cường độ chiếu sáng 2000 lux Sau khoảng tháng Lan có mở hồn tồn hình thành Lan in vitro 32 PHỤ LỤC II KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Thí nghiệm vơ mẫu Ti le nhiem VM 11:15 Thursday, December 5, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Sum of Source DF Model Squares Mean Square 294.8888889 F Value 147.4444444 120.64 Error 7.3333333 Corrected Total 302.2222222 R-Square Coeff Var 0.975735 Source DF T NOTE: Root MSE 13.09194 This test controls 1.2222222 8.444444 Mean Square 294.8888889 F Value 147.4444444 the F Type I Pr > F 120.64 F 139.10 F Model 11 5613.888889 510.353535 91.86 F F Model 11 7774.305556 706.755051 145.39 F T 11 7774.305556 706.755051 145.39 F F the 37 Model 34.81066667 8.70266667 99.65 Error 10 0.87333333 Corrected Total 14 35.68400000 R-Square Coeff Var Root MSE N Mean 0.975526 12.59060 0.295522 1.680000 Source DF T 34.81066667 test controls NOTE: This Anova SS 0.08733333 Mean Square F Value 8.70266667 the Type I F 99.65 F Mean Square 1306.666667 F