Nghiên cứu thu nhận chondroitin sulfate từ sụn ức gà

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TPHCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN ỨC GÀ Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trƣờng Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TPHCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: Đống Thị Anh Đào, GS.TS Thành phố hồ Chí Minh Năm 2018 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc Sở Khoa học Công Nghệ TPHCM Ban Giám Hiệu trƣờng Đại Học Bách Khoa-ĐHQG TPHCM Phòng Quản lý Khoa Học – Sở Khoa Học Cơng Nghệ TPHCM Phịng Khoa Học Công Nghệ Dự Án trƣờng Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TPHCM Khoa Kỹ thuật hóa học Bộ mơn Công nghệ thực phẩm tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn Hội Đồng xét duyệt đề cƣơng đề tài Hội đồng Giám Định nhiệm vụ Khoa Học Công Nghệ Hội Đồng đánh giá nghiệm thu sở Đã đóng góp ý kiến quý báu giúp tơi hồn thành tốt cơng trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn thân thƣơng đến học viên Cao Học sinh viên gắn bó, say mê tham gia nhiệt tình tơi để tìm phƣơng pháp giải vấn đề cách khoa học hiệu Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè hỗ trợ, khích lệ tinh thần q trình thực đề tài Trân trọng cảm ơn TP Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 10 năm 2018 Chủ nhiệm đề tài GS.TS Đống Thị Anh Đào ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc TPHCM ngày 22 tháng 10 năm 2018 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN ỨC GÀ Thuộc: Chƣơng trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: Đống thị Anh đào Ngày, tháng, năm sinh: 09/03/1961 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: GS.TS Chức danh khoa học: Giảng viên cao cấp Chức vụ Điện thoại: Tổ chức: 028-38650484 Nhà riêng: 028-38325256 Mobile: 0908136082 Fax: 028-38637504 E-mail: dtanhdao@hcmut.edu.vn Tên tổ chức công tác: Trƣờng Đại Học Bách Khoa –ĐHQG TPHCM Địa tổ chức: 268 Lý Thƣờng kiệt, Q10, TPHCM Địa nhà riêng: 116/4 Cao Thắng, P$,Q3, TPHCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên quan chủ trì nhiệm vụ: Trƣờng Đại Học Bách Khoa-ĐHQG TPHCM Điện thoại: 08-38647256 (ext:5388) E-mail: khcn@hcmut.edu.vn Fax: 08-38653823 Website: www.hcmut.edu.vn Địa chỉ: 268 Lý thƣờng kiệt, P.14, Q10, TP HCM Họ tên thủ trƣởng Tổ chức: PGS.TS Mai Thanh Phong Số tài khoản: 3713.0.1056923.00000 tại: Kho bạc Nhà Nƣớc TPHCM iii Tên quan chủ quản đề tài : Sở Khoa học Cơng nghệ TP.HCM II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng năm 2017 đến tháng 11 năm 2018 - Thực tế thực hiện: từ tháng 05 năm 2017 đến tháng 11 năm 2018 - Đƣợc gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng… năm… đến tháng… năm… - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực 645tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 645.tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Số Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí TT (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) (Số đề nghị toán) 05/ 2017 320,0 05/ 2017 320,0 04/ 2018 260,5 04/ 2018 260,5 c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số Nội dung TT khoản chi Theo kế hoạch Tổng NSKH Trả công lao động 365,22 365,22 (khoa học, phổ Nguồn khác Thực tế đạt Tổng 365,22 NSKH Nguồn khác 365,22 iv thông) Nguyên, vật liệu, 210,32 210,32 lƣợng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng 210,32 210,32 69,46 69,46 69,46 69,46 645 645 645 645 - Lý thay đổi (nếu có): 1.1.1.1.1 Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: 1.1.1.1.2 (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số TT Số, thời gian ban hành văn Tên văn 780/QĐ-SKHCN Quyết định 31/10/2016 việc thành lập hội đồng tƣ vấn tuyển chọn tổ chức, cá nhân thực nhiệm vụ Khoa học Công Nghệ 29/11/2016 Biên họp Ghi Hội đồng tƣ vấn tuyển chọn tổ chức cá nhân thực đề tài nghiên cứu khoa học 427/QĐ-SKHCN Quyết Định Về việc phê duyệt nhiệm vụ khoa học Công Nghệ 74/2017/HĐ-SKHCN 24/5/2017 Hợp Đồng thực nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ v 44/HĐ-ĐHBK-KHCN&DA Hợp đồng giao nhiệm vụ 25/5/2017 11/QĐ-SKHCN Quyết định 28/2/2018 Về việc thành lập Hội đồng Giám định nhiệm vụ Khoa học cong nghệ 08/3/2018 Biên giám định đề tài 26/3/2018 Thẩm tra toán đề tài , dự án năm 2017 30/7/2018 Thẩm tra toán đề tài , dự án năm 2018 10 2829/QĐ-ĐHBK-KHCN&DA 08/10/2018 Quyết định việc thành lập Hội Đồng đánh giá nghiệm thu sở kết nhiệm vụ cấp thành phố 22/10/2018 Biên nghiệm thu sở 11 Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* Công ty Cổ Công ty Cổ Tƣ vấn Khảo Thực thí Phần Dƣợc Phần Dƣợc sát ổn định nghiệm lão hóa Nature Việt Nature Việt chất lƣợng sản sản phẩm Nam Nam phẩm Phƣơng pháp Phân tích sắc ký phân tích HPLC HPLC vi Trƣờng Đại Trƣờng Đại học Thực dịch vụ học Công Công Nghiệp sấy phun sản Nghiệp thực thực phẩm phẩm phẩm Điều kiện sấy phun: thiết bị Lab-Plant SD06AG, nhiệt dộ sấy 120oC lƣu lƣợng 285mL/h Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, khơng q 10 người kể chủ nhiệm) Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Đống Thị Anh Đào, GS.TS Đống Thị Anh Đào, GS.TS DS Lƣu Thị Phiến DS Lƣu Thị Phiến Tổng Giám Đốc Tổng Giám Đốc Số TT Nội dung tham gia Sản phẩm chủ yếu đạt Ghi chú* - Tổ chức công việc, vạch phƣơng hƣớng, nội dung thực hiện, kiểm tra trình - Tổ chức công việc, vạch phƣơng hƣớng, nội dung thực hiện, kiểm tra - Thiết lập quy trình thực trình công nghệ thu tiến nhận tinh độ, sản phẩm đề tài đạt theo yêu CS cầu - Viết báo cáo thuyết minh, báo - Nâng cao quy cáo tổng kết đề tài trình cơng nghệ sản xuất 2kg CS NC - Viết báo cáo thuyết minh, báo cáo tổng kết đề tài NC Tƣ vấn về: Hoàn thành thực Khảo sát ổn nghiệm định chất lƣợng Khảo sát ổn sản phẩm định chất lƣợng vii sản phẩm Nguyễn Thị Nguyên, KS Nguyễn Thị Nguyên, KS - Lập tiêu chuẩn - Lập tiêu chuẩn chất lƣợng nguyên chất lƣợng liệu sụn ức gà nguyên liệu đáp - Sản xuất thử 2kg ứng yêu cầu sản phẩm Trần Thị Hồng Hạnh, KS - tham gia sản xuất thử 2kg sản phẩm Trần Thị Hồng - Khảo sát trình - Đạt kết tối Hạnh, KS thủy phân sụn, thu ƣu cho trình nhận CS thô thủy phân sụn, thu nhận CS thô - Tối ƣu hóa q trình thủy phân sụn thu nhận CS - Xác định giá thành sản phẩm - Tính hiệu kinh tế Nguyễn Thị Thanh Phƣợng, KS Huỳnh Tiến Phong, TS Nguyễn Thị Khảo sát trình Chọn đƣợc quy Thanh Phƣợng, tinh CS trình tinh KS CS phƣơng pháp hóa học kết hợp lọc màng đạt hiêu suất cao độ tinh cao Huỳnh Tiến Phong, TS - Khảo sát nguồn - số liệu nguyên liệu ngành giết mổ gà - Tối ƣu trình lấy thịt thủy phân thu nhận năm gần chondroitin thô - tinh CS - Xử lý số liệu quy hoạch rhực nghiệm xác định điều kiện tối ƣu q trình thủy phân thu nhận CS thơ viii Nguyễn thị Lệ Viên Nguyễn thị Lệ Viên học viên Cao Học học viên Cao Học -Tối ƣu hóa -Tối ƣu hóa q trình tinh trình tinh chondroitin chondroitin - Khảo sát ổn - Lập thí nghiệm định chất lƣợng phân tích mẫu, sản phẩm xử lý số liệu xác định hạn sử - Tính kinh tế dụng sản phẩm CS Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm) Thực tế đạt Ghi chú* (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Nội dung: Tình hình nghiên cứu sản Nội dung: Tình hình nghiên cứu xuất CS VN sản xuất CS VN Thời gian: Năm 2018 Thời gian: 25/6/2018 Kinh phí: triệu đồng Kinh phí: triệu đồng Trƣờng Đại học Bách Khoa Trƣờng Đại học Bách Khoa Số ngƣời: không đăng ký Số ngƣời: 34 ngƣời ix Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Thời gian Số TT TT Các nội dung, công việc chủ yếu (Các mốc đánh giá chủ yếu) (Bắt đầu, kết thúc - tháng … năm) Theo kế hoạch Người, quan thực Thực tế đạt đƣợc Các nội dung, công việc chủ yếu đƣợc thực Kết đạt đƣợc Khảo sát nguồn nguyên liệu 5/2017 _ 8/2017 tiêu chuẩn - Nghiên cứu xử lý, bảo -Tiêu chuẩn chất lƣợng sở quản lập tiêu chuẩn chất ATVS theo quy định - Chần 80oC, lƣợng nguyên liệu sụn ức Bộ Y Tế phút gà -xử lý nguyên liệu -bảo quản-18oC - Điều kiện bảo quản nguyên liệu Đống thị Anh Đào Điều kiện phân Nghiên cứu phƣơng pháp 8/2017_ 01/2018 phân tích CS - Phƣơng pháp phân tích tích HPLC cho CS CS HPLC Đống thị Anh Đào -Nhiệt độ, thời Khảo sát điều kiện kỹ thuật 8/2017_ 02/2018 loại bỏ thịt bám bên ngồi Thơng số trình loại gian, pH sụn thịt vụn phƣơng hóa học, sinh học, vật lý Đống thị Anh Đào Chọn alcalase - Quy trình cơng nghệ để xúc tác thủy thu nhận CS thô (1) với phân nguyên hiệu suất cao liệu điều kiện tối ƣu: nhiệt kết hợp sóng độ, thời gian, pH, nồng siêu âm phá vỡ độ enzymso với nồng độ tế bào sụn chất thủy phân thời Đống thị Anh Đào - Thiết lập quy trình cơng nghệ thu nhận CS phƣơng pháp thủy phân protease -Tối ƣu hóa thơng số kỹ thuật q trình thủy phân proteoglycan xúc tác thủy phân 7/2017_10/2017 Huỳnh Tiến Phong Nguyễn thị Nguyên HV: Phan Bảo Dung Trần thị Hồng Hạnh Trần thị Hồng Hạnh Huỳnh Tiến Phong x 4.15 Tính hiệu kinh tế Bảng 41: : Bảng tóm tắt chi phí ngun liệu hóa chất Ngun liệu – hóa chất Chú thích Sụn mua từ cơng ty Phạm Tơn Cịn bám thịt Khối lƣợng sụn Sụn loại thịt (tỉ lệ 1:10) Đệm phosphate protamex Khối lƣợng 127,3 Đơn vị Đơn Giá (VNĐ/kg VNĐ/L) kg 16.945 Thành tiền (VNĐ) 2.157.000 44,5,86 kg 318,6 lít Na2HPO4 6,4 kg 100.000VNĐ/kg 640.000 KH2PO4 0,46 kg 100.000VNĐ/kg 46.000 E/S 0,8% 0,028 kg 2.000.000VND/kg 56.000 T 55 pH 5,8 t TCA 1% ( V dd) 3,44 kg 98.000 VNĐ/kg 311.640 CPC 0,1%(w/v) 0,32kg lít 100.000 VNĐ/kg 32.000 KSCN 0,12 0,38 kg 80.300 VNĐ/kg 30.528 NaCl 0,06% (w/v) 2,28 kg 20.000 VNĐ/kg 68.400 Sấy phun Dung dịch 6% 23.8 L 50.000VNĐ/L 1.191.000 Bột CS 20 1,43 kg bột 3.231.700 Sản phẩm Bột CS 90% kg 2.874.265 Giá thành sản phẩm tinh chế 2.874.265VNĐ/kg, cao gấp 1,9 lần so với sản phẩm chất lƣợng cao Trung Quốc, đƣợc ngoại nhập để sản xuất thuốc phòng điều trị đau khớp Giá thành sản phẩm nghiên cứu cao do giá nguyên liệu cao, nghiên cứu phải tốn chi phí sấy phun thiết bị bên ngồi trƣờng 155 4.16 Khảo sát tính ổn định chế phẩm nghiên cứu Độ ổn định chế phẩm CS đƣợc xác định đồ thị biểu diễn độ giảm hàm lƣợng CS theo thời gian bảo quản Từ điểm liệu thực nghiệm thu đƣợc theo dõi độ giảm hàm lƣợng CS theo thời gian bảo quản mốc nhiệt độ, ta thu đƣợc phƣơng trình hồi quy tuyến tính Phƣơng trình hồi quy theo biến x đƣợc xác định để ƣớc tính khoảng thời gian ổn định chế phẩm Phƣơng pháp phân tích đƣợc áp dụng tất nhiệt độ khảo sát 35oC; 40oC; 45oC Phương pháp tính tốn: Bảng 42: Sự thay đổi hàm lƣợng CS chế phẩm nghiên cứu Hàm lƣợng (%) Thời gian (Tháng) 35oC 40oC 45oC 90.79 90.79 90.79 88.86 87.7 85.67 87.52 85.63 79.44 85.86 82.82 84.78 Hầu hết giảm chất lƣợng sản phẩm tuân theo phƣơng trình Arrhenius:  dA      k ( A)n  dt  Trong đó: A: Một thuộc tính chất lƣợng đo đạc đƣợc (cụ thể độ giảm hàm lƣợng CS) n: Bậc phản ứng k: Hằng số tốc độ Trong trƣờng hợp phản ứng bậc bậc 1, phƣơng trình Arrhenius chuyển thành mơ hình tuyến tính: k1ts1  k2ts 156 Trong đó: K1: số tốc độ nhiệt độ T1 K2: số tốc độ nhiệt độ T2 ts1: thời gian sử dụng nhiệt độ T1 ts2: thời gian sử dụng nhiệt T2 Áp dụng mơ hình Arrhenius, biểu thức toán học tổng quát: k  k0 e EA / RT Trong đó: k0: số, khơng phụ thuộc vào nhiệt độ (hằng số Arrhenius) k: số tốc độ nhiệt độ T EA: lƣợng hoạt hóa (J/mol) R: số khí lý tƣởng (R=8,314J/K.mol) T: nhiệt độ (K) Vẽ đồ thị lnCt – t (tháng) Tính hồi quy bậc nhất, ta có số tốc độ: - Ở 35oC: k35=0.0097 tháng-1 (r=0.9936) - Ở 40oC: k40=0.0341 tháng-1 (r=0.9954) - Ở 45oC: k45=0.0762 tháng-1 (r=0.9939) 157 a) b) c) Hình 47: Đồ thị lnC-t (tháng) theo dõi chế phẩm 35oC (a); 40oC (b); 50oC (c) Để tính thời gian sử dụng nhiệt độ 30oC, cần tính k30: - Vẽ đồ thị lnk – 1/T (oK) theo phƣơng trình lnk = C1 - Eo/(RT) Nhiệt độ (oC) 35 40 45 k 0.0097 0.0341 0.0762 lnk -4.636 -3.378 -2.574 (1/T) 0.003245 0.003193 0.003143 158 Hình 48: Đồ thị lnk-1/T - Tính hồi quy bậc lnk = C1 - Eo/(RT) = 61.083 - 20230/T - Tính số k30 theo phƣơng trình: lnk30=61.083 – 20230/(273.15+30)= -5.65 => k30 = 0.0035 Thời gian sử dụng sản phẩm khoảng thời gian để hoạt chất lại 90% so với trị số ban đầu nên: t0.9 = 0.105/k30 = 29.84 tháng HSD chế phẩm CS nghiên cứu bảo quản 30oC xấp xỉ 29.84 tháng Giải thích: - Nhiệt độ ảnh hưởng đến độ giảm hàm lượng CS theo thời gian bảo quản: Các bậc cấu trúc CS tùy vào liên kết chuỗi phân tử GlcA-GalNAc không gian Bậc dạng mạch thẳng bắt đầu với gốc đƣờng đơn theo phƣơng thức cố định liên kết Tetra-saccharide: xylose-galactose-galactoseglucuronic acid (Xyl-Gal-Gal-GlcA), nối tiếp chuỗi disaccharide GlcAGalNAc Bậc dạng xoắn lò xo xuất hiệu ứng dịch chuyển điện tích hạt nhân (Nuclear Overhauser effects (NOEs)), làm cho gốc carboxylate (COO-) nhóm 159 amino acetyl tiến lại gần hình liên kết nội phân tử Bậc có dạng hình xoắn ốc dạng ổn định cấu trúc bậc Khi tiến hành nghiên cứu thu nhận tinh CS, để thu đƣợc chế phẩm dạng bột, dịch thủy phân sau thẩm tích để tinh cô quay để đạt hàm lƣợng chất khô yêu cầu đem sấy phun Dựa vào kết thực nghiệm thu đƣợc từ hình chụp SEM cho thấy cấu trúc phân tử CS chế phẩm sau sấy phun có dạng cấu trúc bậc 3, hình cầu lõm bề mặt Trong trình gia tốc nhiệt để xác định tính ổn định sản phẩm, dƣới tác động nhiệt độ cao thời gian dài, phân tử protein tạp chế phẩm biến tính, cấu trúc bậc 3, bậc chuyển thành bậc 1, bậc 2, phân tử protein bị giãn mạch liên kết thứ cấp bị phá vỡ, liên kết với CS bị lỏng lẻo Bên cạnh đó, liên kết nội phân tử cấu trúc CS yếu đi, CS từ cấu trúc bậc duỗi dạng đơn giản (bậc 2, bậc 1) Khi tiếp tục tăng mốc nhiệt độ khảo sát, khả liên kết yếu làm chuỗi CS bị đứt mạch, làm giảm khối lƣợng phân tử trung bình CS sản phẩm, làm hoạt tính CS - Độ giảm hàm lượng CS CS chuẩn thấp so với chế phẩm nghiên cứu: Do mẫu chuẩn có kích thƣớc phân tử trung bình đồng so với chế phẩm nghiên cứu Đồng thời, CS chuẩn độ tinh cao nhƣ hàm lƣợng protein thấp nên khả bị biến tiến nhiệt thấp hơn, dẫn đến độ giảm hàm lƣợng CS mẫu chuẩn chậm so với chế phẩ CS nghiên cứu Kết luận: Xác định có mối tƣơng quan độ giảm hàm lƣợng thời gian bảo quản chế phẩm CS nghiên cứu Mối tƣơng quan đƣợc thể công thức Arrhenius thời hạn sử dụng chế phẩm CS nghiên cứu 29.84 tháng bảo quản 30oC 160 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 5.1.1 Mặt khoa học Nghiên cứu rút kết luận sau: 1-Phƣơng pháp xử lý ngun liệu để q trình trích ly đạt hiệu suất cao: - Làm mô thịt bám nguyên liệu sụn trƣớc trích ly CS: xử lí sụn phƣơng pháp nhiệt, chần 85oC hàm lƣợng GAGs thất thấp vịng phút Tuy nhiên sau thời gian chần phút, dễ dàng lột bỏ phần thịt bám bên ngoài, để áp dụng sản xuất quy mô lớn - Phá vỡ mơ sụn sơ sóng siêu âm: Sử dụng sóng âm cơng suất 250W/kg/phút, nhiệt độ 48oC, 9,5 phút, pH9 giúp rút ngắn thời gian thủy phân enzyme, khoảng 1/3 thời gian Hiệu suất thu nhận CS 24,29%, hàm lƣợng Cs sản phẩm đạt 78,52% 2- Các thông số công nghệ q trình thu nhận bột CS thơ enzyme Protamex điều kiện pH5,8; Nhiệt độ thủy phân 55oC; Hàm lƣợng enzyme/cơ chất: 0,85% (w/wpro); thời gian thủy phân 60 phút (nếu có xử lý sụn sóng siêu âm) thời gian 206 phút không xử lý sóng siêu âm Bột CS thu nhận với hiệu suất 25,28%, hàm lƣợng CS sản phẩm đạt 79,75% 3- Quá trình tinh CS phƣơng pháp lọc màng PS10, PS20, NF, RO xác định đƣợc màng lọc PS20 cho độ phân riêng protein, carbohydrate hệ số tách protein/carbohydrate cao nhất, muối khoáng nƣớc đƣợc tách loại có hiệu quả, nhƣng độ tinh CS đạt 60,86% Hiệu suất thu nhận CS 24,3% Bột CS sau hòa tan chứa thành phần phi carbohydrate có KLPT ≥ 20 kDa, chúng bám dính bề mặt màng, phân tử peptid biến dạng bám lỗ màng khơng bị phân tách Do phƣơng pháp có ý nghĩa loại bỏ phân tử nƣớc, ion muối khoáng, acid amin 4- Tinh phƣơng pháp hóa học cho hiệu cao hơn, CS đƣợc phân riêng tác nhân CPC, hàm lƣợng protein bị loại bỏ đáng kể Ở điều kiện pH = 5,14, nồng độ CPC = 1,4%, nồng độ NaCl: 2,57M, nồng độ KSCN 1,5% hiệu suất thu 161 hồi CS: 21,57% so với chất khô nguyên liệu ban đầu; hiệu suất trích ly CS so với carbohydrate ban đầu 44,18%, độ tinh CS 81,53% 5- Đã xác lập đƣợc quy trình cơng nghệ sản xuất CS tinh chế, có độ tinh theo yêu cầu USP38 Quy trình thu nhận tinh chế CS Kết hợp hóa học với phƣơng pháp siêu lọc giai đoạn cuối để loại axít amin , muối khoáng giảm lƣợng nƣớc đem lại hiệu kinh tế cao, đáp ứng điểu kiện sấy phun tạo CS dạng bột hòa tan Hàm lƣợng protein tổng lại 5,54%, hàm lƣợng CS đạt 90,93 % so với tổng chất khô sản phẩm, hiệu suất thu nhận CS đạt khoảng 20,31% so với chất khơ ngun liệu 6- Sản phẩm hịa tan tốt nƣớc, dung dịch suốt, đƣợc kiểm tra hình dạng qua hình chụp SEM, cấu trúc theo phƣơng pháp FTIR 7- Phƣơng pháp phân tích định lƣợng CS HPLC: - Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao Hitachi với detector UV–Vis–5420 - Cột sắc ký: InertSustain ODS C18 (250 x 4,6mm, 5m) - Bước sóng phát hiện: 195nm - Dung dịch đệm pH 4,0: Muối Natri octane sulfonic acid (0,6g/l) + TEA (1,5ppm) chỉnh pH4 acid phosphoric - Tỷ lệ Đệm – ACN 85 - 15 - Tốc độ dòng hệ pha động: 0,5ml/phút - Nhiệt độ lị cột: 25oC - Thể tích tiêm: 20µl - Thời gian sắc ký: 10 phút 8- Tính hiệu kinh tế: giá thành sản phẩm tinh chế 2.874.265VNĐ/kg, cao gấp 1,9 lần giá sản phẩm chất lượng khá, ngoại nhập từ Trung Quốc 9- Sản phẩm nghiên cứu có hạn sử dụng khoảng năm điều kiện bao gói kín yếm khí, không tiếp xúc ánh sáng 162 5.1.2 Về mặt ứng dụng - Quy trình cơng nghệ xử lý ngun liệu, trích ly xúc tác thủy phân protamex hay alcalase, tinh tác nhân CPC kết hợp phƣơng pháp siêu lọc CS tạo nên bột CS hịa tan tốt nƣớc, áp dụng quy mô sản xuất lớn - Sản phẩm dạng bột hịa tan sử dụng đóng thành nén viên nang mềm 5.2 Đề nghị - Lập Quy trình công nghệ thu nhận protein phụ liệu liên hợp với quy trình cơng nghệ thu nhận tinh CS, hàm lƣợng protein cao, dạng peptid khuyếch tán tốt nƣớc tạo giá trị gia tăng cho sản phẩm CS, làm giảm giá thành CS - Thử nghiệm quy trình cơng nghệ với ngun liệu mơ sụn loài động vật khác 163 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] R.M Lauder, "Chondroitin sulfate: A complex molecule with potential impact on a wide range of biological systems," Complement Ther Med, vol 17, pp 56-62, 2009 [2] J.C.F Kwok, P Warren, J.W Fawcett, "Chondroitin sulfate: A key molecule in the brain matrix," The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, vol 44, pp 582-586, Jan 2012 [3] S Kazuyuki, T Mikami, T Uyama, S Mizuguchi, K Nomura, H Kitagawa, "Recent advances in the structural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate," Curr Opin Struct Biol, vol 13, pp 612-620, 2003 [4] Yu-gang Shi, Yue-cheng Meng, Jian-rong Li, Jie Chen, Yu-hua Liu, Xue Bai, "Chondroitin sulfate: extraction, purification, microbial and chemical synthesis," Published online in Wiley Online Library, vol 89, pp 1445–1465, 2014 [5] Jun-ichi Tamura, Haruna Tanaka, Ayumi Nakamura, Naoko Takeda, "Synthesis of b-D-GalNAc(4,6-diS)(1–4)[ a-L-Fuc(2,4-diS)(1–3)]- b-D-GlcA, a novel trisaccharide unit of chondroitin sulfate with a fucose branch," Tetrahedron Letters, vol 54, pp 3940–3943, 2013 [6] N Volpi, "Disaccharide mapping of chondroitin sulfate of different origins by high-performance capillary electrophoresis and high-performance liquid chromatography", Carbohydr Polym, vol 55, pp 273-281, 2004 [7] D.A Theocharis, N Papageorgacopoulou, D.H.Vynios, S.T Anagnostides, C.P Tsiganos "Determination and structural characterisation of dermatan sulfate in the presence of other galactosaminoglycans", J Chromatogr B Biomed Sci Appl , vol 754, pp 297-309, 2001 [8] T Sakai, M Kyogashima, Y Kariya, T Urano, Y Takada, A Takada, "Importance of GlcUA𝛽-3GalNAc(4S,6S) in chondroitin sulfate E for t-PA- and u-PA-mediated Glu-plasminogen activation," Thromb Res, vol 100, pp 557–565, 2000 [9] E Bedini, De Castro C, De Rosa M, Di Nola A, Iadonisi A, Restaino OF, Schiraldi C, Parrilli M , "A Microbiological–Chemical Strategy to Produce Chondroitin Sulfate A, C," Angewandte Chemie International Edition, vol 50, pp 6160 –6163, May 2011 164 [10] Garnjanagoonchorn W., Wongekalak L., Engkagul A, "Determination of chondroitin sulfate from different sources of cartilage," Chemical Engineering and Processing, vol 46, pp 465–471, 2007 [11] V.H Bắc, Đỗ Ngọc Tú, Trần Cảnh Đình, Lê Thị Lan Oanh "Nghiên cứu tách chiết chondroitin sulfate từ xƣơng sụn cá đuối (dasyatis kuhlii) cá nhám (carcharhinus sorrah) công nghệ sinh học," Tạp chí viện nghiên cứu hải sản, vol 16, pp 26-30, 2010 [12] S Sakai, E Otake, T Toida, Y Goda, "Identification of the origin of chondroitin sulfate in „„health foods‟‟", Chem Pharm Bull (Tokyo), vol 55 (2), pp 299-303 [13] Tadahisa Mikami, H Kitagawa, "Biosynthesis and function of chondroitin sulfate", Biochimica et Biophysica Acta, vol 1830, pp 4719–4733, 2013 [14] H Kitagawa, T Uyama, K Sugahara, "Molecular cloning and expression of a human chondroitin synthase", J Biol Chem, vol 276, pp 38721-6, 2001 [15] D Uebelhart, E.J Thonar, P.D Delmas, A Chantraine, E Vignon, "Effects of oral chondroitin sulfate on the progression of knee osteoarthritis: a pilot study", Osteoarthritis and cartilage, pp 39-466, 1998 [16] D Uebelhart, M Malaise, R Marcolongo, F de Vathaire, M Piperno, E Mailleux, A Fioravanti, L Matoso, E Vignon "Intermittent treatment of knee osteoarthritis with oral chondroitin sulfate: a one-year, randomized, double-blind, multicenter study versus placebo Osteoarthritis Cartilage," vol 12, pp 269-276, Apr 2004 [17] M.T Osterman, G.R Lichtenstein, "Current and future anti-TNF therapy for inflammatory bowel disease," Curr Treat Options Gastroenterol, vol 10, pp 195-207, 2007 [18] J.W Cho, K.S Lee, C.W Kim, "Curcumin attenuates the expression of IL-1β, IL-6, and TNF-α as well as cyclin E in TNF-α-treated HaCaT cells; NF-κB and MAPKs as potential upstream targets," International journal of molecular medicine, vol 19, pp 469-474, 2007 [19] C Jomphe, M Gabriac, T.M Hale, L Herous, L.E Trudeau, D Deblois, E.Montell, J Verges, P du Souich, "Chondroitin sulfate inhibits the nuclear translocation of nuclear factor-kappaB in interleukin-1beta stimulated chondrocytes," Basic Clin Pharmacol Toxicol, vol 102, pp 59-65, Jan 2007 165 [20] Sean C Sweetman, Martindale: The Complete Drug Reference, 34th ed London, British: Pharmaceutical Press , 2005 [21] F Ronca, L Palmieri, P Panicucci, G Ronca, "Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate," Osteoarthritis and Cartilage , vol 6, pp 14-21, 1998 [22] V.C Hascall, "Proteoglycans-the Chondroitin Sulfate Keratan Sulfate Proteoglycan of Cartilage," Isi Atlas of Science-Biochemistry , vol 1, pp 189198, 1988 [23] X.M Luo, G.J Fosmire, R.M Leach, "Chicken Keel Cartilage as a Source of Chondroitin Sulfate," Poultry Science , vol 81, pp 1086–1089, 2002 [24] M Bernfield, M Gotte, P.W Park, O Reizes, M.L, Fitzgerald, J Linceum, M Zako, "Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans," Annual review of biochemistry, vol 68, pp 729-777, 1999 [25] S.K Sikder, A Das, "Isolation and characterization of glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) from the skin of the fish Labeo rohita," Carbohydrate Research, vol 71, pp 273-285, 1979 [26] T Nakano, K Nakano, J.S Sim, "Extraction of glycosaminoglycan peptide from bovine nasal cartilage with 0.1M sodium acetate," J Agric Food Chem, vol 46, pp 772–778, 1998 [27] S.C Shin, S.J You, B K An, C.W.Kang, "Study on Extraction of Mucopolysaccharide-protein Containing Chondroitin Sulfate from Chicken Keel Cartilage," Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, vol 19, pp 601-604, 2006 [28] N Volpi, "Oral bioavailability of chondroitin sulfate (Condrosulf) and its constituents in healthy male volunteers.Osteoarthritis Cartilage," vol 10, pp 768777, 2002 [29] T Nakano, L Ozimek, "Chondroitin sulphate distribution in broiler chicken carcasses," British poultry science, vol 55, pp 54-58, 2014 [30] Z Hengchang, Li L, Wang F, Yi Q, Dong Q, Sun Cm Wang J, "A method for identifying the origin of chondroitin sulfate with near infrared spectroscopy," Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol 61, pp 224–229, 2012 [31] P Morreale, R Manopulo, M Galati, L Boccanera, G Saponati, L Bocchi, "Comparison of the anti-inflammatory efficacy of chondroitin sulfate and 166 diclofenac sodium in patients with knee osteoarthritis," J Rheumatol, vol 23, pp 1385-1391, 1996 [32] E.J Campbell, C A Owen, "The sulfate groups of chondroitin sulfate-and heparan sulfate-containing proteoglycans in neutrophil plasma membranes are novel binding sites for human leukocyte elastase and cathepsin G," Journal of Biological Chemistry, vol 282, pp 14645-14654 [33] D.O Clegg, D.J Reda, C.L Harris, "Glucosamine, chondroitin sulfate, and the two in combination for painful knee osteoarthritis," N Engl J Med, vol 23, pp 795-808, 2006 [34] P Bourgeois, G Chales, J Dehais, B Delcambre, J.K Kuntz, S Rozenberg , "Efficacy and tolerability of chondroitin sulfate 1200 mg/day vs chondroitin sulfate 3× 400 mg/day vs placebo," Osteoarthritis and cartilage, vol 6, pp 2530, 1998 [35] G Verbruggen, "Systems to assess the effects of progression of finger joint OA and the effects of S/DMOAD," Clinical Rheumatology , vol 21, pp 231-243, 2002 [36] C Gabay, C Medinger-Sadowski, D Gascon, F Kolo, A Finckh, "Symptomatic effects of chondroitin and chondroitin sulfate on hand osteoarthritis: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial at a single center," Arthritis Rheum, vol 63, pp 3383-3391, Nov 2011 [37] N.Đ Lƣợng, Công nghệ Enzyme Thành phố Hồ Chí Minh: Nhà xuất Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2005 [38] K Oda, "New families of carboxyl peptidases: Serine-carboxyl peptidases and glutamic peptidases," J Biochem, vol 151, pp 13-15, Jan 2012 [39] Ting Zhao, Y Zhou, G Mao, Y Zou, J Zhao, S Bai, L Yang, X Wu, "Extraction, purification and characterisation of chondroitin sulfate in Chinese sturgeon cartilage," J Sci Food Agric, vol 93, pp 1633–1640, Jan 2013 [40] María Blanco, J Fraguas, C.G Sotelo, R.I Perez-Martin, J.A Vazquez, "Production of Chondroitin Sulphate from Head, Skeleton and Fins of Scyliorhinus canicula By-Products by Combination of Enzymatic, Chemical Precipitation and Ultrafiltration Methodologies," Marine Drugs, vol 13, pp 3287-3308, May 2015 167 [41] T Nakano, Z Pietrasik, L Ozimek, M, Betti, "Extraction, isolation and analysis of chondroitin sulfate from broiler chicken biomass," Process Biochemistry, vol 47, pp 1909-1918, 2012 [42] T Nakano, M Betti, Z Pietrasik, "Extraction, isolation and analysis of chondroitin sulfate glycosaminoglycans," Recent patents on food, nutrition & agriculture, vol 2, pp 61-74, Jan 2010 [43] E Tadashi, "Sodium Chondroitin sulfat, chondroitin sulfat containing materila and processes for producing the same," European Patent Application EP1557472, 2005 [44] A Srichamroen, T Nakano, Z Pietrasik, L Ozimek, M Betti, "Chondroitin sulfate extraction from broiler chicken cartilage by tissue autolysis," LWT-Food Science and Technology, vol 50, pp 607-612, 2013 [45] B Lignot, V Lahogue, P Bourseau, "Enzymatic extraction of chondroitin sulfate from skate cartilage and concentration-desalting by ultrafiltration", Journal of biotechnology, vol 103, pp 281-284, 2003 [46] M Vittayanont, T Jaroenviriyapap, "Production of crude chondroitin sulfate from duck trachea," International Food Research Journal, vol 21, pp 791-797, Nov 2012 [47] S.L Xiong, A Li, Z Wu, M Wei, "Extraction, separation and purification of chondroitin sulfate from chicken keel cartilage," Chin Soc Agric Eng , vol 25, pp 271-275, 2009 [48] S.X Hao, "Method for preparing chondroitin sulfate from sturgeon cartilage," Patent CN102924624A, 2013 [49] J.A Vázquez, M Blanco, J Fraguas, L Pastrana, R Perez-Martin , "Optimisation of the extraction and purification of chondroitin sulphate from head by products of Prionace glauca by environmental friendly processes," Food Chemistry, 2015 [50] R.W Farndale, D.J Buttle, A.J Barrett , "Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue," Biochimica et Biophysica Acta , vol 883, pp 173-177, 1986 [51] C.Y Cheng, Wu Yan-yan, Duam Zhen-hua, Chang Hong, Shang Jun, "Optimization of microwave-assisted extraction of chondroitin sulfate from 168 tilapia byproduct by response surface methodology," Consumer Electronics, Communications and Networks (CECNet), 2011 International Conference on, pp 1462-1465, 2011 [52] C Kun-Nan, C Ming-Ju, "Statistical Optimization: Response Surface Methodology Optimization in Food Engineering," in Optimization in Food Engineering, Ferruh Erdogdu, Ed New York, USA: Taylor & Francis Group, 2008, ch 6, pp 115-141 [53] AOAC, Official Methods of Analysis: The Association of Offiial Analytical Chemists Washington DC, USA, 1999 [54] Baker, Richard W, Membrane technology.2000 [55] Cheryan, Munir, “Ultrafiltration and microfiltration handbook” 1998: CRC press [56] R.M McDonogh, H Bauser, N, Stroh, H Chmiel, “Concentration polarisation and adsorption effects in cross-flow ultrafiltration of proteins”, Desalination, vol 79, pp 217-231 169