Nghiên cứu tác động chống co giật và dược động học của nl197 dẫn xuất của 43h quinazolinon

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU Đề tài: NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT VÀ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA NL197, DẪN XUẤT CỦA 4(3H) - QUINAZOLINON Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Ngọc vinh Đồng Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Võ Phùng Nguyên THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 5/2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CHỐNG CO GIẬT VÀ DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA NL197, DẪN XUẤT CỦA 4(3H) QUINAZOLINON CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI ĐỒNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) (Ký tên) PGS.TS Nguyễn Ngọc Vinh PGS.TS Võ Phùng Nguyên CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 5/2016 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Hiện dẫn chất 4(3H)-quinazolinon nhiều nhà nghiên cứu giới quan tâm chúng có tác dụng sinh học phong phú như: tác dụng an thần gây ngủ, tác dụng giảm đau, tác dụng chống động kinh, tác dụng làm mềm cơ, tác dụng kháng khuẩn, tác dụng trị tiểu đường, tác dụng chống viêm, tác dụng chống ung thư số đặc tính hữu ích khác Một số hợp chất đưa vào trị liệu đáng ý thuốc an thần, lợi niệu, mềm chống ung thư Dẫn chất 3-(2-chloropyridin-3-yl)-2-methyl-4(3H)-quinazolinon (NL197) tác giả Nguyễn Ngọc Vinh Trương Thế Kỷ tổng hợp nghiên cứu sơ cho thấy hợp chất có triển vọng phát triển, đặc biệt tác động chống co giật bảo vệ tế bào thần kinh Các nghiên cứu tác động mức độ hành vi tế bào thông số dược động học để khẳng định hợp chất NL197 có tác dụng trị liệu tốt an toàn điều làm cần thiết Mục tiêu đề tài - Nghiên cứu tác động chống co giật cấp tính mãn tính NL197, dẫn xuất 4(3H)-quinazolinon mơ hình dược lý hành vi.- Nghiên cứu độc tính khả bảo vệ tế bào thần kinh NL197, mơ hình dược lý tế bào - Nghiên cứu thông số dược động học, sinh khả dụng đường uống đường tiêm NL197 Phƣơng pháp nghiên cứu - Pha chế dạng dung dịch uống dung dịch tiêm NL197 để dùng nghiên cứu - Khảo sát tác động chống co giật NL197 mô hình thực nghiệm: mơ hình gây cảm ứng picrotoxin, NMDA, bicuculline, rotenon, MPTP - Khảo sát tác động NL197 tế bào vùng não liên quan bị gây chết chất gây co giật chuyên biệt phương pháp nhuộm mô - Khảo sát tác động NL197 chống stress oxy hóa tế bào thần kinh bị tổn thương chất gây co giật cách định lượng tiêu MDA hoạt tính glutathion i - Ni cấy tế bào não xác định tăng sinh tế bào ni cấy theo thời gian, xác định độc tính NL197 tế bào thần kinh nuôi cấy Đánh giá ảnh hưởng NL197 lên tăng sinh thối hóa tế bào thần kinh ni cấy - Khảo sát tác động bảo vệ thần kinh NL197 mơ hình gây độc rotenon, glutamat hydroperoxyd - Thẩm định phương pháp phân tích NL197 dịch sinh học định lượng NL197 dịch sinh học LC-MS/MS - Xây dựng mơ hình thử nghiệm động vật thí nghiệm (thỏ/chuột) thiết lập thông số dược động dựa giá trị thực nghiệm Kết nghiên cứu Ở chuột gây co giật hoá chất NMDA, Picrotoxin, Bicuculline, Pentylentetrazol Strychnin, NL197 kéo dài thời gian khởi phát co giật, thời gian tử vong giảm tỉ lệ tử vong chuột NL197 bảo vệ tế bào thần kinh khỏi stress oxy hóa dựa việc giảm nồng độ MDA, tăng nồng độ GSH tăng tỉ lệ GSH/GSSG so với lô bệnh Đồng thời NL197 bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tác động strychnin sulfat Trên mơ hình thử nghiệm với hố chất Rotenon MPTP, NL197 chưa thể tác động lên chức phối hợp vận động chức vận động tự nhiên chuột NL197 chưa cho thấy tác động bảo vệ chống stress oxi hoá tế bào não chuột NL197 không làm tăng tỉ lệ tế bào sống không làm giảm tỉ lệ tế bào chết gây độc tế bào rotenon 80 nM, glutamat 30 µM hydrogen peroxide 10 µM so với nhóm chứng Chứng tỏ NL197 khơng có tác động bảo vệ tế bào hồi hải mã khỏi oxy hóa kích thích tế bào Phương pháp định lượng NL197 dịch sinh học thẩm định tiêu chí: tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ phục hồi, độ đúng, độ xác, độ ổn định Sử dụng cột sắc ký Kinetex C18 (100 x 2.1, 2.6 µm) với pha động gồm acetonitril/dung dịch amonium format 0.01 M pH 4.5 (50:50, tt/tt) Sinh khả dụng thuốc khoảng 86,4%, phân bố thuốc mô Gan > Phổi > Thận > Não Kết sau uống NL197 đạt nồng độ tối đa máu khoảng 4,83 µg/ml, Tmax khoảng 2,4 giờ, T1/2 trung bình 5,14 Kết sau tiêm NL197 đạt ii nồng độ tối đa máu khoảng 7,66 µg/ml, Tmax khoảng phút, T1/2 trung bình 2,02 Tốc độ tiết tối đa (Rmax) NL197 thỏ thí nghiệm 12 đầu Hệ số thải (Cl) trung bình 0,38 L/giờ Kết luận Bằng mơ hình dược lý hành vi tế bào chuột thí nghiệm, đề tài khảo sát tác động chống co giật cấp tính mãn tính, độc tính tế bào thần kinh NL197 Đồng thời, đề tài thiết lập thông số dược động học thỏ/chuột, góp phần cho nghiên cứu tính sinh khả dụng NL197 để hoàn chỉnh hồ sơ đánh giá nguyên liệu dùng làm thuốc Các kết đề tài công bố 05 báo đăng tải tạp chí chuyên ngành Dược học Y học góp phần đào tạo 01 Thạc sĩ Dược học, 05 Dược sĩ Đại học Tập thể thành viên tham gia thƣc đề tài Stt Tên tổ chức, cá nhân Cơ quan công tác Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM PGS TS Nguyễn Ngọc Vinh PGS.TS Võ Phùng Nguyên Đại học Y Dược TP.HCM PGS.TS Trương Thế Kỷ ThS Huỳnh Ngọc Duy TS Đỗ Thị Hồng Tươi TS Huỳnh Ngọc Trinh Đại học Y Dược TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM Đại học Y Dược TP.HCM Đại học Y Dược TP.HCM iii Nội dung công việc tham gia - Chủ nhiệm đề tài - Phụ trách tổng hợp, sản xuất, kiểm nghiệm dạng bào chế NL197 khảo sát dược động học - Đồng chủ nhiệm đề tài - Phụ trách khảo sát tác động dược lý Tổng hợp NL197 sản phẩm cho thử nghiệm Khảo sát dược động học Khảo sát tác động dược lý Khảo sát tác động dược lý 10 11 12 13 14 ThS Trần Thủy Tiên Đại học Y Dược TP.HCM ThS Trương Thị Thu Trang Đại học Y Dược TP.HCM DS Lưu Thị Mỹ Ngọc Đại học Y Dược TP.HCM DS Lê Phan Xuân Quyên Đại học Y Dược TP.HCM DS Nguyễn Thị Hương Viện Kiểm Giang nghiệm thuốc TP.HCM CN Lê Đức Hiếu Viện Kiểm nghiệm thuốc TP.HCM DS Phan Nguyễn Trường Viện Kiểm Thắng nghiệm thuốc TP.HCM DS Thái Thị Tuyết Đại học Y Dược TP.HCM iv Khảo sát tác động dược lý Khảo sát tác động dược lý Khảo sát tác động dược lý Khảo sát tác động dược lý Khảo sát dược động học Tổng hợp NL197 sản phẩm cho thử nghiệm Khảo sát dược động học Khảo sát dược động học SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Derivatives of (3H)-quinazolinone have attracted attention of many researchers worldwide for their biological significance such as hypnotic, analgesic, anticonvulsive, muscle relaxant, antibacterial, hypoglycemic, anti-inflammatory, anticancer activities and some other useful features Some compounds have been used for therapy, notably as sedatives, diuretics, muscle relaxants and anticancer drugs 3-(2-chloropyridin-3-yl)-2-methyl-4(3H)-quinazolinone (NL197) was synthesized by Nguyen Ngoc Vinh and Truong The Ky, and preliminary researches indicate that it is a prospective compound, especially the anti – convulsive and neuroprotective effect The follow-up studies on behavioral and cellular pharmacological models and pharmacokinetic parameters are necessary to confirm that NL197 possesses good therapeutic effects and safety Objective - Investigate the acute and chronic anticonvulsant effect of NL197, a derivative of 4(3H)-quinazolinon on behavior models - Investigate the toxicity and efficiency of neural cells protection of compound NL197 on pharmacological cell models - Investigate the pharmacokinetic parameters, the bioavailability of oral and injectable formulations of NL197 Methods - Formulate the oral solution preparation and the injection preparation of NL197 for research - Evaluate the anti convulsant effect of NL197 on models in mice induced by picrotoxin, NMDA, bicuculline, rotenone, MPTP - Evaluate the efficiency of neuroprotection of NL197 in mice induced by convulsant chemicals through histochemical stain methods - Evaluate the anti - oxidative stress effect of NL197 on the neural cells injured by convulsant chemicals through qualification the MDA level and glutathione activity v - Subculture the mesencephalic, identify the growth of cell culture by the time and the toxicity of NL197 on the growth and degeneration of neural cells culture - Evaluate the neural cells protection of NL197 on toxic models by rotenone, glutamate and hydroperoxide - Evaluate the method of analysis NL197 in biofluid and identification NL197 in biofluid by LC-MS/MS - Establish the experimental model on animal (rabbit/mice) and set up pharmacokinetic parameters depending on experimental data Results On mice induced seizures by NMDA, Picrotoxin, Bicuculline, Pentylentetrazol and Strychnin NL197 prolonged the onsets of seizures and the time of death, reduced mortality NL197 also protected the hippocampus from oxidative stress by decreasing MDA level, increasing GSH level and GSH/GSSG level, maintained the morphology of neural cells in hippocampus area On mice induced by Rotenone and MPTP, NL197 does not effect on motor coordination function and locomotor activity It also does not protect neural cells from oxidative conditions induced by MPTP and Rotenone NL197 does not increase the rate of living cells and reduce the rate of death on toxic models by rotenone 80nM, glutamate 30μM and H2O2 10μM compared with the control group NL197 does not protect the hippocampus cells from oxidation and stimulation The parameters of quantitation of NL197 in biofluid, i.e., specificity, linearity, recovery, accuracy, precision, and stability were validated The samples were separated on a Kinetex C18 (100 mm × 2.1 mm, 2.6 μm) column with acetonitrileammonium formate 10 mmol pH 4.5 (67:33, v/v) as mobile phase The bioavailability was about 86.4%, the tissue distribution was in the following sequence: liver > lung > kidney > brain After administration of NL197 by oral, Cmax was about 4.83 g/ml, Tmax was about 2.4 hours and mean T1/2 was 5.14 hours After injecting NL197, Cmax was about 7.66 µg/ml, Tmax was about minutes and T1/2 was about 2.02 hours The maximum rate of excretion (R max) was in the first 12 hours in experiment rabbits, clearance (Cl) was about 0.38 L/hour vi Conclusions The acute and chronic anticonvulsant effects, and neurotoxicity of NL197 were studied on behavioral and cellular pharmacological models Simultaneously, the pharmacokinetic parameters in experimental rabbits and mice were characterized The results can be applied to the bioavailability study of NL197 to complete the dossier of active pharmaceutical ingredient evaluation The results obtained from pharmacological studies were published in articles on Vietnam Pharmaceutics Journal and HCMC Journal of Practical Medicine and in one Master of Science thesis in Pharmaceutics and in some Bachelor of Science dissertations in Pharmacy vii MỤC LỤC Trang TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i Mục lục viii Danh sách chữ viết tắt xxii Danh sách bảng xxiv Danh sách hình xxxiii PHẦN MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan NL197 1.1.1 Danh pháp 1.1.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu NL197 1.2 Yêu cầu quy định cho việc điều chế dạng dung dịch uống dạng dung 11 dịch tiêm 1.2.1 Dung dịch uống 11 1.2.1.1 Phương pháp điều chế 11 1.2.1.2 Yêu cầu chất lượng 11 1.2.1.3 Bảo quản 12 1.2.2 Thuốc tiêm 12 1.2.2.1 Thành phần 12 1.2.2.2 Yêu cầu chất lượng 14 1.3 Thẩm định quy trình phân tích chế phẩm 15 1.4 Thẩm định quy trình phân tích dịch sinh học đánh giá độ ổn 16 định 1.4.1 Tính đặc hiệu 16 1.4.2 Tính tuyến tính 17 1.4.3 Độ xác 17 1.4.4 Độ 17 1.4.5 Giới hạn định lượng (LLOQ) 18 viii Thử nghiệm alamar blue sau * Phần trăm so với chứng 120 100 80 60 40 Chứng R R+0,01 R+0,1 R+1 R+10 R+100 Rotenon NL197 (µM) Hình 3.67 Độ hấp thu sau giếng chứa rotenon NL197 tính theo phần trăm đối chứng *: p