Khảo sát khả năng kháng oxy hóa và kích thích miễn dịch in vivo của bài thuốc nam địa long

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HĨA VÀ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH IN VIVO CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG NGUYỄN THỊ MỸ NƯƠNG CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 10/ 2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXI HĨA VÀ KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH IN VIVO CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 10/ 2016 MỤC LỤC TÓM TẮT I ABSTRACT II DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ V LỜI CẢM ƠN VI PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ nét ung thư 1.2 Y học cổ truyền điều trị ung thư 1.3 Bài thuốc Nam Địa Long (NDL) 1.4 Nghiên cứu hoạt tính kích thích miễn dịch kháng oxi hóa dựa mơ hình chuột suy giảm miễn dịch CY CHƯƠNG VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 10 2.1 Chuẩn bị cao chiết thuốc 10 2.2 Mơ hình động vật 11 2.3 Phương pháp xác định số lượng bạch cầu tổng máu chuột 12 2.4 Phương pháp xác định số loại bạch cầu máu chuột 12 2.5 Phương pháp xác định phần trăm tế bào bạch cầu lympho TCD4 TCD8 máu chuột 14 2.6 Phương pháp xác định lượng cytokine IL-2 IL-6 máu chuột 14 2.7 Phương pháp xác định nồng độ protein 15 2.8 Phương pháp xác định mức độ peroxy lipid (TBARS) 15 2.9 Phương pháp xác định lượng glutathione (GSH) 17 2.10 Phương pháp xác định mức độ biểu gene 18 2.11 Phương pháp phân tích số liệu 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 22 3.1 Nội dung – Thu nhận cao chiết thuốc 22 3.2 Nội dung – Khảo sát sơ mơ hình thử nghiệm 22 3.2.1 Kết thay đổi trọng lượng chuột 23 3.2.2 Kết thay đổi đặc điểm liên quan đến miễn dịch 24 3.2.3 Kết thay đổi đặc điểm liên quan đến stress oxi hóa 27 3.3 Nội dung – Đánh giá hồi phục thể 29 3.4 Nội dung - Khảo sát khả kích thích miễn dịch NDL 30 3.4.1 Sự thay đổi tỉ lệ lượng lách, tuyến ức 30 3.4.2 Sự thay đổi số lượng bạch cầu máu chuột 31 3.4.3 Sự thay đổi bạch cầu lympho TCD4 TCD8 32 3.4.4 Sự thay đổi cytokine IL-2 IL-6 35 3.4.5 Bàn luận 37 3.5 Nội dung - Khảo sát khả kháng oxi hóa NDL 39 3.5.1 Khảo sát tỉ lệ trọng lượng gan 40 3.5.2 Sự thay đổi hàm lượng MDA gan chuột 41 3.5.3 Sự thay đổi hàm lượng glutathione gan chuột 41 3.5.4 Sự thay đổi mức độ biểu enzyme CAT SOD 42 3.5.5 Bàn luận 44 CHƯƠNG KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 47 4.1 Kết luận 47 4.2 Kiến nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 TÓM TẮT Y học cổ truyền (YHCT) nước ta đóng góp phần quan trọng hệ thống chăm sóc sức khỏe cịn gặp nhiều hạn chế thiếu chứng khoa học hiệu sản phẩm YHCT Bài thuốc Nam địa long (NDL) thuốc gồm: địa long (Pheretima aspergillum Michaelsen); đậu đen (Vigna unguiculata Walp.); đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek); bồ ngót (Sauropus androgynus (L) Merr.), dân gian sử dụng điều trị viêm khớp, động kinh, ung thư, … chưa có cơng bố liên quan đến thuốc Mục tiêu nghiên cứu nghiên cứu tác dụng bảo vệ thuốc mơ hình chuột tiêm cyclophosphamide (CY), chất hóa trị liệu ung thư Do đó, nghiên cứu khảo sát hai hoạt tính: (1) khả kích thích miễn dịch (2) kháng oxi hóa chuột gây ức chế miễn dịch stress oxi hóa Kết nghiên cứu cho thấy liều CY 150 mg/kg ức chế rõ rệt hệ miễn dịch chuột cảm ứng số đặc điểm stress oxi hóa NDL ngăn chặn sụt giảm trọng lượng thể, cải thiện phần trăm trọng lượng lách, tuyến ức làm tăng 42 – 44 % số lượng bạch cầu máu, NDL kích thích tăng sinh 48 – 53 % bạch cầu lympho, đặc biệt bạch cầu lympho TCD4 (34 – 43 %) lympho TCD8 (35 – 46%) so với lô bệnh lý Tuy nhiên, NDL không làm thay đổi hàm lượng IL-2 IL-6 đáng kể máu chuột NDL làm giảm đáng kể mức độ peroxy hóa lipid ngược lại cảm ứng tăng mức độ glutathione tăng biểu gene catalase superoxide dimustase đáng kể so với lô bệnh lý Những kết chứng NDL có khả kích thích miễn dịch kháng oxi hóa chuột tiêm CY I ABSTRACT Traditional medicine plays an integral role in Vietnamese healthcare system but scientific data limited In this study, we investigated the protective effect of a Vietnamese folk medicine formula, Nam Dia Long (NDL) on cyclophosphamide (CY) – induced immunosuppressive mice NDL formula include earthworm (Pheretima aspergillum, 10g), black bean (Vigna unguiculata Walp., 20g), mung bean (Vigna radiata (L.) Wilczek, 20g) and sweet leaf (Sauropus androgynus (L.) Merr.), 40g) According to this objective, we have two contents: (1) determination immunostimulant activity of NDL extract; (2) investigation antioxidant activity of NDL extract on CY-induced immunosupressive mice The result showed a single dose of CY administration (150 mg/kg) markedly supressed immune system and induced some biomarkers of oxidative stress NDL was against losing body weight, increased spleen index and thymus index, restored 42 – 44 % leukocyte than those of CY control mice Moreover, administration NDL significantly increased lymphocyte (48 – 53 %), CD4 T cells (34 – 43 %) and CD8 T cells (35 – 46 %) than those of immunosuppressive mice by CY IL-2 and IL-6 were not restored by NDL extract NDL significantly decreased malondialdehyde level In contrast, NDL increased glutathione and upregulated catalase and superoxide dimustase These results suggested NDL improved proliferation of immune cells and decrease the levels of oxidative stress on CY – induced mice II DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BC: bạch cầu BSA: Albumin huyết bị C: đối chứng, lơ chuột bình thường CAT: catalase CY: cyclophosphamide CY150: lô chuột tiêm CY liều 150 mg/kg thể trọng CY200: lô chuột tiêm CY liều 200 mg/kg thể trọng ĐĐ: đậu đen ĐL: địa long ĐX: đậu xanh GSH: glutathione Leva: Levamisole MDA: malondialdehyde NDL: Nam địa long Sily: silymarin SOD: superoxide dismutase WBC: bạch cầu tổng YHCT: Y học cổ truyền III DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông số mồi 19 Bảng 3.1 Trọng lượng chuột (g) lô thử nghiệm 23 Bảng 3.2 Phần trăm lách chuột lô thử nghiệm sau ngày tiêm CY 24 Bảng 3.3 Số lượng bạch cầu tổng lô thử nghiệm sau tiêm CY ngày 25 Bảng 3.4 Số lượng loại bạch cầu (BC) máu chuột lô thử nghiệm sau ngày tiêm CY 26 Bảng 3.5 Sự thay đổi % gan, hàm lượng MDA, GSH lô thử nghiệm sau ngày tiêm CY 27 Bảng 3.6 Sự thay đổi trọng lượng chuột lơ thí nghiệm 29 Bảng 3.7 Phần trăm lách tuyến ức lô thử nghiệm 30 Bảng 3.8 Số lượng số loại tế bào bạch cầu (BC) máu chuột lơ thí nghiệm 33 Bảng 3.9 Phần trăm tế bào TCD4 TCD8 lô thử nghiệm 35 Bảng 3.10 Nồng độ IL-2 IL-6 máu chuột lô thử nghiệm 36 Bảng 3.11 Phần trăm gan, nồng độ MDA GSH lô thử nghiệm 40 Bảng 3.12 Sự thay đổi biểu gene lơ thí nghiệm (n=3) 44 IV DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 2.1 Các vị thành phần thuốc NDL 10 Hình 2.2 Đặc điểm hình thái tế bào bạch cầu chuột (đực) quan sát phương pháp nhuộm Giemsa (100X) 13 Hình 3.1 Trọng lượng chuột lơ thử nghiệm sau ngày tiêm CY 24 Hình 3.2 Trọng lượng chuột lô thử nghiệm sau ngày tiêm CY 24 Hình 3.3 Phần trăm trọng lượng lách lô thử nghiệm sau ngày ngày tiêm CY Mỗi điểm đại diện cho giá trị chuột 25 Hình 3.4 Bạch cầu tổng số (WBC) máu chuột lô thử nghiệm sau ngày tiêm CY 26 Hình 3.5 Hàm lượng MDA lơ thử nghiệm sau ngày tiêm CY 28 Hình 3.6 Biểu đồ thay đổi trọng lượng chuột lơ thí nghiệm 30 Hình 3.7 Phần trăm lách (A) phần trăm tuyến ức (B) lơ thí nghiệm 31 Hình 3.8 Số lượng bạch cầu tổng (WBC) lơ thử nghiệm 32 Hình 3.9 Sự thay đổi số lượng bạch cầu lympho lơ thí nghiệm trước sau tiêm CY 34 Hình 3.10 Phần trăm bạch cầu lympho TCD4 TCD8 máu chuột 35 Hình 3.11 Nồng độ IL-2 huyết chuột lơ thí nghiệm 37 Hình 3.12 Nồng độ IL-6 huyết chuột lơ thí nghiệm 37 Hình 3.13 Phần trăm trọng lượng gan lô thử nghiệm 40 Hình 3.14 Sự thay đổi hàm lượng MDA gan chuột lơ thí nghiệm 41 Hình 3.15 Sự thay đổi hàm lượng MDA gan chuột lơ thí nghiệm 42 Hình 3.16 Sự thay đổi biểu CAT lơ thí nghiệm 43 Hình 3.17 Sự thay đổi biểu SOD1 lơ thí nghiệm 43 Hình 3.18 Sự thay đổi biểu SOD2 lô thí nghiệm 43 V LỜI CẢM ƠN Đề tài tài trợ Sở Khoa học Cơng nghệ TP.HCM (chương trình Vườn ươm sáng tạo Khoa học Cơng nghệ trẻ, Thành Đồn TP.HCM chủ trì) Chúng tơi chân thành cám ơn dược sĩ Nguyễn Phương Nam dược sĩ Dương Hồng Tố Quyên Bệnh viện Y học cổ truyền TP.HCM hỗ trợ việc cung cấp thành phần thuốc sắc thuốc Nhóm tác giả gửi lời cảm ơn đến Khoa Y học cổ truyền Phòng thí nghiệm Vi sinh cơng nghệ Dược, ĐH Y Dược TP HCM hỗ trợ thiết bị để thực nghiên cứu Các tác giả xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương, Trung Tâm Sâm Dược liệu chia sẻ kinh nghiệm hỗ trợ hóa chất cho thử nghiệm ban đầu Cuối xin cám ơn thành viên PTN Sinh học phân tử, Bộ mơn Di truyền đóng góp ý kiến hữu ích trình thực đề tài VI Đường chuẩn quercetin Đường chuẩn acid gallic 3,500 0,250 y = 0,0082x + 0,0411 R² = 0,9977 2,500 y = 0,0005x - 0,0011 R² = 0,9998 0,200 Delta OD510 Delta OD765 3,000 2,000 1,500 1,000 0,150 0,100 0,050 0,500 0,000 0,000 100 200 300 400 Nồng độ acid gallic (µg/ml) 500 100 200 300 400 500 Nồng độ quercetin (µg/ml) Hình Đường chuẩn acid gallic Hình Đường chuẩn quercetin Từ kết định tính trên, chúng tơi sử dụng vitexin làm chất đại diện cho thuốc NDL Đường chuẩn vitexin xây dựng dựa tương quan tuyến tính nồng độ vitexin diện tích đỉnh xác định phương pháp HPLC Từ khoảng tuyến tính này, phương trình đường chuẩn vitexin xác định phần mềm Excel y = 20382x + 326388 (R2 = 0,9993) (Hình 4, hình 5-vitexin) Ba mẫu NDL khảo sát theo điều kiện HPLC xây dựng vitexin, cho thấy hàm lượng vitexin cao chiết thuốc 0,37 ± 0,01 mg/g (hình – NDL) Như vậy, diện vitexin với hàm lượng 0,37 ± 0,01 mg/g sử dụng làm thơng số góp phần đánh giá ổn định thành phần hóa học mẻ thuốc NDL chiết sắc tương lai Hình Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính diện tích pic nồng độ vitexin Hình Sắc kí đồ HPLC thuốc NDL với chất chuẩn vitexin PHỤ LỤC – SỐ LIỆU THÔ CỦA THỰC NGHIỆM 3.1 Trọng lượng chuột (g) lô khác Lô C CY NDL1 Trọng lượng chuột theo ngày (g) Lô 23 23 24 23 25 24 24 24 25 23 25 24 24 25 24 22 25 24 22 22 23 23 23 23 21 25 24 23 23 22 21 22 23 23 22 24 22 22 24 23 24 23 20 23 23 22 23 23 NDL2 21 21 23 23 23 23 23 23 22 22 23 22 22 23 21 22 23 22 22 23 23 22 21 23 22 24 20 23 22 23 22 23 22 24 23 22 21 23 23 23 21 24 23 25 25 25 25 24 22 24 23 24 22 23 25 21 22 24 23 23 21 24 23 28 27 26 27 26 21 22 24 23 22 21 23 21 21 21 23 24 22 24 23 28 27 26 26 25 22 22 23 22 21 22 21 20 21 23 23 22 25 24 28 28 27 28 25 22 22 25 23 21 21 22 21 19 21 22 23 22 25 24 27 27 26 28 25 22 20 25 23 19 20 20 20 18 22 20 23 20 25 21 27 26 24 28 22 Leva Sily Trọng lượng chuột theo ngày (g) 24 25 24 24 23 22 22 23 21 22 22 21 23 24 24 25 24 23 23 23 22 21 22 22 23 23 23 23 23 21 24 25 27 28 28 28 24 25 23 23 23 21 25 24 25 26 26 26 25 25 24 25 25 25 24 25 23 23 22 21 22 21 21 21 21 20 20 21 20 21 20 20 25 25 19 19 20 22 24 23 24 25 24 26 25 26 26 26 25 26 26 26 27 26 24 27 26 27 27 28 23 24 24 25 25 24 25 27 26 26 27 26 23 25 25 26 26 25 22 21 21 22 21 21 21 21 21 23 23 21 21 22 22 22 21 21 22 22 22 22 22 22 21 21 21 20 20 20 23 23 23 23 23 23 22 22 23 23 23 24 21 22 24 23 23 22 23 22 23 22 25 24 24 23 21 23 25 23 24 24 21 22 23 24 23 25 24 23 25 25 23 24 24 23 24 24 23 24 23 23 20 22 23 22 22 23 21 22 25 23 22 22 20 21 23 22 22 22 20 20 22 21 22 22 19 20 21 21 20 21 21 21 21 22 22 23 22 22 22 22 22 21 22 22 24 23 23 24 24 24 23 22 24 23 23 23 23 22 23 24 24 23 24 23 24 23 23 23 23 24 22 23 24 23 23 22 23 3.2 Phần trăm trọng lượng lách tuyến ức lô thử nghiệm C 0,44 0,60 0,51 0,64 0,70 0,41 0,63 0,45 0,51 0,69 0,63 0,47 0,59 0,56 % trọng lượng lách CY NDL1 NDL2 0,21 0,28 0,35 0,28 0,34 0,27 0,27 0,19 0,29 0,23 0,41 0,29 0,25 0,23 0,36 0,26 0,30 0,32 0,20 0,28 0,41 0,30 0,27 0,24 0,35 0,31 0,40 0,44 Leva 0,42 0,36 0,39 0,28 0,34 0,32 0,22 0,36 0,42 0,43 0,26 0,30 C 0,34 0,40 0,30 0,33 0,37 0,30 0,37 0,32 0,35 0,37 0,32 0,32 0,42 % trọng lượng tuyến ức CY NDL1 NDL2 Leva 0,12 0,13 0,10 0,19 0,11 0,11 0,10 0,16 0,06 0,14 0,09 0,18 0,08 0,09 0,14 0,15 0,10 0,08 0,12 0,15 0,09 0,10 0,12 0,17 0,10 0,07 0,10 0,16 0,09 0,14 0,12 0,15 0,12 0,10 0,12 0,13 0,08 0,08 0,11 0,09 3.3 Số lượng bạch cầu tổng lô thử nghiệm C 3,25 3,15 3,30 3,80 3,25 3,05 CY 2,50 3,85 4,65 4,00 4,25 4,25 Ngày NDL1 NDL2 3,15 4,65 3,50 3,50 5,80 2,90 5,10 3,10 3,60 3,65 3,80 3,80 Leva 4,30 5,05 4,80 5,00 3,10 5,00 C 2,45 4,00 4,55 3,60 5,80 4,55 Ngày CY NDL1 NDL2 Leva 0,85 0,85 0,65 0,65 0,55 1,15 1,20 1,30 0,80 0,40 0,45 1,25 0,55 0,75 1,00 2,80 0,25 0,50 0,50 1,10 0,60 0,35 0,90 1,95 23 23 22 23 24 22 23 22 22 3,15 3,30 3,00 3,60 4,05 4,45 4,15 3,65 3,80 2,85 3,75 4,60 3,75 2,55 4,25 3,65 3,50 2,40 2,50 4,80 2,45 3,65 3,50 3,15 4,20 3,55 3,25 4,35 3,95 2,70 5,10 3,30 3,40 4,85 6,45 5,70 2,50 2,50 2,90 2,55 5,35 2,70 3,55 4,75 4,35 2,45 0,30 0,30 0,15 0,15 0,90 0,50 1,15 1,10 1,25 1,05 0,80 0,40 0,70 1,15 2,75 1,40 1,20 3.4 Số lượng loại bạch cầu lô khác Trước tiêm L ô Số tế bào (10^7/l) L C Sau thử nghiệm M N Số tế bào (10^7/l) E L M N Trước tiêm L ô E Sau thử nghiệm Số tế bào (10^7/l) L M Số tế bào (10^7/l) N E L M N E 299,0 0,0 22,8 3,3 215,6 0,0 29,4 0,0 222,5 27,5 51,0 13,0 236,3 6,3 63,0 0,0 297,2 12,0 87,2 3,6 342,7 3,9 38,5 49,5 11,4 300,3 0,0 29,7 3,8 365,8 0,0 89,2 0,0 293,0 4,0 24,0 65,4 11,4 304,0 3,8 68,4 1,6 287,3 0,0 69,1 3,6 361,3 63,8 47,9 5,5 240,5 1,6 35,2 3,3 401,4 0,0 34,1 0,0 342,1 75,2 23,3 14,6 250,1 5,7 58,5 0,0 399,9 16,8 23,0 4,1 356,9 3,8 74,3 31,2 5,3 247,6 0,0 45,8 0,0 219,5 7,8 24,9 0,0 317,9 81,3 29,1 1,7 325,6 39,4 30,0 0,9 C Y 230,7 0,0 53,9 0,0 254,9 7,5 30,0 2,6 234,0 0,0 57,6 0,0 243,5 0,0 2,8 205,2 71,3 15,0 0,0 247,1 0,0 65,0 0,0 168,8 10,2 0,0 213,8 60,0 15,0 0,0 198,0 0,0 51,2 0,0 232,0 7,8 90,9 112, 125, 2,6 315,0 92,0 0 0,0 33,3 0,0 336,1 10,5 94,7 0,0 227,0 0 314,2 13,4 52,0 0,0 186,5 0,0 171,7 0 0,0 6,5 N D L 244,1 0,0 70,9 0,0 79,1 0,0 6,0 0,0 302,3 4,7 84,6 243,6 8,4 95,2 2,8 111,7 0,0 2,2 0,0 280,7 0,0 69,3 475,6 5,8 92,8 5,8 39,6 0,0 0,4 0,0 252,3 2,9 31,9 469,2 0,0 35,7 5,1 74,3 0,0 0,8 0,0 237,8 0,0 69,1 272,5 7,6 3,2 47,2 0,0 0,0 0,0 330,7 6,3 21,8 254,6 4,3 0,0 30,3 0,0 2,8 0,0 320,9 0,0 38,0 297,5 7,8 59,4 117, 119, 4,3 82,8 0,0 4,7 0,0 277,2 0,0 34,6 N D L 0, 0, 0, 2, 3, 0, 0, 65,0 116, 0,0 0 3,6 44,4 100, 0 0,6 0 0,0 50,0 0,0 83,3 110, 5,6 0 0,0 3, 95,0 11,4 0 80,0 7,8 0,0 38,4 0,0 1,2 0,0 69,3 1,6 1,1 0,0 0,7 329,7 0,0 23,5 3,9 50,0 0,0 6,0 0,0 294,0 0,0 248,5 0,0 0,0 24,5 0,0 0,0 0,0 248,5 0,0 210,0 0,0 65,2 101, 0,0 113,9 0,0 0,5 373,7 0,0 88,5 0,0 108,9 0,0 40,0 0,0 37,8 106, 0,0 L e v a 245,1 0,0 400,0 0,0 105, 163, 316,9 0,0 270,9 0,0 62,4 0,0 2,6 0,0 L: BC lympho 0,0 127,4 0,0 2,6 0,0 M: BC đơn nhân 63,1 0,0 123,8 0,0 1,3 0,0 N: BC trung tính 0,0 33,1 0,0 35,2 0,0 0,5 0,0 E: BC ưa acid 256,8 0,0 0,0 85,4 1,0 3,3 0,0 226,8 0,0 58,1 138, 0,0 144,8 2,8 5,6 0,0 267,3 0,0 0,0 78,2 0,0 24,6 0,0 272,0 0,0 43,2 102, 0,0 87,5 2,0 48,3 0,0 363,8 0,0 62,7 0,0 3,3 33,5 0,0 0,0 68,0 121, 0,0 0,0 68,8 0,0 1,5 51,0 3.5 Phần trăm số bạch cầu TCD4 TCD8 L ô C LymphoT( %) CD4 CD8 Lô LymphoT( %) CD4 CD8 Lô LymphoT( %) CD4 CD8 Lô LymphoT( %) CD4 CD8 Lô LymphoT( %) CD4 CD8 10,2 7,8 0,5 14,1 1,5 12,4 1,4 15,1 11,2 4,5 9,8 1,7 16,1 1,5 14,5 3,1 18,4 1,7 17,7 1,8 10,7 0,4 11,7 1,5 8,9 0,8 11,1 1,6 19,4 3,4 9,4 1,2 16,4 3,3 21,1 13,8 1,7 16,1 2,7 8,8 0,7 14,8 3,8 7,1 0,9 15,3 2,9 13,7 11,1 1,7 12,1 0,7 31,7 2,5 15,4 2,1 18,9 4,5 9,3 0,8 16,1 1,9 9,7 2,9 9,9 1,3 15,2 4,6 8,8 1,1 11 2,3 22,5 1,7 10,1 2,7 18,7 2,3 7,1 0,3 12,7 1,2 20,2 2,7 17,6 2,8 22,2 6,7 12,2 1,7 18,2 0,7 10,3 2,1 19,2 2,6 11,5 5,4 2,1 7,8 3,2 19,9 6,6 2,1 16 3,1 20,5 C Y NDL NDL 25,6 Lev a 1,3 3.6 Phần trăm trọng lượng gan, nồng độ MDA GSH lô thử nghiệm Lô % gan 6,64 C ND L1 6,66 6,63 7,22 7,09 7,51 6,21 6,57 6,71 6,26 6,37 6,56 6,54 7,21 8,34 6,97 7,39 8,99 6,55 7,95 6,18 8,73 7,55 7,10 7,15 MDA GSH (pM/m (nM/m g) g) 638,64 17,51 301,71 14,34 365,53 14,43 337,15 24,39 820,65 19,26 992,91 18,94 397,52 12,52 439,02 14,92 Lô CY % gan 8,20 7,60 7,12 7,68 7,70 7,49 6,51 7,07 264,03 549,35 318,77 469,39 13,27 7,51 7,31 7,46 466,74 431,62 447,85 590,08 388,62 337,04 264,29 705,42 555,94 23,56 17,65 16,84 24,64 26,25 13,56 14,62 17,74 12,75 11,65 7,78 8,19 6,61 7,68 8,18 7,06 7,34 6,83 7,14 7,61 7,58 ND L2 MDA GSH (pM/m (nM/m g) g) 588,27 9,56 928,28 11,25 458,77 14,32 950,03 16,36 1097,0 6,94 450,13 8,61 692,17 17,96 647,19 1131,2 502,87 562,16 681,00 415,01 406,47 602,97 19,65 585,31 41,18 620,78 25,64 602,94 25,06 729,81 33,45 749,43 21,03 467,17 9,46 285,40 34,03 3.7 Sự biểu tương đối gene SOD1, SOD2 CAT Lô Sil y % gan 6,58 7,31 6,89 6,22 7,33 6,63 6,97 7,11 6,45 6,07 6,24 5,70 5,78 MDA GSH (pM/m (nM/m g) g) 713,41 13,17 518,69 17,43 523,98 15,55 518,16 12,24 314,60 11,33 418,20 26,98 279,55 20,94 301,21 18,99 262,57 297,61 13,32 12,41 CAT SOD1 SOD2 C 1 1 1 1 CY 1,31 2,94 -2,29 -3,63 -7,36 -2,01 -4,15 -2,43 -3,95 NDL1 11,13 5,84 16,87 -1,26 -2,28 -2,93 -3,47 1,41 1,24 NDL2 2,86 4,34 11,85 -2,79 -2,73 -2,03 -1,47 -1,32 -2,27 Sily 10,03 16,64 12,52 -1,01 1,03 -2,30 1,01 1,85 1,15 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA BÀI THUỐC NAM ĐỊA LONG TRÊN CHUỘT GÂY SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẰNG CYCLOPHOSPHOMID Nguyễn Thị Mỹ Nương1,*, Bùi Thị Như Ngọc1, Âu Dương Tuyết Mai1, Đinh Minh Hiệp2 Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM Ban Quản lý Khu Nông nghiệp Công nghệ cao TP HCM TÓM TẮT Nam Địa Long (NDL) thuốc dân gian Việt Nam, gồm vị Địa long, Đậu đen, Đậu xanh Bồ ngót, dùng điều trị động kinh, viêm khớp ung thư chưa có nghiên cứu cơng bố Cơng trình nhằm khảo sát tác động kích thích tăng sinh tế bào miễn dịch thuốc mơ hình dược lý thực nghiệm Trên mơ hình chuột nhắt trắng bị suy giảm miễn dịch cyclophosphamid (CY), NDL ngăn chặn sụt giảm trọng lượng thể, cải thiện số lách, tuyến ức làm tăng 42 – 44 % số lượng bạch cầu máu, NDL kích thích tăng sinh 48 – 53 % bạch cầu lympho, đặc biệt bạch cầu lympho TCD4 (34 – 43 %) lympho TCD8 (35 – 46%) so với lô bệnh lý Như vậy, mơ hình này, thuốc NDL có tiềm làm giảm tác dụng gây suy giảm miễn dịch cyclophosphomid Từ khóa: Nam Địa Long, kích thích miễn dịch, suy giảm miễn dịch cyclophosphamid MỞ ĐẦU Hóa trị liệu ung thư thường có tác dụng phụ nghiêm trọng cho bệnh nhân độc tính thuốc hóa trị tế bào lành, suy giảm hệ tạo máu, dẫn đến suy giảm hệ thống miễn dịch thể bệnh nhân [1] Do việc ngăn chặn độc tính hay phục hồi hệ miễn dịch vấn đề quan trọng hỗ trợ điều trị ung thư Ở Việt Nam, y học cổ truyền đóng vai trị quan trọng hệ thống chăm sóc sức khỏe người dân nói chung, hỗ trợ điều trị ung thư nói riêng Trong thuốc cổ truyền/dân gian phối hợp nhiều vị thuốc nhằm gia tăng tác dụng thuốc, đồng thời giảm tác dụng phụ Theo nguyên tắc này, thuốc hỗ trợ điều trị ung thư với phối hợp nhiều vị tạo hiệu đa tác động hỗ trợ tiêu diệt tế bào ung thư, giảm ảnh hưởng đến tế bào lành, tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng, cải thiện chất lượng sống bệnh nhân,… [2] Nam Địa Long (NDL) thuốc nước ta giới thiệu cụ Nguyễn An Định dùng điều trị động kinh, viêm khớp ung thư chưa có cơng trình nghiên cứu khoa học công bố thuốc Thành phần NDL gồm Địa long (Pheretima aspergillum Michaelsen), Đậu đen (Vigna unguiculata Walp subsp cylindrica (L.) Verdc), Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) Bồ ngót (Sauropus androgynus (L) Merr.) Trong Đơng y, Địa long có tác dụng hạ nhiệt, an thần, giảm hen suyễn, chống đông tụ máu Đậu đen, Đậu xanh nói chung chứa nhiều chất dinh dưỡng, có tác dụng giải nhiệt độc, an thần Bồ ngót có tác dụng mát huyết, hoạt huyết, lợi tiểu, giải độc Trong nghiên cứu gần đây, chúng tơi chứng minh NDL có tác dụng gây độc chọn lọc tế bào ung thư vú MCF-7 so với tế bào thường fibroblast Hơn NDL có tác dụng gây chết tế bào MCF-7 cách cảm ứng MCF-7 chết theo chương trình [3] Trong nghiên cứu này, nhằm khảo sát tác động kích thích tăng cường miễn dịch hướng đến tác động hỗ trợ điều trị ung thư, khảo sát tác động miễn dịch in vivo thuốc mơ hình chuột suy giảm miễn dịch CY – chất hóa trị liệu ung thư [1] VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Bài thuốc NDL gồm thân khô Địa long (100 g), hạt Đậu đen (200 g), hạt Đậu xanh (200 g) thân Bồ ngót khơ (400 g) Bài thuốc chiết xuất theo phương pháp sắc thuốc thang truyền thống bệnh viện Y học cổ truyền TPHCM Các nguyên liệu cân đủ khối lượng, trộn chung ngâm nước khoảng 20 phút, sau đun hệ thống sắc thuốc tự động thu dịch chiết có nồng độ khoảng g dược liệu thô/ml Dịch chiết thuốc đông khô thành dạng bột bảo quản -70 oC Liều sử dụng tính tốn dựa theo liều uống người qui đổi thử nghiệm chuột (gấp 12 lần liều người) Liều uống người 180 ml nước sắc thuốc/người/57,7 kg (khối lượng trung bình người châu Á) Hiệu suất đông khô nước sắc thuốc 0,032 g/ml nên liều uống người qui đổi 0,1 g bột đơng khơ/kg Từ suy liều thử nghiệm chuột 1,2 g/kg Trong nghiên cứu sử dụng liều 1,2 g/kg thể trọng chuột (NDL1) 2,4 g/kg thể trọng chuột (NDL2) Bột thuốc hòa tan trở lại nước cất với nồng độ 0,2 g/ml, để thể tích thuốc cho chuột uống khoảng 0,12-0,15 ml/lần uống lô NDL1 khoảng 0,2 - 0,24 ml/lần uống lơ NDL2 cho chuột trọng khoảng 20-24 g [4] 2.1.2 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 22 ± g, - tuần tuổi, giống đực, khỏe mạnh, Viện Pasteur TP.HCM cung cấp Sau vận chuyển, chuột nuôi ổn định tuần trước tiến hành thí nghiệm Chuột ni lồng nhựa quan sát 12 chu kỳ sáng/12 chu kỳ tối Thức ăn cho chuột cám viên Viện Pasteur TPHCM cung cấp, với thành phần gồm bột gạo, bột bắp vitamin bổ sung 2.1.3 Các hóa chất sử dụng Cyclophosphamid (CY) hãng Sigma Kháng thể PE Rat Anti-Mouse CD4 (553730) FITC Rat Anti-Mouse CD8a (553031) hãng BD Biosciences Levamisole chế phẩm Bio-leva cơng ty Bio-Pharmachemie Các loại hóa chất khác Merck cung cấp 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng mẫu thử miễn dịch chuột gây suy giảm miễn dịch cyclophosphomid Thí nghiệm in vivo bố trí theo hướng dẫn cho thử nghiệm dược lý mơ hình động vật [4, 5] Chuột chia ngẫu nhiên thành lô, lơ có 15 chuột sau: (1) Lơ chứng sinh lý (C): chuột không tiêm CY cho uống nước cất; (2) Lô bệnh lý (CY): chuột tiêm CY, tiêm phúc mạc liều 150 mg/kg thể trọng ngày cho uống nước cất từ ngày đến ngày 5; (3,4) Lô thử nghiệm (NDL1, NDL2): chuột tiêm CY ngày cho uống NDL liều 1,2 g/kg 2,4 g/kg thể trọng; (5) Lô đối chứng dương (Leva): chuột tiêm CY ngày cho uống Levamisole liều 30 mg/kg thể trọng Thể tích tiêm CY 0,1 ml/10g thể trọng chuột Thời gian cho uống tiêm tiến hành khoảng từ 8-11 sáng Trước tiến hành tạo mơ hình (ngày 0) chuột lấy máu tĩnh mạch đuôi để xác định số lượng bạch cầu tổng (WBC) công thức bạch cầu (bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính bạch cầu ưa axit) Chuột cân ngày trước cho uống thuốc Khoảng sau uống thuốc ngày thứ 5, chuột lấy máu tĩnh mạch đuôi để xác định trị số WBC công thức bạch cầu, lấy máu tim để xác định phần trăm bạch cầu lympho TCD4 TCD8 Lách tuyến ức thu nhận xác định trọng lượng Chỉ số lách tuyến ức số trọng lượng lách tuyến ức chia trọng lượng thể chuột nhân với 100 Chuột nuôi thử nghiệm mơ hình Khoa Y học cổ truyền, trường Đại học Y dược TP.HCM Các thử nghiệm xác định số lượng bạch cầu máu chuột, xác định số lượng bạch cầu TCD4 TCD8 thực Bộ môn Di truyền, trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM Xác định số lượng bạch cầu máu chuột WBC xác định cách đếm tươi buồng đếm hồng cầu, sau phá hồng cầu axit axetic % (v/v) Kết số lượng bạch cầu tính theo cơng thức Nx20x10 Tế bào/mm = Trong đó: N: số bạch cầu đếm ơ; 20: độ pha lỗng 1/10 mm: chiều cao từ buồng đếm đến lamelle Công thức bạch cầu (bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính bạch cầu ưa axit) xác định phương pháp nhuộm Giemsa Một giọt máu chuột đặt lame kính kéo dài thành vệt mỏng Khi vết máu khơ, lame kính nhúng ethanol tuyệt đối phút để khô tự nhiên Sau lame kính tiếp tục ngâm thuốc nhuộm Giemsa 3,8 g/l Sau 45 phút, lame rửa vịi nước chảy, sau để khơ quan sát kính hiển vi vật kính x100 Phần trăm loại bạch cầu tổng số 100 tế bào bạch cầu xác định Số lượng loại tế bào bạch cầu phần trăm loại tế bào x WBC Xác định tế bào bạch cầu lympho TCD4 TCD8 máu chuột Phần trăm số bạch cầu lympho TCD4 TCD8 máu toàn phần xác định phương pháp dòng chảy tế bào (flow cytometry) theo khuyến cáo BD Biosciences [6] Kháng thể kháng CD4 đánh dấu PE kháng thể kháng CD8 đánh dấu FITC cho vào 20 μl máu toàn phần (nồng độ kháng thể cuối 10 μg/ml) ủ 30 phút tối Sau hỗn hợp ủ 10 phút tối với dung dịch ly giải hồng cầu Ly tâm 500 g phút loại bỏ dịch Tế bào rửa lại lần với dung dịch PBS Thêm ml dung dịch paraformaldehyd % phân tích máy flow cytometer C6 (BD) Mẫu không nhuộm kháng thể sử dụng để loại trừ tín hiệu 2.2.2 Phân tích số liệu Các số liệu định lượng trình bày dạng trung bình ± độ lệch chuẩn với độ lặp lại thí nghiệm lần Trong thử nghiệm in vivo, số liệu nằm khoảng giá trị trung bình ± lần độ lệch chuẩn loại bỏ khỏi nhóm [7] Do số liệu n lô nằm khoảng – 15, khác lơ Sự khác biệt lô kiểm tra two-tailed unpaired Student’s t-tests phần mềm Graphpad Prism Sự khác biệt hai nhóm xem có ý nghĩa thống kê p