Nghiên cứu trích ly lipid và khả năng kháng oxy hóa của 02 loại rong nâu

SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINHTP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 15/01/2015) NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPID VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ LOẠI RONG NÂU CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: TRẦN THỊ NGỌC MAI CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINHTP HỒ CHÍ MINH THÀNH ĐỒN CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ * BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu ngày 15/01/2015) NGHIÊN CỨU TRÍCH LY LIPID VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ LOẠI RONG NÂU Thủ trưởng Cơ quan chủ trì đề tài (Họ tên, chữ ký, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (Họ tên chữ ký) Giám đốc Sở Khoa học Công nghệ Chủ tịch Hội đồng xét duyệt ii TÓM TẮT Rong biển nguồn tài nguyên phong phú, đa dạng chủng loại vùng biển Việt Nam.Vốn nguồn nguyên liệu dễ kiếm, giá thành rẻ, thời gian nuôi trồng ngắn… cho thấy nguồn nguyên liệu tiềm cần nghiên cứu khai thác chế biến cho phù hợp Theo cơng trình nghiên cứu giới cho thấy: Ở rong biển (đặc biệt rong nâu) chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh học cao α-tocopherol, β-carotene, polyphenol, acid béo thiết yếu… Thành phần carbohydrate chiếm tỷ lệ cao rong, nghiên cứu sâu rộng giới Việt Nam.Nghiên cứu lipid thành phần có hoạt tính sinh học rong nâu Việt Nam giới hạn (chỉ 4bài báođược cơng bố) Do đó, việc “Nghiên cứu trích ly lipid khả kháng oxy hóa số loại rong nâu”là vấn đề cần triển khai để có định hướng khai thác sử dụng nguồn nguyên liệu tiềm Nghiên cứu tiến hành loại rong nâu rong mơ Sargassum feldmannii rong Sargassum polycystum; q trình trích ly lipid khảo sát qua phương pháp phương pháp Soxhlet, phương pháp chiết sóng siêu âm, phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý Viscozyme L, phương pháp chiết CO2 siêu tới hạn; cao chiết đánh giá khả kháng oxy hoá phương pháp quét gốc tự DPPH phân tích thành phần acid béo phương pháp GC/MS Kết cho thấy chiết phương pháp sử dụng sóng siêu âm phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý Viscozyme L cho hiệu cao so với phương pháp lại Tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp khoảng 7-8% tính theo khối lượng khơ; khả bắt gốc tự DPPH khoảng 57-58% so với chất đối chiếu vitamin C khoảng 61-63%; thành phần acid béo chưa bão hoà đơn khoảng 17%, acid béo chưa bão hoà đa khoảng 15-18%, thành phần acid béo thuộc nhóm ω-6 18,67% Sargassum feldmannii 15,16% Sargassum polycystum, đặc biệt acid arachidonic tương ứng 9,1 8,94% iii ABSTRACT Seaweed is rich in natural resources, diversity of species in Vietnam’s sea Since this materialisavailable, inexpensive, short-time planting and harvesting it indicates that it is a potential resource and it is necessary for studying and exploiting and processing According to the studies on the world: In the seaweed (especially brown seaweed) it contains many components of highly biologically active compounds such as αtocopherol, β-carotene, polyphenols, essential fatty acids Carbohydrate concentration is high in seaweed, which was extensively researched on the world and in Vietnam Studies on lipid composition and biological activity of brown seaweed in Vietnam is still very limited (only articles have been published) Thus, the "Research on lipid extraction and antioxidativeactivity of some type of brown seaweed" is an issue to be studyfor exploitation and manufacturing The study was conducted with two types of brown seaweed, Sargassum feldmannii and Sargassum polycystum; the lipid extraction was examined through four methods the Soxhlet extraction, the extraction assisted by ultrasonic waves method, the combination of shaking - immersing with Viscozyme L treating method, the extraction with supercritical CO2; the extracts were evaluated antioxidative activity by scanning DPPH method and analyzed fatty acid composition by GC/MS Results showed that extraction method using ultrasonic waves and soakingimmersion method combines treating with Viscozyme L have higher efficiency than the other methods The yield of both extraction methods are high of 7-8% by dry weight; the ability to capture free radicals DPPH is approximately 57-58% compared withthat of vitamin C is about 61-63%; the composition of unsaturated fatty acid is about 17%, the unsaturated fatty acid is of about 15-18%, the ω-6 fatty acid is of18.67% in Sargassum feldmannii and 15.16% in Sargassum polycystum,especially arachidonic acid in these seaweed of 9.1 and 8.94%, respectively iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Hàm lượng protein thô acid amin rong biển theo khối lượng khơ - Bảng 1.2 Hàm lượng khống số lồi rong biển theo khối lượng khơ - Bảng 1.3 Hàm lượng iode số lồi rong biển theo khối lượng khơ 10 Bảng 1.4 Hàm lượng fucoxanthin rong nâu Cladosiphon okamuranus - 12 Bảng 1.5 Hàm lượng chất béo thu từ số lồi rong nâu theo khối lượng khơ - 13 Bảng 1.6 Hàm lượng chất xơ tổng số (TDF), xơ tan (SF) xơ không tan (IF) số loài rong nâu 15 Bảng 3.1 Sự ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp Soxhlet - 30 Bảng 3.2 Sự ảnh hưởng dung môi chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp Soxhlet - 31 Bảng 3.3 Sự ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm - 33 Bảng 3.4 Sự ảnh hưởng dung môi chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm - 35 Bảng 3.5 Sự ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm - 37 Bảng 3.6 Sự ảnh hưởng thời gian xử lý sóng siêu âm đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 38 Bảng 3.7 Sự ảnh hưởng việc xử lý enzyme lên kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 41 Bảng 3.8 Sự ảnh hưởng nồng độ enzyme đến tỉ lệ thu hồi cao chiết 42 Bảng 3.9 Sự ảnh hưởng nhiệt độ ủ enzyme đến tỉ lệ thu hồi cao chiết 44 v Bảng 3.10 Sự ảnh hưởng thời gian ủ enzyme đến tỉ lệ thu hồi cao chiết 45 Bảng 3.11 Sự ảnh hưởng áp suất chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn - 47 Bảng 3.12 Sự ảnh hưởng nhiệt độ đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn 49 Bảng 3.13.So sánh điều kiện chiết tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết 50 Bảng 3.14 Khả bắt gốc tự DPPH cao chiết thu từ phương pháp 53 Bảng 3.15 Kết phân tích thành phần acid béo có cao chiết lipid (Phương pháp phân tích: Ref AOAC 996.06:2011 GC/MS) 55 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Hình thái rong mơ - Hình 1.2.Sargassum sp Hình 1.3.Sargassum polycystum Hình 1.4.Sargassum crassifolium - Hình 1.5 Biểu đồ sản lượng khai thác rong nâu toàn cầu (thống kê FAO) Hình 1.6 Biểu đồ sản lượng ni trồng rong nâu tồn cầu (thống kê FAO) Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo fucoxanthin - 12 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu - 28 Hình 3.1.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp Soxhlet - 30 Hình 3.2.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng dung môi chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp Soxhlet 32 Hình 3.3.Quá trình tác động sóng siêu âm lên tế bào 33 Hình 3.4.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm - 34 Hình 3.5.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng dung môi chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm - 35 Hình 3.6.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm - 37 Hình 3.7.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian xử lý sóng siêu âm đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 39 Hình 3.8.Cấu tạo thành tế bào rong nâu - 40 vii Hình 3.9.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng việc xử lý enzyme lên kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 41 Hình 3.10.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nồng độ enzyme đến tỉ lệ thu hồi cao chiết 43 Hình 3.11.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ ủ enzyme đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 44 Hình 3.12.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng thời gian ủ enzyme đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 45 Hình 3.13.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng áp suất chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn - 48 Hình 3.14.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn - 49 Hình 3.15.Biểu đồ biểu diễn so sánh tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết 51 Hình 3.16.Biểu đồ biểu diễn so sánh khả bắt gốc tự DPPH cao chiết phương pháp chiết 54 Hình 4.1.Sơ đồ quy trình cơng nghệ chiết lipid phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý Viscozyme L - 59 viii MỤC LỤC TÓM TẮT iii ABSTRACT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ - vii PHẦN MỞ ĐẦU (Dành cho Báo cáo giám định) xiii Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU 1.1.1 Phân loại khoa học - 1.1.2 Đặc điểm sinh lý phân bố 1.1.3 Đặc điểm thực vật 1.1.4 Tình hình khai thác sử dụng rong nâu giới Việt Nam 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC - 1.2.1 Protein acid amin - 1.2.2 Khoáng chất - 1.2.3 Vitamin - 10 1.2.4 Lipid 13 1.2.5 Carbohydrate - 14 1.3 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH TRÍCH LY 16 1.3.1 Nguyên liệu 16 1.3.2 Dung môi - 17 1.3.3 Kỹ thuật trích ly - 18 1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC VỀ TRÍCH LY LIPID VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ Ở RONG NÂU - 19 1.4.1 Trong nước - 19 ix 1.4.2 Ngoài nước - 20 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phương pháp chiết (Phương pháp ngâm) 21 2.2.2 Phương pháp đánh giá khả kháng oxy hoá cao chiết (Phương pháp bắt gốc tự DPPH) 21 2.2.3 Phương pháp phân tích thành phần acid béo (Phương pháp GC-MS) - 21 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu - 21 2.3 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM - 22 2.3.1 Khảo sát trình chiết phương pháp Soxhlet - 22 2.3.2 Khảo sát q trình chiết phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm 22 2.3.3 Khảo sát trình chiết phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý enzyme 24 2.3.4 Khảo sát trình chiết phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn - 26 2.3.5 Đánh giá khả bắt gốc tự DPPH cao chiết - 27 2.3.6 Phân tích thành phần acid béo cao chiết 27 2.4 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU - 28 2.4.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 28 2.4.2 Thuyết minh quy trình 29 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN - 30 3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOXHLET 30 3.1.1 Sự ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến tỉ lệ thu hồi cao chiết 30 3.1.2 Sự ảnh hưởng dung môi chiết đến tỉ lệ thu hồi cao chiết - 31 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SỬ DỤNG SÓNG SIÊU ÂM 32 x Bảng 3.13.So sánh điều kiện chiết tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết Phương pháp Tỉ lệ thu hồi cao chiết (%) S.f Soxhlet 6,774±0,060 Điều kiện chiết S.p 6,575±0,413 -Kích thước bột rong 0,25mm -Dung mơi chiết MeOH -Thời gian chiết Chiết sóng 7,095±0,055 8,373±0,122 -Tần số 20kHz siêu âm -Kích thước bột rong 0,25mm -Dung môi chiết hỗn hợp dung môi DCM/MeOH -Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi 1/7 S feldmannii, 1/6 S polycystum -Thời gian xử lý 15 phút Ngâm lắc kết 7,192±0,213 8,020±0,186 -Kích thước bột rong 0,5mm hợp xử lý -Nồng độ enzyme 1,5% Viscozyme L -Nhiệt độ ủ enzyme 50±2oC -Thời gian ủ enzyme Rong sau xử lý, chiết dung môi DCM/MeOH (1/1), tỉ lệ dung môi/nguyên liệu 7/1, thời gian chiết 18 Chiết CO2 3,649±0,131 -Dung môi hỗ trợ ethanol - siêu tới hạn -Tốc độ dòng 10g/phút 50 -Kích thước bột rong 0,5mm -Thời gian chiết -Áp suất 200bar -Nhiệt độ 50oC Tỉ lệ thu hồi cao chiết (%) S.f: S feldmannii, S.p: S polycystum So sánh tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết Soxhlet Sóng siêu âm Sargassum feldmannii Viscozyme L CO2 siêu tới hạn Sargassum polycystum Hình 3.15.Biểu đồ biểu diễn so sánh tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chiết Dựa vào Bảng 3.13.và Hình 3.15 cho thấy, tỉ lệ thu hồi cao chiết nhìn chung phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý enzyme cao so với phương pháp lại cho loại rong So với nghiên cứu cơng bố tỉ lệ thu hồi cao chiết phương pháp chọn nhìn chung cao so với báo cáo[35] (tỉ lệ thu hồi 5,5% chiết hỗn hợp dung môi MeOH/Chloroform) báo cáo [45] (tỉ lệ thu hồi khoảng 2% chiết hỗn hợp dung môi MeOH/Chloroform) Xét điều kiện thực khả ứng dụng với quy mô chiết cơng nghiệp phương pháp (phương pháp Soxhlet phương pháp sử dụng sóng siêu âm) hạn chế khó cơng nghiệp hố so với phương pháp lại (phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý enzyme phương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn) 51 Ở phương pháp ngâm lắc kết hợp xử lý enzyme tỉ lệ thu hồi cao chiết cao quy trình xử lý enzyme chiết lipid phức tạp xử lý enzyme phải thực môi trường nước môi trường dung dịch đệm có pH tương ứng với pH tối thích enzyme, cịn q trình chiết lipid phải chiết dung mơi phân cực hơn, từ việc xử lý nguyên liệu với enzyme đến việc xử lý thu hồi cao chiết phức tạp dễ dẫn đến sai số lớn Ngoài ra, giá thành cao chiết thu hồi cao giá enzyme đắt (khoảng 3.000.000 VNĐ/kg Viscozyme L) Ởphương pháp chiết sử dụng CO2 siêu tới hạn có nhiều ưu so với phương pháp truyền thống như: - Do tốc độ truyền khối nhanh nên thời gian trích ly ngắn - Tính chọn lọc cao nên dịch trích tạp chất, tiết kiệm chi phí thời gian cho trình tinh - Do CO2 loại dung mơi có tính trơ mặt hóa học nên phản ứng phụ xảy ra, từ dịch trích tạp chất - Chí phí lượng thấp hơn, tiết kiệm thời gian có khả tự động hóa cao, điều khiển tự động quy mơ cơng nghiệp - Sản phẩm có chất lượng cao, đặc biệt tinh dầu có màu, mùi tự nhiên, khơng lẫn nhiều thành phần khơng mong muốn, với hợp chất tự nhiên tách chất có hoạt tính cao - Khơng cịn lượng dung mơi dư - Tách hoạt chất với hàm lượng cao - Không gây ô nhiễm môi trường Từ cho thấy chất chiết thu nhận có độ tinh khiết cao, đồng thời chất chiết dạng cao nên bám dính vào bình phân tích hệ thống thiết bị chiết dẫn đến thất thoát thu sản phẩm, lý dẫn đến tỉ lệ thu hồi cao chiết thấp nhiều so với phương pháp lại Các khảo sát với phương pháp hạn chế (chỉ thực khảo sát/1 loại rong) chi phí thuê mướn thiết bị cao mà nguồn kinh 52 phí từ đề tài chưa thể đáp ứng được, đó, có thêm điều kiện chúng tơi tiếp tục thực thí nghiệm phương pháp Việc lựa chọn phương pháp chiết không dựa vào tỉ lệ hàm lượng cao chiết thu mà định chất lượng cao chiết thu được, nghiên cứu chất lượng cao chiết đánh giá dựa vào khả bắt gốc tự DPPH, kết trình bày mục 3.6 3.6 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT GỐC TỰ DO DPPH CỦA CAO CHIẾT Thí nghiệm tiến hành theo mục 2.3.5 Phụ lục 1.1.5., số liệu xử lý theo mục 2.2.4 trình bày Phụ lục 1.2.5., kết thu trình bày Bảng 3.14 Bảng 3.14 Khả bắt gốc tự DPPH cao chiết thu từ phương pháp Phương pháp Soxhlet Chiết Ngâm lắc kết Chiết sóng siêu âm hợp xử lý CO2 siêu tới Viscozyme L hạn Tỉ lệ thu S.f 6,774±0,060 7,095±0,055 7,192±0,213 3,649±0,131 hồi cao S.p 6,575±0,413 8,373±0,122 8,020±0,186 - chiết (%) I mẫu thử S.f 50,373±0,753a 58,478±0,447b,c 57,184±0,437b 59,385±1,102c S.p 52,416±1,209A 58,184±1,354B 58,226±0,566B - Tỉ lệ % (I S.f 54,301 63,037 61,642 64,016 mẫu thử/I S.p 56,503 62,720 62,766 - (%) đối chiếu) a, b, c; A, B : thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với P