Khảo sát ảnh hưởng của nitơ đến sự sinh trưởng và tích lũy astaxanthin ở vi tảo haematococcus pluvialis ở điều kiện bình nuôi

BAN QUẢN LÝ KHU NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHIỆP CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NITƠ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ TÍCH LŨY ASTAXANTHIN Ở VI TẢO Haematococcus pluvialis Ở ĐIỀU KIỆN BÌNH NI CHỦ NHIỆM NDNC CƠ QUAN QUẢN LÝ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2015 CƠ QUAN CHỦ TRÌ TĨM TẮT ĐỀ TÀI Đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng nitơ đến sinh trƣởng tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện bình ni” đƣợc thực từ tháng 01/2015 đến tháng 12/2015, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Mục đích nghiên cứu xác định nguồn nitơ hàm lƣợng nitơ thích hợp cho sinh trƣởng, sau xác định ảnh hƣởng thiếu hụt nitơ lên tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Đề tài gồm nội dung chính: nội dung – Nhân sinh khối H pluvialis quy mô bình ni, nội dung – Khảo sát nguồn nitơ hàm lƣợng nitơ thích hợp cho sinh trƣởng tảo H pluvialis, nội dung – Khảo sát ảnh hƣởng thiếu hụt nitơ lên tích lũy astaxanthin H pluvialis Chúng đạt đƣợc kết nhƣ sau: 1) Tìm đƣợc nguồn nitơ NaNO3 với nồng độ 1,2 g/L thích hợp cho sinh trƣởng tảo H pluvialis 2) Trong điều kiện thí nghiệm, mơi trƣờng RM có nồng độ NaNO3 60 mg/L 120 mg/L có hiệu việc kích thích tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis i ABSTRACT The study "Study on the influence of nitrogen in the growth and accumulation of astaxanthin of Haematococcus pluvialis on culture condition" was conducted from July 01/2015 to 12/2015, at the Centre for Research and Development of High Technology Agriculture The purpose of this study is determining the suitable nitrogen source and nitrogen concentration for the growth, then determining the effects of nitrogen deficiency on the accumulation astaxanthin of H pluvialis This study includes three main components: content – Grow H pluvialis in culture condition scale, content – Survey the suitable nitrogen source and nitrogen concentration for the growth of H pluvialis, content – Survey the effects of nitrogen deficiency on the astaxanthin accumulation of H pluvialis The results of the study: 1) NaNO3 at 1,2 g/L is the most appropriate for the growth of H pluvialis 2) In the experimental conditions, the RM medium added NaNO3 60 mg/L and 120 mg/L was the most effective for stimulating the astaxanthin accumulation of H pluvialis ii MỤC LỤC Trang i TÓM TẮT ĐỀ TÀI MỤC LỤC iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC HÌNH vi PHẦN MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan tảo 1.1.1 Khái niệm tảo vi tảo 1.1.2 Vài nét đặc điểm sinh học tảo 1.1.3 Phân loại 1.1.4 Giá trị dinh dƣỡng ứng dụng chủ yếu vi tảo 1.2 Tổng quan Haematococcus pluvialis 1.2.1 Vị trí phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái thay đổi thành phần nội bào vòng đời 1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới sinh trƣởng H pluvialis 1.3 Tổng quan astaxanthin 1.3.1 Nguồn cung cấp astaxanthin 1.3.2 Ảnh hƣởng tới tích luỹ astaxanthin H pluvialis 1.4 Tình hình nghiên cứu astaxanthin từ H pluvialis 10 CHƢƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Vật liệu nghiên cứu 13 2.3.1 Chủng tảo giống 13 2.3.3 Hóa chất thí nghiệm 13 2.4 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm 14 2.4.1 Nhân sinh khối H pluvialis qui mơ bình ni 15 iii 2.4.2 Khảo sát nguồn nitơ hàm lƣợng nitơ thích hợp cho sinh trƣởng tảo H pluvialis 16 2.4.3 Khảo sát ảnh hƣởng thiếu hụt nitơ lên tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis 16 2.5 Chỉ tiêu theo dõi 17 2.6 Phƣơng pháp xử lý số liệu 18 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 3.1 Nhân sinh khối H pluvialis quy mơ bình ni 19 3.2 Khảo sát nguồn nitơ hàm lƣợng nitơ thích hợp cho sinh trƣởng tảo H pluvialis 22 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng thiếu hụt nitơ lên tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis 26 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 4.1 Kết luận 34 4.2 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 39 iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Thuật ngữ tiếng viết cs Cộng ĐC Đối chứng H pluvialis Haematococcus pluvialis NT Nghiệm thức TB Tế bào TN Thí nghiệm v DANH MỤC HÌNH Số Tên hình ảnh Trang 1.1 Hình dạng tế bào tảo H pluvialis 1.2 Sự thay đổi hình thái vịng đời H pluvialis 1.3 Cấu trúc phân tử astaxanthin 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 15 3.1 Bình ni tảo quy mơ 250 mL(A) 500 mL (B) sau 12 ngày ni 19 3.2 Bình nuôi tảo quy mô 1,5 L sau ngày nuôi 19 3.3 Sự thay đổi mật độ tế bào tảo H pluvialis 20 3.4 Sự thay đổi trọng lƣợng khô tảo H pluvialis 21 3.5 Sự thay đổi hàm lƣợng sắc tố cholorophyll a tảo H pluvialis 21 3.6 Sự thay đổi hàm lƣợng sắc tố astaxanthin tảo H pluvialis 22 3.7 Sự thay đổi mật độ tế bào tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác 3.8 Sự thay đổi trọng lƣợng khô tảo H pluvialis đƣợc ni cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác 3.9 23 24 Sự thay đổi hàm lƣợng chlorophyll a tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác 25 3.10 Sự thay đổi hàm lƣợng astaxanthin tảo H pluvialis đƣợc ni cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác 25 3.11 Sự thay đổi mật độ tế bào tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ 27 3.12 Sự thay đổi trọng lƣợng khô tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ 28 3.13 Sự thay đổi hàm lƣợng cholorophyll a tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ 29 3.14 Sự thay đổi hàm lƣợng astaxanthin tảo H pluvialis đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ vi 30 3.15 Hình thái tế bào tảo H pluvialis mơi trƣờng thiếu hụt nitơ dƣới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần 3.16 Bình nuôi tảo NT5 NT2 ngày thứ 11 vii 31 32 PHẦN MỞ ĐẦU Astaxanthin dẫn xuất β-carotene, có giá trị kinh tế cao, đƣợc sử dụng phổ biến nuôi trồng thủy sản cơng nghiệp thực phẩm, thực phẩm chức Hoạt tính chống oxy hóa astaxanthin cao gấp 10 lần so với loại carotenoid khác nhƣ β-carotene, zeaxanthin, lutein, canthaxanthin cao gấp 500 lần so với α-tocopherol Bên cạnh đó, khả ngăn chặn số loại ung thƣ, kích thích hệ thống miễn dịch cao so với β-carotene α-tocopherol nên nay, ứng dụng astaxanthin đƣợc mở rộng lĩnh vực y dƣợc học Astaxanthin đƣợc phát nhiều chủng vi tảo thuộc giống Haematococcus Haematococcus phân bố phổ biến tự nhiên, khơng địi hỏi mơi trƣờng dinh dƣỡng cao, dễ dàng nuôi cấy, gặp điều kiện bất lợi, dễ dàng chuyển sang dạng bào tử nang để chống chọi với điều kiện khắc nghiệt, giai đoạn tổng hợp nhiều astaxanthin Sự tích lũy astaxanthin đƣợc cảm ứng điều kiện nhƣ thiếu hụt nitơ, photpho, dƣ thừa acetate, cƣờng độ ánh sáng cao bổ sung tiền chất carotenoid khác Trong đó, việc ni cấy H pluvialis để đạt mật độ cao đƣợc thực cách tối ƣu môi trƣờng điều kiện ni cấy Chính việc thực đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng nitơ đến sinh trƣởng tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện bình ni” điều cần thiết việc tìm điều kiện để ni trồng vi tảo có hàm lƣợng astaxanthin cao THÔNG TIN ĐỀ TÀI Tên đề tài/dự án: Khảo sát ảnh hƣởng nitơ đến sinh trƣởng tích lũy astaxanthin vi tảo Haematococcus pluvialis điều kiện bình ni Chủ nhiệm đề tài/dự án: CN Lê Thái Na CN Nguyễn Thùy Trang Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Nông nghiệp Công nghệ cao Tp Hồ Chí Minh Thời gian thực hiện: 1/2015 đến 12/2015 Kinh phí đƣợc duyệt: 146.641.000 đồng Mục tiêu Xác định nguồn nitơ hàm lƣợng nitơ thích hợp cho sinh trƣởng tảo Xác định ảnh hƣởng thiếu hụt nitơ lên tích lũy astaxanthin tảo Sản phẩm đề tài /dự án: Báo cáo khoa học Quy trình nhân ni yếu tố dinh dƣỡng nitơ ảnh hƣởng tới sinh trƣởng tích lũy astaxanthin tảo H pluvialis Phụ ục Kết theo dõi mật độ tảo H pluvialis (x 104 TB/mL) đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác Ngày 10 12 14 16 18 300 mg/L 13 19 25.33 28 29.3 32 31.3 29.3 600 mg/L 11.33 16.3 31.3 33.3 39 42.3 44 41.33 38 1200 mg/L 12.6 17 35.3 38 43 48 52.3 49.3 45 1800 mg/L 10 14 22 27 33 37 39 36 32 Phụ ục Kết theo dõi trọng lƣợng khô tảo H pluvialis (x 104 TB/mL) đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác Ngày 10 12 14 16 18 300 mg/L 0.18 0.53 0.57 0.64 0.91 1.34 1.55 1.83 1.92 1.85 600 mg/L 0.18 0.72 0.74 0.96 1.06 1.53 1.83 2.13 2.24 2.27 1200 mg/L 0.18 0.76 0.78 1.08 1.25 1.75 2.08 2.52 2.63 2.61 42 1800 mg/L 0.18 0.63 0.65 0.73 1.02 1.4 1.6 1.95 1.98 2.02 Phụ ục Kết theo dõi hàm lƣợng chlorophyll a tảo H pluvialis (x 104 TB/mL) đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác Ngày 10 12 14 16 18 300 mg/L 40 96 243 390 486 598 702 756 697 631 600 mg/L 40 243 305 465 552 705 904 921 827 771 1200 mg/L 40 251 334 504 629 775 1024 1095 988 912 1800 mg/L 40 146 253 402 501 612 732 786 772 713 Phụ ục Kết theo dõi hàm lƣợng astaxanthin tảo H pluvialis (x 104 TB/mL) đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng có nồng độ NaNO3 khác Ngày 10 12 14 16 18 300 mg/L 11 53 101 154 242 323 385 406 454 498 600 mg/L 11 44 95 165 285 385 465 547 612 645 43 1200 mg/L 11 44 92 193 335 481 552 629 675 711 1800 mg/L 11 58 85 134 245 359 409 438 487 521 Phục ục 10 Kết theo dõi mật độ tảo H pluvialis (x 104 TB/mL) đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ Ngày 10 11 mg/L 7 7 8 10 12 11 10 60 mg/L 10 12 13 16 18 21 23 28 32 28 22 120 mg/L 11 13 14 19 25 29 31 34 37 37 33 180 mg/L 13 15 17 22 30 32 34 36 39 40 240 mg/L 14 17 19 22 27 29 34 37 41 41 300 mg/L 13 14 18 23 25 27 33 42 43 43 Phụ ục 11 Kết theo dõi trọng lƣợng khô tảo H pluvialis (g/L) đƣợc nuôi cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ Ngày 10 11 mg/L 1,09 1,13 1,14 1,37 1,44 1,82 1,93 2,22 2,32 2,47 2,67 2,84 60 mg/L 1,09 1,42 1,31 1,93 2,29 2,81 3,04 3,41 3,79 4,03 4,54 4,59 120 mg/L 1,09 1,42 1,49 1,98 2,55 3,32 3,69 4,06 4,1 4,49 5,17 5,59 44 180 mg/L 1,09 1,13 1,39 1,67 2,08 2,93 3,21 3,38 3,83 3,96 4,15 4,34 240 mg/L 1,09 1,28 1,3 1,89 2,35 3,17 3,45 4,03 4,17 4,54 5,1 5,41 300 mg/L 1,09 1,39 1,36 1,54 1,89 2,35 2,62 3,17 3,45 3,74 3,88 3,95 Phụ ục 12 Kết theo dõi hàm lƣợng cholorophyll a tảo H pluvialis (µg/L) đƣợc ni cấy mơi trƣờng thiếu hụt nitơ Ngày 10 11 mg/L 220 238 316 441 505 512 544 521 492 60 mg/L 220 260 530 756 906 976 1059 1087 1061 120 mg/L 220 279 693 1092 1409 1746 1825 1912 1845 180 mg/L 220 230 634 1028 1362 1564 1678 1620 1401 240 mg/L 220 196 574 1074 1511 1872 1923 1980 1931 300 mg/L 220 196 473 989 1357 1520 1678 1786 1795 Phụ ục 13 Kết theo dõi hàm lƣợng astaxanthin tảo H pluvialis (µg/L) đƣợc ni cấy môi trƣờng thiếu hụt nitơ Ngày 10 11 mg/L 84 126 359 691 827 905 1102 1107 1258 60 mg/L 84 100 316 773 1021 1203 1528 1811 1842 120 mg/L 84 106 269 730 969 1342 1531 1721 1981 180 mg/L 84 89 228 451 630 860 951 1074 1059 240 mg/L 84 86 209 451 641 870 973 1082 1185 300 mg/L 84 98 170 322 464 470 564 667 695 Phụ ục 14: Xử ý số iệu MATDO NOI DUNG1 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values quymo 1,5L 250mL 500mL Number of Observations Read Number of Observations Used Dependent Variable: matdo Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Model 2.66666667 1.33333333 6.00 Error 1.33333333 0.22222222 Corrected Total 4.00000000 R-Square Coeff Var Root MSE matdo1 Mean 0.666667 7.856742 0.471405 6.000000 Source DF Anova SS Mean Square F Value quymo 2.66666667 1.33333333 6.00 Dependent Variable: mat 14 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value 45 Pr > F 0.0370 Pr > F 0.0370 Pr > F Model Error Corrected Total R-Square 0.995929 Source quymo Dependent Variable: mat 18 1304.666667 652.333333 733.88 5.333333 0.888889 1310.000000 Coeff Var Root MSE matdo2 Mean 4.489567 0.942809 21.00000 DF Anova SS Mean Square F Value 1304.666667 652.333333 733.88 F F 1008.222222 504.111111 1134.25 F quymo 1008.222222 504.111111 1134.25 F 0.0002 Pr > F 0.0002 Pr > F F F 3.12540000 1.56270000 3606.23 F quymo 3.12540000 1.56270000 3606.23 F F F F quymo 643799.7800 321899.8900 59427.7 F Model 350358.0000 175179.0000 1094869 F quymo 350358.0000 175179.0000 1094869 F 0.4445 Pr > F 0.4445 Pr > F F quymo 112971.1289 56485.5644 13021.8 F Model 239711.0400 119855.5200 299639 F quymo 239711.0400 119855.5200 299639 F Pr > F Pr > F F NT Dependent Variable: matdo ngày 18 659.0000000 219.6666667 164.75 F 436.2500000 145.4166667 109.06 F NT 436.2500000 145.4166667 109.06 F Pr > F Pr > F F F 0.98182500 0.32727500 569.17 F NT 0.98182500 0.32727500 569.17 F Pr > F Pr > F F 215334.2500 71778.0833 7118.49 F Model 126098.2500 42032.7500 11208.7 F NT 126098.2500 42032.7500 11208.7 F Pr > F Pr > F F NT 94290.00000 31430.00000 4190.67 F Model 92504.25000 30834.75000 4568.11 F NT 92504.25000 30834.75000 4568.11 F Pr > F Pr > F F 2816.500000 563.300000 177.88 F Model 0 Error 12 0 Corrected Total 17 R-Square Coeff Var Root MSE TLK1 Mean 0.000000 0 1.090000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0 Dependent Variable: TLK ngày 11 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 15.28480000 3.05696000 3902.50 F NT 15.28480000 3.05696000 3902.50 F Model 0 Error 12 0 Corrected Total 17 R-Square Coeff Var Root MSE hamluong1 Mean 0.000000 0 220.0000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0 Dependent Variable: hamluong ngày11 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 4718378.500 943675.700 141551 F NT 4718378.500 943675.700 141551 F Model 0 Error 12 0 Corrected Total 17 R-Square Coeff Var Root MSE hamluong1 Mean 0.000000 0 84.00000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F NT 0 The ANOVA Procedure Dependent Variable: hamluong ngày 11 Sum of Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3565660.000 713132.000 60264.7 F NT 3565660.000 713132.000 60264.7