Tác động của fibrin giàu tiểu cầu kết hợp xương dị loại lên tế bào dây chằng nha chu người ứng dụng trong điều trị viêm nha chu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN MẸO TÁC ĐỘNG CỦA FIBRIN GIÀU TIỂU CẦU KẾT HỢP XƯƠNG DỊ LOẠI LÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VIÊM NHA CHU LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, Năm 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN MẸO TÁC ĐỘNG CỦA FIBRIN GIÀU TIỂU CẦU KẾT HỢP XƯƠNG DỊ LOẠI LÊN TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU NGƯỜI ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ VIÊM NHA CHU NGÀNH: RĂNG HÀM MẶT MÃ SỐ: 9720501 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ THỊ QUỲNH LAN PGS.TS NGUYỄN THU THỦY THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, Năm 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả Nguyễn Mẹo MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục chữ viết tắt thuật ngữ Anh – Việt Danh mục bảng Danh mục hình Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tế bào gốc dây chằng nha chu 1.2 Fibrin giàu tiểu cầu 1.2.1 Lịch sử phát triển Fibrin giàu tiểu cầu (PRF) 1.2.2 Những tiến quy trình tạo fibrin giàu tiểu cầu 1.3 Ảnh hưởng PRF lên đặc tính sinh học tế bào dây chằng nha chu 1.3.1 Ảnh hưởng PRF lên đặc tính sinh học tế bào dây chằng nha chu 1.3.2 Ảnh hưởng PRF kết hợp vật liệu ghép thay xương lên đặc tính sinh học tế bào dây chằng nha chu 11 1.4 Hiệu lâm sàng fibrin giàu tiểu cầu điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc 13 1.4.2 Hiệu lâm sàng PRF điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc (IBD) 17 1.4.3 Hiệu lâm sàng PRF kết hợp vật liệu ghép thay xương điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc 19 1.5 Biểu dấu ấn sinh học dịch khe nướu sử dụng PRF điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc 22 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nghiên cứu in vitro hình thái hóa sinh A-PRF kết hợp vật liệu thay xương dị loại 27 2.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.1.2 Dòng tế bào dụng cụ, thiết bị, hóa chất nghiên cứu 27 2.1.3 Tiến trình thực nghiên cứu 29 2.1.4 Tổ chức nhóm nghiên cứu kiểm sốt sai lệch thơng tin 37 2.1.5 Phương pháp phân tích số liệu 38 2.1.6 Đạo đức nghiên cứu 39 2.2 Nghiên cứu ứng dụng lâm sàng có nhóm chứng 40 2.2.1 Thời gian địa điểm tiến hành nghiên cứu 40 2.2.2 Mẫu nghiên cứu 40 2.2.3 Phương tiện nghiên cứu 42 2.2.4 Quy trình nghiên cứu 44 2.2.5 Mô tả biến số nghiên cứu 48 2.2.6 Tổ chức nhóm nghiên cứu kiểm sốt sai lệch thông tin 54 2.2.7 Phương pháp phân tích số liệu 56 2.2.8 Đạo đức nghiên cứu 57 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.1 Định lượng yếu tố tăng trưởng PDGF-AB VEGF phóng thích từ hỗn hợp dịch chiết A-PRF-XBSM 58 3.1.1 Sự phóng thích yếu tố tăng trưởng PDGF-AB thời điểm thực nghiệm tích luỹ theo thời gian 58 3.1.2 Sự phóng thích yếu tố tăng trưởng VEGF thời điểm thực nghiệm tích luỹ theo thời gian 62 3.2 Tính an tồn tác động hỗn hợp A-PRF-XBSM hPDLSCs 67 3.2.1 Ảnh hưởng A-PRF kết hợp XBSM lên khả sống hPDLSCs 67 3.2.2 Tác động A-PRF-XBSM lên tăng sinh hPDLSCs 69 3.3 Hiệu lâm sàng X quang A-PRF kết hợp vật liệu thay xương dị loại 74 3.3.1 Tình trạng nha chu lúc ban đầu (T0) lâm sàng phim X quang 74 3.3.2 So sánh thay đổi số mảng bám (PlI) sau tháng 75 3.3.3 So sánh thay đổi số nướu (GI) sau tháng 76 3.3.4 So sánh thay đổi vị trị bờ nướu (sự tụt nướu - GR) sau tháng 77 3.3.5 So sánh thay đổi độ sâu túi nha chu (PD) sau tháng 78 3.3.6 So sánh thay đổi bám dính lâm sàng (CAL) sau tháng 79 3.3.7 So sánh tiêu mào xương ổ (ACR) X quang lúc ban đầu tháng 80 3.3.8 So sánh lấp khiếm khuyết (DF) X quang sau tháng 80 3.4 Mức độ diện yếu tố tăng trưởng PDGF-BB, VEGF TGF-β1 dịch khe nướu (GCF) 82 3.4.1 Biểu PDGF-BB dịch khe nướu 82 3.4.2 Biểu VEGF dịch khe nướu 83 3.4.3 Biểu TGF-β1 dịch khe nướu 85 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 88 4.1 Hiệu phóng thích yếu tố tăng trưởng PDGF-AB VEGF dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM 88 4.2 Tính an toàn tác động hỗn hợp A-PRF-XBSM hPDLSCs 91 4.2.1 Chọn nguồn tế bào thực thí nghiệm 91 4.2.2 Ảnh hưởng A-PRF kết hợp XBSM lên khả sống hPDLSCs 92 4.2.3 Tác động A-PRF-XBSM lên tăng sinh hPDLSCs 94 4.2.4 Tác động A-PRF-XBSM lên di cư hPDLSCs 96 4.3 Hiệu lâm sàng sử dụng A-PRF kết hợp vật liệu thay xương dị loại điều trị viêm nha chu có tiêu xương theo chiều dọc 99 4.3.1 Bàn luận đối tượng, phương pháp nghiên cứu 99 4.3.2 Hiệu lâm sàng A-PRF-XBSM thông qua đánh giá số nha chu 104 4.3.3 Thay đổi biến số ACR DF X quang sau tháng 113 4.4 Mức độ diện yếu tố tăng trưởng PDGF-BB, VEGF TGF-β1 dịch khe nướu (GCF) 118 4.4.1 Bàn luận phương pháp nghiên cứu 118 4.4.2 Đánh giá diện yếu tố tăng trưởng PDGF-BB, VEGF TGF-β1 dịch khe nướu 119 4.5 Ứng dụng đề tài, điểm điểm hạn chế 124 4.5.1 Ý nghĩa ứng dụng đề tài 124 4.5.2 Những điểm mạnh điểm nghiên cứu 125 4.5.3 Hạn chế đề tài 126 KẾT LUẬN 127 KIẾN NGHỊ 129 CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ ANH VIỆT Viết tắt tiếng Việt BN Bệnh nhân CTV Cộng tác viên DCNC Dây chằng nha chu MNC Mô nha chu VNC Viêm nha chu Viết tắt tiếng Anh Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt ACR Alveolar crest resorption Tiêu mào xương ổ ALP Alkaline phosphatase A-PRF Advanced platelet rich fibrin Fibrin giàu tiểu cầu cải tiến bFGF Basic fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi BMP Bone morphological protein Protein tạo dạng xương CAL Clinical attachment loss Mất bám dính lâm sàng CBCT Cone-beam computed Kỹ thuật chụp cắt lớp với chùm tomography tia hình nón CEJ Cementoenamel junction Đường nối men - xê măng DF Defect fill Lấp khiếm khuyết (lấp xương) DFDBA Demineralized freeze dried Xương đồng loại đông khô khử bone allograft khống Dulbecco’s modified minimum Mơi trường cần thiết tối thiểu cải essential medium tiến Dulbecco DMEM/F12 EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bò FGF Fibroblast growth factor Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi GCF Gingival crevicular fluid Dịch khe nướu (lợi) GFs Growth factors Yếu tố tăng trưởng Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt GI Gingival index Chỉ số nướu (lợi) GR Gingival recession Tụt nướu (lợi) GML Gingival margin level Mức bờ nướu GTR Guided tissue regeneration Tái tạo mơ có hướng dẫn HA Hydroxyapatite hPDLCs Human periodontal ligament cells Tế bào dây chằng nha chu người hPDLF Human periodontal ligament Nguyên bào sợi dây chằng nha chu fibroblast người hPDLSCs Human periodontal ligament stem Tế bào gốc dây chằng nha chu người cells IBD Intrabony defect Khiếm khuyết xương IGF Insulin-like growth factor Yếu tố tăng trưởng dạng Insulin i-PRF Injectable platelet rich fibrin Fibrin giàu tiểu cầu dạng lỏng OCN Osteocalcin OD Optical density Mật độ quang OFD Open flap debridement Lật vạt làm OPN Ostepontin PD Probing depth Độ sâu túi thăm dò (độ sâu túi) PDGF Platelet derived growth factor Yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu PRF Platelet rich fibrin Fibrin giàu tiểu cầu PRP Platelet rich plasma Huyết tương giàu tiểu cầu RUNX2 Runt-related transcription factor2 TGF-β Transforming growth factor β Yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β TNF-α Tumor necrosis factor-α Yếu tố hoại tử u nhóm alpha VEGF Vascular endothelial growth Yếu tố tăng trưởng nội mạc mạch máu factor XBSM Xenograft bone substitute material Vật liệu thay xương dị loại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại viêm nha chu theo AAP 2017 15 Bảng 1.2 Tóm tắt nghiên cứu biểu dấu ấn sinh học GCF sử dụng PRF điều trị VNC có IBD 24 Bảng 2.1 Mức độ gây độc tế bào theo ISO10993-5:2009 33 Bảng 2.2 Danh sách biến số nghiên cứu nghiên cứu in vitro 37 Bảng 2.3 Tiêu chuẩn số mảng bám theo Silness Loe (1964) 49 Bảng 2.4 Tiêu chuẩn số nướu theo Silness Loe (1964) 49 Bảng 2.5 Danh sách biến số nghiên cứu nghiên cứu lâm sàng 53 Bảng 3.1 Định lượng yếu tố tăng trưởng PDGF-AB dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM thời điểm 58 Bảng 3.2 So sánh phóng thích PDGF-AB dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM thời điểm 59 Bảng 3.3 Định lượng yếu tố tăng trưởng PDGF-AB dịch chiết hỗn hợp APRF-XBSM tích luỹ theo thời gian 61 Bảng 3.4 Định lượng yếu tố tăng trưởng VEGF dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM thời điểm 62 Bảng 3.5 So sánh phóng thích VEGF dịch chiết hỗn hợp A-PRF-XBSM thời điểm 63 Bảng 3.6 Định lượng yếu tố tăng trưởng VEGF dịch chiết hỗn hợp APRF-XBSM tích luỹ theo thời gian 65 Bảng 3.7 Phần trăm tỷ lệ tăng trưởng tương đối (RGR) nghiệm thức 69 Bảng 3.8 Số lượng hPDLSCs nhóm thời điểm 70 Bảng 3.9 So sánh mức độ tăng sinh hPDLSCs thí nghiệm tăng sinh tế bào nhóm thời điểm 71 Bảng 3.10 Phần trăm diện tích vùng vơ bào nhóm lúc 24 73 Bảng 3.11 Tình trạng nha chu lúc ban đầu lâm sàng X quang 74 Bảng 3.12 So sánh thay đổi số PlI lúc ban đầu, sau tháng 75 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 14 DANH SÁCH BỆNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 15 PHIẾU CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 16 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG THÍ NGHIỆM ELISA ĐỊNH LƯỢNG CÁC GFs TRONG DỊCH KHE NƯỚU Kết ELISA PDGF mẫu dịch khe nướu đĩa thứ Kết ELISA VEGF mẫu dịch khe nướu đĩa thứ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Kết ELISA TGF-β1 mẫu dịch khe nướu đĩa thứ Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 17 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG VÀ X QUANG Bệnh nhân Lê Lương V Mã hồ sơ: 0636/2020 Hình ảnh lâm sàng X quang trước điều trị (T0) Hình ảnh lâm sàng X quang sau tháng điều trị (T6) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 18 MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN THÍ NGHIỆM Quy trình thu thập máu, ly tâm, thu nhận khối màng A-PRF Thao tác tủ an toàn sinh học cấp - Thu thập dịch chiết A-PRF-XBSM Sử dụng máy ly tâm để phân tách tế bào - Đếm tế bào kính hiển vi Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 19 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH DI CƯ BẰNG PHẦN MỀM IMAGE-J File > Open > JPEG Image > Type > 16-bit Process > Enhance Contrast > Chọn 0,4% Process > Subtract Bacground > Đánh dấu vào dòng Light background, create background (don’t subject) Process > Find Edges Process > Sharpen Image > Adjust > Threshold: chọn Black/White; kéo phía (bên trái) Tuỳ chỉnh phía để thấy rõ vùng giới hạn tế bào Process > Find Edges Image > Look Tables > Invert LUT 10 Analyze Particles Size: thường từ 100000 đến 50000000, tuỳ kích cỡ hình Nếu hình nhỏ chọn 1000-10000 Circularity: chọn 0.00-1.00 Show: chọn Outlines Flag: chọn Summarize 11 Kết thu thể phần trăm diện tích vùng vơ bào Hình ảnh cần chụp điều kiện thông số Nếu hình ảnh chất lượng tốt bỏ qua bước 3,4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Chú thích: A, B Hình ảnh đường rạch ghi nhận mảy ảnh C, D Hình ảnh đường rạch sau phân tích phần mềm Image-J E, F Dữ liệu thu nhận (Nguồn: nhóm A-PRF-XBSM 100% thí nghiệm đánh giá di cư tế bào từ nghiên cứu này) Tham khảo quy trình Straatman K (2008) Wound Healing Assay University of Leicester, College of Medicine, Biological Sciences and Psychology, Advanced Imaging Facilities Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 20 HÌNH ẢNH TRONG THU THẬP DỮ LIỆU TRONG NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Phẫu thuật điều trị BN Khoa RHM Cộng tác viên đo thông số nha chu lâm sàng Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PHỤ LỤC 21 ĐỊNH CHUẨN ĐÁNH GIÁ ĐỘ KIÊN ĐỊNH (ĐO CÁC THÔNG SỐ TRÊN LÂM SÀNG VÀ X QUANG) Tập huấn khám mô nha chu TS.BS Đỗ Thu Hằng, cán giảng môn Nha Chu khám đánh giá tất số lâm sàng bệnh nhân mẫu để định chuẩn trước đánh giá độ kiên định Đánh giá độ kiên định thông số lâm sàng Khám đánh giá thông số nha chu lâm sàng cán giảng môn nha chu thực Người khám bệnh nhân thực loại vật liệu ghép Đánh giá độ kiên định cách khám cho 10 BN điều trị nha chu giai đoạn buổi, so sánh kết lần khám (cách 20 phút) Số vị trí khám giống lần khám Bệnh Số nhân khám PlI GI PPD CAL 8 2 2 2 2 7 1 2 7 2 8 10 2 Tổng cộng 12 70 71 10 11 Tỉ lệ phần trăm trí = +ố /ườ23 4ợ6 24ấ ./í 9:;2