Tiêu chuẩn hóa dược liệu từ cây đương quy nhật bản ( angelica acutiloba ) trồng ở việt nam

32 UPLC MS am S43., (2009) Zhou SS41., (2018) 30 ion chất chuyển hóa thứ cấp Phân biệt A sinensis với A acutiloba từ Nhật, Trung Quốc Đài Loan Định lượng Z-ligustilid Phân biệt A sinensis số loài hoa tán Lu GH23., (2004) TOF Dịch chiết MeOH 70% UPLC-TQMS/MS UPLCQTOF-MS/ MS Dịch chiết MeOH HPLC MS 1.5 Tiêu chuẩn hóa dược liệu, chất chuẩn hóa học dược liệu đối chiếu 1.5.1 Tiêu chuẩn hóa dược liệu Tiêu chuẩn hóa dược liệu trình quy định tập hợp tiêu chuẩn đặc tính vốn có, thơng số khơng đổi, giá trị định tính định lượng cuối nhằm bảo đảm chất lượng, hiệu quả, an toàn khả lặp lại Đây trình xây dựng thống tiêu chuẩn kỹ thuật Các tiêu chuẩn cụ thể đưa thử nghiệm quan sát, điều dẫn đến q trình thiết lập tập hợp đặc tính thể dược liệu Do đó, tiêu chuẩn hóa cơng cụ q trình kiểm sốt chất lượng dược liệu Chất lượng dược liệu bị ảnh hưởng nhiều yếu tố: Sự biến đổi loài loài: Sự biến đổi thành phần liên quan đến di truyền xuất xứ Yếu tố môi trường: Chất lượng dược liệu bị ảnh hưởng khí hậu, độ cao điều kiện trồng trọt Thời gian thu hoạch: Nồng độ thành phần thay đổi chu kỳ phát triển chí ngày 33 Bộ phận sử dụng: Thành phần hoạt chất khác phận Ngoài ra, nguyên liệu chiết xuất hoạt chất trước sử dụng làm chất pha trộn để tăng trọng lượng Các yếu tố sau thu hoạch: Điều kiện bảo quản xử lý chế biến ảnh hưởng lớn đến chất lượng thành phần thảo dược Việc bảo quản khơng thích hợp sau thu hoạch dẫn đến nhiễm vi sinh vật, q trình sấy khơ phân hủy thành phần hoạt tính bị ảnh hưởng nhiệt.102 Dựa theo tài liệu WHO, Kunle 102 xác định việc tiêu chuẩn hóa kiểm tra chất lượng dược liệu q trình đánh giá khía cạnh dược liệu, chẳng hạn lựa chọn xử lý ngun liệu thơ, đánh giá an tồn, hiệu độ ổn định Thường ý đến số chất lượng như: Mơ tả bên ngồi soi kính hiển vi: để xác định lồi xác định tạp chất giả mạo Tạp chất hữu cơ: loại bỏ tạp chất thực vật khác dược liệu để thu thuốc dạng tinh khiết Tro: tiêu chí để đánh giá đặc tính độ tinh khiết dược liệu Các tiêu thơng dụng tro tồn phần, tro sunfat, tro không tan acid Độ ẩm: kiểm tra độ ẩm giúp giảm sai số việc ước tính khối lượng thực tế nguyên liệu làm thuốc Độ ẩm thấp cho thấy ổn định tốt Chất chiết từ dược liệu: trọng lượng thị thành phần hóa học chiết xuất từ dung môi khác Xơ thô: điều giúp xác định thành phần nguyên liệu gỗ, tiêu chí để đánh giá độ tinh khiết Định tính: bao gồm định tính xác định đặc tính dược liệu liên quan đến thành phần hóa học Kiểm tra sắc ký: bao gồm định tính dược liệu dựa việc sử dụng thành phần hóa học làm chất đánh dấu Định lượng: xác định hàm lượng thành phần 34 10 Nghiên cứu độc chất: xác định dư lượng thuốc trừ sâu, yếu tố có khả gây độc, nghiên cứu an toàn động vật kiểm nghiệm vi sinh Các tiêu chất lượng đề cập liên quan đến loạt quy trình thử nghiệm, vật lý, hóa học sinh học với phương pháp công cụ phân tích khác Các dược điển Anh, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc… có nhiều chuyên luận dược liệu áp dụng nhiều kỹ thuật đại bên cạnh phương pháp truyền thống Các tiêu soi bột, vi phẫu, độ ẩm, tro toàn phần, tro sulfat, kim loại nặng, hàm lượng chất chiết tiêu chung cho tất dược liệu Các tiêu đặc trưng: định tính phương pháp sắc ký (dùng marker, fingerprint), phản ứng hóa học, định lượng hàm lượng tinh dầu, định lượng số chất đánh dấu 1.5.2 Chất chuẩn đối chiếu hóa học Theo hướng dẫn WHO,103 chất chuẩn đối chiếu hoá học phân loại định nghĩa cụ thể gồm: Chất chuẩn đối chiếu hóa học nguyên liệu đồng nhất, xác thực, sử dụng phép thử hóa học vật lí, đặc tính so sánh với đặc tính sản phẩm kiểm tra, với độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng Chất chuẩn đối chiếu hóa học sơ cấp (primary chemical reference substance): chất thừa nhận rộng rãi, có đặc tính chất lượng phù hợp, có hàm lượng chấp nhận sử dụng làm chuẩn định lượng mà không cần phải so sánh với chất hóa học khác Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp (secondary chemical reference substance): chất đối chiếu hóa học mà tính chất hay hàm lượng xác định cách so sánh với chất chuẩn đối chiếu hóa học sơ cấp Mức độ mơ tả đặc tính thử nghiệm chất đối chiếu hóa học thứ cấp so với chất đối chiếu hóa học sơ cấp 35 Zưllner104 tóm tắt từ European Pharmacopoeia Chemical Reference Substances (CRS) phát hành Quality of Medicines & HealthCare (EDQM) định nghĩa: “Chất chuẩn chứng minh có đặc tính phù hợp với mục đích sử dụng, mà khơng cần phải so sánh với chuẩn có khác” Cũng theo Zưllner104.: “Chất chuẩn (reference material), kèm theo chứng chỉ, nhiều số có giá trị đặc tính chứng nhận thủ tục thiết lập khả xác định nguồn gốc để nhận xác đơn vị giá trị đặc tính thể giá trị chứng nhận kèm với độ không đảm bảo đo mức độ tin cậy nêu” 1.5.3 Chất đánh dấu (marker) 1.5.3.1 Định nghĩa Các chất đánh dấu thành phần xác định mặt hóa học dược liệu.105 Tốt nhất, chất đánh dấu hợp chất có tác dụng dược lý để điều trị Theo WHO, chuẩn đánh dấu dược liệu (marker substance reference) định nghĩa chất tham chiếu, thành phần xác định mặt hóa học nguyên liệu thảo mộc Chúng đóng góp khơng vào hoạt động điều trị.105 Cơ quan đánh giá Dược phẩm Châu Âu (EMEA) định nghĩa chất đánh dấu hóa học thành phần nhóm thành phần xác định mặt hóa học sản phẩm thuốc thảo dược quan tâm cho mục đích kiểm tra chất lượng chúng có hoạt tính điều trị hay khơng.106 1.5.3.2 Các tiêu chí để chọn lựa chất đánh dấu hóa học cho dược liệu Theo WHO,105 chất đánh dấu hóa học nên thành phần có hoạt tính trị liệu biết (1), có tác dụng dược lý phù hợp cơng nhận (2), phải có tính chất đặc trưng cho dược liệu (3), chất/nhóm chất gây độc (4) EMEA phân loại chất đánh dấu hóa học thành chất đánh dấu phân tích chất đánh dấu hoạt tính.106 36 Theo định nghĩa EMEA, chất đánh dấu phân tích thành phần nhóm thành phần phục vụ cho mục đích phân tích, chất đánh dấu hoạt tính thành phần nhóm thành phần đóng góp vào hoạt động điều trị Một số phân loại khác mở rộng từ định nghĩa ban đầu WHO EMEA Li cộng sự107 đề xuất hệ thống phân loại gồm tám loại thành phần, cụ thể (1) thành phần điều trị, (2) thành phần hoạt tính sinh học, (3) thành phần hiệp đồng, (4) thành phần đặc trưng, (5) thành phần chính, (6) thành phần tương quan, (7) thành phần độc hại, (8) thành phần chung sử dụng với nguyên tắc dấu vân tay Trong đó: (1) Các thành phần trị liệu thành phần có tác dụng điều trị trực tiếp loại thuốc thảo dược Chúng sử dụng làm chất đánh dấu hóa học cho đánh giá định tính định lượng (2) Các thành phần hoạt tính sinh học chất có cấu trúc hố học khác loại thuốc thảo dược; thành phần riêng lẻ khơng có tác dụng điều trị trực tiếp kết hợp hoạt tính sinh học chúng góp phần vào hiệu điều trị Các thành phần hoạt tính sinh học sử dụng làm chất đánh dấu hóa học để đánh giá định tính định lượng (3) Các thành phần hiệp lực thành phần không trực tiếp góp phần vào hiệu điều trị hoạt tính sinh học liên quan chúng hoạt động hiệp đồng để củng cố hoạt tính sinh học thành phần khác, điều chỉnh tác dụng điều trị thuốc thảo dược Các thành phần hiệp lực sử dụng làm chất đánh dấu hóa học để đánh giá định tính định lượng (4) Các thành phần đặc trưng góp phần vào hiệu điều trị không, chúng phải thành phần đặc biệt /hoặc thành phần có loại thuốc thảo dược (5) Các thành phần thành phần có nhiều loại thuốc thảo dược (hoặc nhiều đáng kể so với thành phần khác) 37 Chúng thành phần đặc trưng hoạt tính sinh học chúng khơng biết đến Các thành phần sử dụng cho phân tích định tính định lượng thuốc thảo mộc, đặc biệt để đánh giá khác biệt ổn định (6) Các thành phần tương quan thành phần tương ứng thuốc thảo dược có mối quan hệ chặt chẽ với Ví dụ, thành phần tiền chất, sản phẩm chất chuyển hóa phản ứng hóa học enzym Các thành phần tương quan sử dụng làm chất đánh dấu hóa học để đánh giá chất lượng loại thuốc thảo dược có nguồn gốc từ vùng địa lý khác lưu trữ khoảng thời gian khác (7) Các thành phần độc hại chất/ nhóm chất độc hại dược liệu y học cổ truyền độc chất học đại nghiên cứu ghi nhận, (8) Các thành phần chung với "dấu vân tay" thành phần chung cụ thể có lồi, chi họ cụ thể Các thành phần sử dụng với "dấu vân tay" cho mục đích kiểm tra chất lượng Bên cạnh đó, để kiểm sốt chất lượng thành phẩm từ dược liệu, Bensoussan cộng sự108 xây dựng "Hệ thống xếp hạng chất đánh dấu thảo mộc" (Herbal Chemical Marker Ranking System - Herb MaRS) cung cấp hướng dẫn việc ưu tiên lựa chọn chất đánh dấu hóa học để kiểm sốt chất lượng thuốc đa vị thành phẩm dược liệu, đồng thời tính đến hoạt tính sinh học liên quan đến triệu chứng bệnh nồng độ công thức Các yếu tố đánh giá hệ thống Herb MaRS đưa bao gồm yếu tố tác dụng trị liệu, hoạt tính dược lý, nồng độ chất dược liệu độc tính chia thành mức độ khác xếp hạng 38 Trong hệ thống này, chất đánh dấu hóa học xếp theo nhiều hạng khác nhau, tức x, 0, 1, 2, 3, 5; việc xếp hạng dựa quan sát/ tham khảo tác dụng điều trị độc hại phát đo lường Liu cộng sự,109 Yang cộng sự110 đề xuất thuật ngữ "Q-marker" dùng chất hoá học dùng để đánh giá chất lượng thuốc từ thảo dược, tóm tắt đặc tính sau: (1) Q-marker hợp chất hóa học có sẵn thảo mộc, dược liệu chế, cao thành phẩm thuốc từ thảo dược; (2) Q-marker chất hoá học cụ thể, xác định, cần phải phân tích định tính và/ định lượng được; (3) dựa theo lý luận y học cổ truyền "Quân - Thần - Tá - Sứ" với kiến thức y học đại, Q-marker rõ đóng góp tác dụng thuốc thảo dược; (4) Q-marker phải chất có mặt theo dõi thuốc tất công đoạn chế biến chế phẩm Bảng 1-4: Bảng tính điểm để chọn marker để định tính định lượng dược liệu thuốc từ dược liệu H n g x Yêu cầu chi tiết Chưa nghiên cứu hoạt tính sinh học (Chưa tìm thấy văn ghi nhận nghiên cứu hoạt tính sinh học (in vitro hoặc/và in vivo)) Hoạt tính khơng liên quan đến định điều trị chưa thiết lập chất chuẩn Hoạt tính sinh học liên quan gián tiếp đến điều trị triệu chứng bệnh (Chất có tác dụng không đáng kể điều trị) Hoặc Chất có hàm lượng thấp ( 50 µg/g) dược liệu thành phẩm Và mục đích sử dụng y học cổ truyền hay đại phù hợp với hoạt tính sinh học chất Hoạt tính sinh học liên quan đến tác dụng trị liệu có ≥ nghiên cứu đạt yêu cầu hoạt tính sinh học này) Và chất có hàm lượng cao (> 50 µg/g) dược liệu thành phẩm Và mục đích sử dụng y học cổ truyền hay đại phù hợp với hoạt tính sinh học chất Chất có độc tính cần phải xác định giới hạn an toàn (Các chất có khả gây độc gen gây ung thư khuyến cáo theo dõi sử dụng mức 1,5μg / ngày) Hoặc Hoạt tính sinh học liên quan đến tác dụng trị liệu có ≥ nghiên cứu đạt yêu cầu hoạt tính sinh học này) Và chất có hàm lượng cao (> 50 µg/g) dược liệu thành phẩm Và mục đích sử dụng y học cổ truyền hay đại phù hợp với hoạt tính sinh học chất Và chất và/hoặc chất chuyển hóa có tính khả dụng sinh học (Nguồn: lược dịch theo Bensoussan et al108., 2015) 40 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu đề tài dược liệu Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam (Đương quy Nhật Bản di thực), Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.) Kitagawa, hợp chất tự nhiên thành phần hố học chọn lọc để trở thành chất đánh dấu hoá học dùng kiểm nghiệm Nguyên liệu dùng cho nghiên cứu thân, rễ củ Đương quy Nhật Bản tươi khô qua chế biến thành dược liệu Ngoài số nguyên liệu từ loài Đương quy loài khác thuộc họ Apiaceae dùng làm nguyên liệu đối chứng số thí nghiệm 2.1.1 Nguyên liệu dùng chiết xuất Nguyên liệu dùng để chiết xuất khoảng 80 kg rễ củ tươi 10 kg thân Nguyên liệu toàn tươi nhà vườn thu hoạch đại trà Đăk Nông (D3) Đơn Dương (D14) vào khoảng tháng 01/2017 trích phần chuyển TP Hồ Chí Minh theo xe công ty Các mẫu dược liệu định danh xác định tên khoa học phương pháp giải trình tự gen (đoạn ITS) Phần rễ dược liệu rửa sạch, lau khơ, phơi phịng có hệ thống hút ẩm (khoảng 25 C, 65% RH) Sau đó, xay nhỏ rây qua rây 355 Phần thân xử lý 2.1.2 Các mẫu sử dụng nghiên cứu giải trình tự gen khảo sát hàm lượng Theo nhà vườn, Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam gieo hạt vào khoảng tháng Chạp (âm lịch), trồng vào tháng Giêng thu hoạch vào khoảng tháng Chạp năm sau Các mẫu tươi chuyển đến phịng thí nghiệm sau thu hoạch, giữ ẩm bảo vệ đường vận chuyển bảo đảm không hỏng Các mẫu giải trình tự gen lấy dược liệu trồng khoảng 41 1-3 tháng tuổi Mẫu D12 thân thu thập từ Vườn dược liệu Khoa Dược, Đại học Kyoto, Kyoto, Nhật Bản Bảng 2-5: Danh mục mẫu khảo sát M ã D D D D D D D D Tên mẫu ban đầu Đương quy Trung Quốc Đương quy Nhật Bản Đương quy Nhật Bản Đương quy Trung Quốc Đương quy Trung Quốc Đương quy Nhật Bản Đương quy Nhật Bản Đương quy Nhật Bản Tình trạng mẫu Ngun khơ rễ Nguồn gốc Mục đích sử dụng Trung Quốc Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Toàn (rễ + thân, lá) tươi Trồng Đà Lạt Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Toàn (rễ + thân, lá) tươi Trồng Đăk Nơng Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Ngun khơ rễ Trung Quốc Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Nguyên khô rễ Trung Quốc Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Ngun khơ rễ Trồng Đăk Lăk Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Rễ khô băm thành hạt Hokkaido, Nhật Bản Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Rễ khơ băm thành hạt Obuka, Bản Giải trình tự gen Khảo sát hàm lượng Nhật Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn