Cop yri gh t © S ch oo l o f M ed ici ne an d P ha rm ac y, VN U ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƢỢC LÝ THỊ HẢI YẾN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) KHÓA LUẬ[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y, V NU KHOA Y DƢỢC Ph ar m LÝ THỊ HẢI YẾN M ed ici ne an d GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) Co py rig ht © Sc ho ol of KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ac y, V NU KHOA Y DƢỢC m LÝ THỊ HẢI YẾN ici ne an d Ph ar GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HĨA DƢỢC LIỆU HY THIÊM (Herba Siegesbeckiae) M Khóa: QH.2012.Y ed KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC of Ngƣời hƣớng dẫn: ho ol ThS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Thị Thanh Bình Sc Nơi thực hiện: Co py rig ht © Khoa Hóa phân tích tiêu chuẩn – Viện dƣợc liệu Hà Nội – 2017 Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN NU Lời em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Phƣơng TS Nguyễn Thị Thanh Bình ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn tận tình, chu đáo, ln động viên khích lệ tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời ac y, V gian thực khóa luận m Em xin trân trọng cảm ơn ban lãnh đạo Viện Dƣợc liệu tập thể cán phòng Hố phân tích - tiêu chuẩn tạo điều kiện cho em đƣợc thực tập tham gia nghiên cứu học hỏi Viện Ph ar Em xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè ngƣời thân gia đình tạo điều kiện, quan tâm, giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập an d Trong suốt q trình làm khóa luận nghiên cứu Viện, em cố gắng nỗ lực để hồn thành khóa luận Tuy nhiên, kiến thức cịn hạn ne hẹp thời gian có hạn nên đề tài em không tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc góp ý thầy để khóa luận em đƣợc hồn thiện Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici Cuối em xin kính chúc thầy cô mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc nhƣ sống Hà Nội, tháng 06 năm 2017 Sinh Viên Lý Thị Hải Yến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ NU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ac y, V 1.1 Vị trí phân loại hy thiêm 1.2 Đặc điểm thực vật hy thiêm 1.2.1 Phân bố, sinh thái ar m 1.2.2 Thu hái chế biến Ph 1.3 Thành phần hóa học 1.3.1 Các diterpen an d 1.3.2 Các dẫn chất sesquyterpen ne 1.3.3 Các dẫn chất geranylnerol ici 1.3.4 Các flavonoid ed 1.3.5 Các steroid M 1.3.6 Một số hợp chất khác of 1.4 Tác dụng dƣợc lý ol 1.4.1.1 Tác dụng chống viêm ho 1.4.1.2 Tác dụng chống oxi hóa Sc 1.4.1.3 Tác dụng ức chế miễn dịch 1.4.1.4 Tác dụng chống dị ứng rig ht © 1.4.1.5 Độc với tế bào u sắc tố 1.4.1.6 Tác dụng chuyển hóa lipid py 1.4.1.7 Tác dụng kháng khuẩn Co 1.4.1.8 Tác dụng điều trị gout 1.4.1.9 Tác dụng khác 1.5 Tính vị, cơng năng, cơng dụng 1.5.1 Tính vị, cơng 1.5.2 Công dụng NU 1.6 Tổng quan darutosid 10 ac y, V 1.6.1 Cơng thức cấu tạo tính chất lý hố 10 1.6.2 Tác dụng darutosid 11 1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 11 ar m 1.7 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng sắc ký lỏng hiệu cao 12 Ph 1.7.1 Vài nét phƣơng pháp TLC áp dụng nghiên cứu định tính 12 1.7.2 Vài nét phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 13 an d 1.7.2.1 Nguyên tắc phƣơng pháp HPLC 13 ne 1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu cao 14 1.7.2.3 Các phƣơng pháp định lƣợng HPLC 15 ed ici CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 M 2.1 Nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu 17 of 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 17 2.2.1 Thiết bị 17 ho ol 2.2.2 Dụng cụ 18 Sc 2.2.3 Hóa chất 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 18 © 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu Hy thiêm 18 rig ht 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm TLC 19 py 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm HPLC 19 Co 3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử 19 2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 19 2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid dƣợc liệu hy thiêm 19 NU 2.4.3 Phƣơng pháp xác định cấu trúc darutosid 21 ac y, V 2.4.4 Phƣơng pháp định tính dƣợc liệu hy thiêm TLC 21 2.4.5 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm phƣơng pháp HPLC 21 m 2.4.6 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC 22 Ph ar 2.4.6.1 Tính chọn lọc phƣơng pháp 22 2.4.6.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 22 an d CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 25 3.1 Chiết xuất phân lập 25 ne 3.1.1 Chiết xuất cao phân đoạn từ Hy thiêm 25 ici 3.1.2 Phân lập 26 ed 3.1.3 Xác định cấu trúc hoá học HT1 27 M 3.1.4 Xác định độ tinh khiết darutosid 30 ol of 3.2 Xây dựng phƣơng pháp định tính chất darutosid phƣơng pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) 30 Sc ho 3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng chất darutosid phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 32 © 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 32 rig ht 3.3.1.1 Lựa chọn pha tĩnh 32 3.3.1.2 Chọn bƣớc sóng phân tích 32 py 3.3.1.3 Khảo sát dung môi pha động 32 Co 3.3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 34 3.4 Thẩm định phƣơng pháp 37 3.4.1 Tính thích hợp hệ thống 37 3.4.2 Tính chọn lọc 39 3.4.3 Xác định giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 39 NU 3.4.4 Xây dựng đƣờng chuẩn xác định khoảng tuyến tính 40 ac y, V 3.4.5 Thẩm định độ lặp lại 41 3.4.7 Thẩm định độ thu hồi 43 3.5 Bàn luận 44 ar m KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 Ph TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici ne an d PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Butanol DĐVN Dƣợc điển Việt Nam DMC Dichloromethane EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol MeOH Methanol Hex Hexan HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquyd Chromatography) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lƣợng (Limit of Quantitation) M Khối lƣợng phân tử ( MaSKĐ) MS Phổ khối (MaSKĐ Spectroscopy) NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative standard devition) ac y, V m ar Ph d an ne ici ed M of ol ho Sc © rig ht Hệ số lƣu Sắc ký lớp mỏng TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Phổ tử ngoại (Ultra violet) Co SKLM py Rf NU But DANH MỤC BẢNG NU Trang Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất HT1 darutosid ac y, V theo tài liệu tham khảo Bảng 3.2: Kết khảo sát chƣơng trình gradient ar m Bảng 3.3: Các thơng số khảo sát chƣơng trình gradient Ph Bảng 3.4: Khảo sát phƣơng pháp chiết mẫu d Bảng 3.5: Khảo sát thời gian chiết mẫu an Bảng 3.6: Khảo sát số lần chiết mẫu 33 34 35 36 37 38 Bảng 3.8: Kết xác định LOD LOQ 40 ed ici ne Bảng 3.7: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống M Bảng 3.9: Kết khảo sát khoảng tuyến tính 40 42 Bảng 3.11: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp 43 ho ol of Bảng 3.10: Kết khảo sát độ lặp lại phƣơng pháp Co py rig ht © Sc Bảng 3.12: Hàm lƣợng darutosid mẫu dƣợc liệu hy thiêm 44 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ac y, V Hình 1.1: Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., Asteraceae) NU Trang Hình 1.2: Một số ent- pimaran ent- kauran phân lập từ S orientalis Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất sesquyterpen lacton ar m nhóm germancranlid phân lập từ S orientalis Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất geranylnerol an d Ph Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo số dẫn chất sesquyterpen lacton nhóm melampolid ne Hình 1.6: Công thức cấu tạo flavonoid phân lập từ S orientalis ici Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo darutosid ed Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm M Hình 3.1: Sắc ký đồ darutosid phân lập đƣợc of Hình 3.2: Sắc ký đồ hệ dung môi ol Hình 3.3 : Sắc ký đồ chƣơng trình gradient 10 17 30 31 34 38 Hình 3.4: Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thêm chuẩn 39 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn phƣơng trình hồi quy tuyến tính darutosid 41 rig ht © Sc ho Hình 3.3: Khảo sát tính phù hợp hệ thống 25 Sơ đồ 3.2: Tóm tắt quy trình phân lập darutosid cao ethyl acetat từ 27 py Sơ đồ 3.1: Tóm tắt quy trình chiết cao hy thiêm Co dƣợc liệu hy thiêm NU chứng đau nhức Nƣớc ép tƣơi đắp lên vết thƣơng, khô tạo thành lớp phủ giống nhƣ véc ni Cồn thuốc hy thiêm đƣợc dùng với glycerin để chữa bệnh herpes loang vòng số bệnh nhiễm ký sinh trùng Hy thiêm đƣợc dùng ac y, V để chữa thấp khớp đau thận Nó đƣợc coi có tác dụng trợ tim, làm mồ hơi, chống scorbut tăng tiết nƣớc bọt Cịn đƣợc dùng làm thuốc trị giun sán Cao nƣớc hy thiêm có tác dụng độc số loại gián [8] m Ở Madagasca, hy thiêm đƣợc dùng với tác dụng gây liền sẹo bên bên thể (đối với loét ống tiêu hóa) [8] ar Ở Nepal, dịch ép rễ để trị vết thƣơng [8] d Ph Ở Nigeria, cao tồn có tác dụng kháng khuẩn trị tổn thƣơng da, bệnh phong, giang mai, bệnh hoa liễu nấm da, làm thuốc tẩy chống nôn [8] an 1.6 Tổng quan darutosid ho ol of M ed ici ne 1.6.1 Công thức cấu tạo tính chất lý hố Sc Hình 1.7: Cơng thức cấu tạo darutosid rig ht © - Tên IUPAC: 2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(2R,4aS,4bR,7S,10aS)-7-[(1R)-1,2dihydroxyethyl]-1,1,4a,7-tetramethyl-3,4,4b,5,6,9,10,10a-octahydro-2H-phenanthren- 2yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Công thức phân tử của darutosid: C26H44O8 - Khối lƣợng phân tử: M= 484.62 - Trạng thái vật lý: Bột màu trắng - Tan MeOH Co py - 10 1.6.2 Tác dụng darutosid ac y, V NU Hy thiêm chứa hàm lƣợng lớn darutosid Tại hịn đảo Reunion Mauritius, đƣợc biết đến đặc tính chữa bệnh lành vết thƣơng bên nhanh làm dịu viêm [22] Darutosid diterpenoid đƣợc phân lập từ Siegesbeckia orientalis, đƣợc m chứng minh có đặc tính chống viêm thí nghiệm in vivo (ức chế đƣờng lipoxygenase tổng hợp prostaglandin, ức chế collage-nase, chống lại chứng phát ban tia cực tím) [22] ar Ngồi ra, darutosid cịn có tác dụng phục hồi vết thƣơng tái tạo mô cách ne an d Ph sinh tổng hợp collagen Đối với da bị rạn (tổn thƣơng bề mặt da giãn nở bất thƣờng lớp hạ bì thời gian mang thai thay đổi cân nặng, làm cho chất elastin mơ liên kết giảm mất) darutosid có khả tái cấu trúc vết rạn, tăng sinh collagen, giúp hồi phục da [22] Một thử nghiệm in vivo đánh giá hiệu chống căng da loại kem chứa ed ici 1.0 % darutosid 14 tình nguyện viên nữ (21- 42 tuổi) có vết rạn bụng, đùi, hơng, ngực… Kết cho thấy sử dụng kem ngày hai lần bốn tuần liên M tiếp số 14 tình nguyện viên nhận thấy vết rạn đƣợc làm đầy, kích thƣớc thu nhỏ dần đồng thời độ nhạy cảm giảm, cải thiện độ đàn hồi da [22] ho ol of 1.6.3 Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm HPLC 1.6.3.1 Định tính Sc Hiện nay, chƣa có dƣợc điển quy định chuyên luận định tính darutosid dƣợc liệu hy thiêm © 1.6.3.2 Định lƣợng Co py rig ht Trên giới chƣa có dƣợc điển quy định chuyên luận định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm Một số cơng trình nghiên cứu định lƣợng darutosid từ loài đƣợc thực theo phƣơng pháp [16]: - Detector UV bƣớc sóng 210 nm, cột (4,6 x 250 mm), cỡ hạt µm - Tốc độ dòng: 1.0 mL/phút Pha động: nƣớc - acetonitril (1 : v/v) - Dung dịch chuẩn: Cân xác 10,0000 mg darutosid, hoà tan 10 mL methanol để thu đƣợc dung dịch chuẩn có nồng độ 1mg/mL, sau tiến hành pha 11 lỗng để đƣợc dung dịch có nồng độ từ 1-20 µg/mL ac y, V NU - Dung dịch thử: Cân 10 mg cao khơ chiết từ methanol thơ, thêm 10mL methanol sau ly tâm vòng 20 phút Lấy phần dịch vào bình định mức 10 mL Lặp lại quy trình lần, kết hợp dịch lọc Cuối thu đƣợc dung dịch có nồng độ mg/mL 1.7 Tổng quan phƣơng pháp sắc ký lỏng sắc ký lỏng hiệu cao ar m 1.7.1 Vài nét phƣơng pháp TLC áp dụng nghiên cứu định tính Nguyên tắc: Ph - ne an d Quá trình tách TLC đƣợc thực lớp mỏng gồm hạt kích thƣớc đồng đƣợc kết dính giá đỡ thủy tinh, nhôm chất dẻo Lớp mỏng kết dính pha tĩnh Các hạt pha tĩnh làm nhiệm vụ tách theo chế: phân bố, hấp thụ, trao đổi ion Pha động hệ dung môi tƣơng tự phƣơng pháp HPLC Rf = of M ed ici Đại lƣợng đặc trƣng cho mức độ di chuyển chất hệ số lưu giữ Rf Trị số đƣợc tính tỷ lệ khoảng cách di chuyển chất phân tích khoảng cách dịch chuyển pha động: ol Trong đó: ho dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) Sc dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động ( đo đƣờng vết, tính cm) © Rf: Có giá trị giao động từ 0-1 Pha tĩnh TLC rig ht - Co py Pha tĩnh TLC hạt có kích thƣớc 10-30 µm đƣợc trải kết dính thành lớp mỏng đồng dày khoảng 250 µm giá đỡ hình vng Pha tĩnh thơng dụng hay dùng silica gel, ngồi sử dụng nhơm oxyd, cellulose, polyamid hay loại silica gel pha đảo - Pha động: Pha động TLC phụ thuộc vào chế sắc ký, để tăng cƣờng sức rửa giải thƣờng kết hợp nhiều dung môi với Nguyên lý chi tách dựa vào hệ số phân bố 12 pha Dƣới số gợi ý chung cho dung môi pha động: NU Dung mơi cần có độ tinh khiết cao ac y, V Cần điều chỉnh sức rửa giải pha động để trị số Rf nằm khoảng 0,2 – 0,8 đạt độ phân giải cực trị Chất phân tích dạng ion hay phân cực đƣợc rửa giải tốt dung môi phân cực nhƣ hỗn hợp n-butanol – nƣớc Thêm acid acetic amoniac vào nƣớc làm m tăng độ tan base acid tƣơng ứng ar Khi dùng silica gel chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực an d Ph pha động định tốc độ di chuyển chất phân tích trị số Rf chúng Nếu thêm dung mơi phân cực nhƣ ether ethylic vào dung môi không phân cực nhƣ methylebnzen làm tăng đáng kể trị số Rf Đánh giá kết - ne Vết chất cần phân tích mỏng soi đèn UV phun thuốc thử ici màu phải đƣợc nhìn thấy rõ, tách rời với vết tạp ed Trị số Rf phải nằm khoảng 0,2-0,8 M So sánh trị số Rf chất chuẩn với chất mẫu phân tích of 1.7.2 Vài nét phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nguyên tắc phƣơng pháp HPLC HPLC kỹ thuật phân tích chất phân tích di chuyển qua cột chứa hạt pha tĩnh nhờ dòng di chuyển pha động lỏng dƣới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác liên quan đến hệ số phân bố chúng pha, tức liên quan đến lực tƣơng đối chất pha tĩnh pha động Thứ tự rửa giải chất khỏi © Sc ho ol 1.7.2.1 rig ht cột phụ thuộc vào yếu tố Các chất sau khỏi cột đƣợc phát detector Co py Có kỹ thuật HPLC bản: Sắc ký phân bố, hấp phụ, trao đổi ion rây phân tử (loại cỡ) Trong phạm vi khóa luận này, tơi xin trình bày cụ thể kỹ thuật sắc ký phân bố 1.7.2.2 Điều kiện sắc ký phân bố hiệu cao - Pha tĩnh: Pha tĩnh HPLC chất nhồi cột có nhiệm vụ tách hỗn hợp gồm nhiều thành phần Đó chất rắn xốp, có kích thƣớc nhỏ, đƣờng kính – 10 µm, có độ phân cực khác Pha tĩnh đƣợc cấu tạo từ nhóm chức khác ghép hóa học giá mang, 13 thƣờng hạt silica Tùy theo chất pha tĩnh, ngƣời ta phân hai loại: NU Sắc kí pha thuận: Pha tĩnh có bề mặt chất phân cực nhƣ triethylen glycol; pha động dung môi hữu phân cực nhƣ: n-hexan, toluen, isopropyl ether ac y, V Trong sắc kí pha thuận, chất phân cực đƣợc rửa giải Khi tăng độ phân cực pha động, thời gian lƣu giảm dần m Sắc kí pha đảo: pha tĩnh silica gel đƣợc alkyl hóa, phân cực Trong sắc ký pha đảo, chất phân cực đƣợc rửa giải đầu tiên, tăng độ phân cực ar pha động thời gian lƣu tăng lên Pha động HPLC: Ph - Detector HPLC ed - ici ne an d Pha động dung môi rửa giải chất phân tích khỏi cột sắc kí Pha động dung mơi hữu cơ, hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ định Trong sắc kí pha thuận, pha động dung mơi hữu phân cực nhƣ: n-hexan, benzen, chloroform… Trong sắc kí pha đảo, pha động hệ dung mơi hữu phân cực nhƣ: methanol, acetonitril… hay hỗn hợp chúng © Sc ho ol of M Detector phận dùng để phát chất sau đƣợc tách riêng rửa giải khỏi cột sắc kí Một chất qua detector sẽcho tín hiệu đáp ứng khác biệt với pha động, qua cho phép đánh giá, định tính, định lƣợng thành phần mẫu phân tích Tùy thuộc vào tính chất lý hóa đối tƣợng chất cần phân tích, detector đƣợc lựa chọn thích hợp để chất có đáp ứng với detector Các loại detector thƣờng đƣợc sử dụng HPLC bao gồm: detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS), detector đại thuộc loại detector mảng diod (DAD); detector huỳnh quang; detector độ dẫn, detector khối phổ Các phƣơng pháp định lƣợng HPLC Nguyên tắc phƣơng pháp định lƣợng HPLC nồng độ chất tỷ lệ với chiều cao diện tích píc chất thể sắc ký đồ rig ht 1.7.2.3 py Có phƣơng pháp định lƣợng đƣợc sử dụng sắc ký: Phƣơng pháp chuẩn ngoại - Phƣơng pháp chuẩn nội - Phƣơng pháp thêm chuẩn - Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích Co - 14 Khóa luận đƣợc thực theo phƣơng pháp chuẩn ngoại Phƣơng pháp chuẩn ngoại phƣơng pháp định lƣợng bản, mẫu NU chuẩn mẫu thử đƣợc tiến hành sắc ký điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) píc mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) píc mẫu chuẩn tính đƣợc ac y, V nồng độ chất cần phân tích mẫu thử Có phƣơng pháp chuẩn hóa điểm chuẩn hóa nhiều điểm m Chuẩn hóa điểm: Chọn nồng độ mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ mẫu thử - Ph ar Tính nồng độ mẫu thử theo cơng thức: CX = CS an CS nồng độ mẫu chuẩn d Trong đó: CX nồng độ mẫu thử ne SX diện tích píc mẫu thử ici SKĐ diện tích píc mẫu chuẩn ed Chuẩn hóa nhiều điểm: cần tiến hành qua bƣớc sau: - of M Chuẩn bị dãy chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu đƣợc diện tích (hoặc chiều cao) píc điểm chuẩn ho ol Vẽ đồ thị biểu diễn tƣơng quan diện tích píc (hoặc chiều cao) với nồng độ chất chuẩn Sc Sử dụng đoạn tuyến tính đƣờng chuẩn để tính tốn nồng độ chất thử © Có thể tính tốn dựa theo cách: rig ht - Áp kiện diện tích (hoặc chiều cao) píc chất thử vào đƣờng chuẩn suy đƣợc nồng độ Co py - Xây dựng phƣơng trình hồi quy tuyến tính mơ tả quan hệ diện tích (hoặc chiều cao) píc với nồng độ chất cần xác định Y = a + bCX Trong đó: Y diện tich píc a giao điểm đƣờng chuẩn với trục tung b độ dốc đƣờng chuẩn 15 CX nồng độ chất thử Dựa vào phƣơng trình tìm đƣợc CX Chú ý độ lớn diện tích (hoặc Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici ne an d Ph ar m ac y, V NU chiều cao) píc mẫu thử phải nằm đoạn tuyến tính đƣờng chuẩn 16 CHƢƠNG - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu, phƣơng tiện nghiên cứu 2.1 ac y, V NU Nguyên liệu để chiết xuất phân lập diterpenoid phận mặt đất hy thiêm đƣợc trồng thu hái huyện Thạch Thành, Thanh Hóa vào tháng 9/ ed ici ne an d Ph ar m 2016 Mẫu nghiên cứu đƣợc sấy khô 65oC, bảo quản túi bóng kín nơi khơ thống mát lƣu Viện Dƣợc liệu M Hình 2.1: Dƣợc liệu hy thiêm ol 2.2.1 Thiết bị of Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2 Bếp cách thủy (Memmert, WB – 14 LO) - Cân phân tích (Sartorius, BP-221S): độ xác 0,0001 g - Cân kỹ thuật điện tử (Kern, EW – 600 -2M) - Tủ sấy (Memmert, ULM 500) - Đèn tử ngoại bƣớc sóng 254 nm, 365 nm (Vilber lourmat, CN – 15 – LC) - Máy quang phổ UV-1800, SHIMADZU - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC – LC 10A (Shimadzu) - Máy đo cộng hƣởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR,DEPT) Bruker AM500 FT-NMR Co py rig ht © Sc ho - 17 - Máy đo khối phổ Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS Systems (Waters, USA) NU 2.2.2 Dụng cụ Micropipet loại 100 µL, 200 µL, 1000 µL, 5000 µL đầu côn tƣơng ứng - Ống ly tâm mL, 50 mL - Màng lọc 0,2 µm, 0,45 µm - Vial dung tích 1,8 mL - Dụng cụ thủy tinh phịng thí nghiệm gồm bình định mức, ống nghiệm, ống đong, cốc có mỏ, phễu… Ph ar m ac y, V - d 2.2.3 Hóa chất Chuẩn darutosid hàm lƣợng 97% hãng Sigma - n-hexan, n-butanol, dichloromethan, ethyl acetat, methanol, nƣớc cất… đạt tiêu ne an - ici chuẩn phân tích Bản sắc ký lớp mỏng đƣợc thực mỏng silica gel 60 RP18 F254S (Merck) - Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (Merck) - Silica gel pha đảo RP18 (Merck) - Thuốc màu dùng sắc ký lớp mỏng: dung dịch acid H2SO4 10 % ethanol Sc ho ol of M ed - Nội dung nghiên cứu 2.3 © 3.1 Phân lập chất darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm rig ht - Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm phƣơng pháp sắc kí cột Co py - Xác định cấu trúc darutosid phân lập phổ NMR, MS 18 3.2 Định tính darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm TLC 3.3 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm NU HPLC ac y, V - Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng - Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.4 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC ar m - Độ chọn lọc phƣơng pháp Ph - Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn - Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ) an d - Độ lặp lại (độ chụm), độ thu hồi (độ đúng) phƣơng pháp Phƣơng pháp nghiên cứu ne 2.4 ici 2.4.1 Phƣơng pháp thu thập xử lý sơ mẫu thử ed - Thời gian lấu mẫu: tháng 09/2016 of - Khối lƣợng mẫu: kg M - Địa điểm lấy mẫu: Thạch Thành, Thanh Hoá ho thoáng mát ol - Mẫu sau thu thập đƣợc rửa sạch, sấy khô 65oC, bảo quản nơi khô Sc 2.4.2 Phân lập darutosid từ dƣợc liệu hy thiêm 2.4.2.1 Phƣơng pháp phân lập darutosid dƣợc liệu hy thiêm © - Chiết xuất cao phân đoạn từ hy thiêm Co py rig ht Dƣợc liệu hy thiêm đƣợc chiết nóng với ethanol 96 % nhiệt độ 70oC (chiết lần, lần giờ), thu đƣợc cao ethanol Cao tồn phần sau đƣợc hòa tan nƣớc tiếp tục chiết lỏng- lỏng dung mơi có độ phân cực khác lần lƣợt là: n-hexan, ethyl acetat n- butanol Thu đƣợc phân đoạn dịch chiết: phân đoạn n-hexan, phân đoạn ethyl acetat, phân đoạn n- butanol - Phân lập darutosid từ cao phân đoạn 19 - Phân lập darutosid phƣơng pháp sắc ký cột Cột sắc ký: Pha tĩnh: m Hạt silica gel pha thƣờng hạt silica gel pha đảo ac y, V NU Cột sắc ký cột thủy tinh có van khóa để điều chỉnh tốc độ dịng chảy, kích thƣớc tùy lƣợng cao phân lập Cột đƣợc rửa sạch, sấy khô, gắn giá vững ar Pha động: Ph Dung môi rửa giải d Phƣơng pháp nhồi ƣớt: ed ici ne an Cột sắc ký đƣợc lót lớp bơng mỏng dƣới đáy để chất hấp phụ chảy xuống khóa mở cột Chất hấp phụ hạt silica gel pha thƣờng (cột sắc ký pha thƣờng) hạt silica gel pha đảo (dùng cột sắc ký pha đảo) đƣợc hịa tan dung mơi pha động Luyện cột dung môi pha động để đuổi bọt khí, nén cột, giúp ổn định tốc độ dịng Cột đƣợc luyện đến khơng cịn bọt khí cột, chiều cao M lớp chất hấp phụ ổn định of Chuẩn bị mẫu sắc ký: Sc ho ol Phần chất cần phân lập đƣợc hòa tan lƣợng tối thiểu dung mơi Sau trộn với lƣợng pha tĩnh vừa đủ, làm bay dung môi để đƣợc bột mịn tơi xốp nhƣ lớp chất hấp phụ bình thƣờng, nhằm tạo đồng lớp bột lớp chất hấp phụ lên cột © Đƣa mẫu lên cột: Co py rig ht Cột sắc ký sau ổn định, cho dung môi chảy xuống cách lớp silica gel đủ để lấp đầy phần chất cho vào Phần mẫu đƣợc rắc đầu lớp silica gel, gõ để ổn định phần mẫu Sau cho dung mơi chảy xuống gần sát bề mặt phần mẫu lên cột để chất xuống hết lớp hấp phụ, tránh tƣợng khuếch tán ngƣợc Kết chạy sắc ký: 20 Tiến hành sắc ký với hệ dung môi lựa chọn Dịch rửa giải đƣợc hứng vào ống nghiệm ac y, V NU Phát thu nhận kết sắc ký dịch rửa giải cách theo dõi kết chạy sắc ký loại mỏng: mỏng pha thƣờng mỏng pha đảo Phát chất thuốc thử dung dịch H2SO4 10 % EtOH Gộp ống lại với 2.4.2.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc darutosid m Chất phân lập nghi ngờ darutosid đƣợc khẳng định cấu trúc phƣơng Ph ar pháp phổ bao gồm: phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS) an d Các phổ đƣợc tiến hành đo Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ne 2.4.3 Phƣơng pháp định tính dƣợc liệu hy thiêm TLC ici ed F254 Khảo sát hệ dung môi chấm sắc ký lớp mỏng mỏng TLC silica gel 60 để triển khai sắc ký định tính darutosid dịch chiết dƣợc liệu M Hệ dung môi phù hợp hệ dung môi cho vết tách biệt mỏng cho Rf chất phân tích khoảng 0,2 – 0,8 [16] of Phát chất đèn tử ngoại bƣớc sóng 254 nm 366 nm dùng ol thuốc thử dung dịch H2SO4 10 % ethanol Sc ho 2.4.4 Xây dựng quy trình định lƣợng darutosid dƣợc liệu hy thiêm phƣơng pháp HPLC © Khảo sát điều kiện sắc ký - Cột sắc ký: qua tham khảo nghiên cứu lựa chọn cột C18 (250 x rig ht 4,6 mm; µm) hãng Agilent py - Khảo sát bƣớc sóng phân tích Co - Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động Khảo sát quy trình xử lý mẫu 21 - Lựa chọn dung môi chiết: Dựa độ tan khác darutosid dung môi mà tiến hành khảo sát: ac y, V Nồng độ dung môi chiết NU Tải FULL (75 trang): https://bit.ly/3K8TXq1 Dung môi chiết Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net - Khảo sát phƣơng pháp chiết 2.4.5 Thẩm định phƣơng pháp phân tích darutosid HPLC ar m 2.4.5.1 Tính chọn lọc phƣơng pháp Ph - Khái niệm an d Tính chọn lọc khả đánh giá cách rõ ràng chất cần phân tích có mặt thành phần khắc nhƣ tạp chất chất cản trở khác - Xác định: Sử dụng phƣơng pháp HPLC ici ne Trong sắc ký lỏng hiệu cao, tính chọn lọc thể hiện: sắc ký đồ thu đƣợc từ mẫu chuẩn mẫu phân tích, píc chất cần phân tích tách hồn tồn với ed píc tạp, có tín hiệu darutosid mẫu thử tR schisandrin M Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lƣợng (LOQ) 2.4.5.2 of - Khái niệm ho ol Giới hạn phát (LOD): nồng độ khối lƣợng nhỏ đƣợc phát với mức tin cậy xác định © Sc Giới hạn định lượng (LOQ): nồng độ tối thiểu chất có mẫu thử mà ta định lƣợng phƣơng pháp khảo sát cho kết có độ xác mong muốn rig ht - Xác định: Dựa tỷ lệ tín hiệu nhiễu (S/N) Phân tích mẫu nồng độ thấp cịn xuất tín hiệu chất phân tích Co py Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N) Trong đó: S: Chiều cao tín hiệu chất phân tích N: Nhiễu đƣờng 22 LOD đƣợc chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=3 2.4.5.3 ac y, V NU LOQ đƣợc chấp nhận nồng độ mà tín hiệu lớn gấp 10-20 lần nhiễu đƣờng nền, thông thƣờng lấy S/N=10 Khoảng tuyến tính đƣờng chuẩn - Khái niệm ar m Khoảng tuyến tính phƣơng pháp phân tích: khoảng nồng độ có phụ thuộc tuyến tính đại lƣợng đo đƣợc nồng độ chất phân tích ( Ph nghiên cứu khoảng tuyến tính phụ thuộc diện tích píc nồng độ chất chuẩn) an d Đường chuẩn: đƣờng biểu diễn phụ thuộc tuyến tính đại lƣợng đo đƣợc nồng độ chất phân tích ne - Xác định ed ici Đo dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi khảo sát phụ thuộc tín hiệu nồng độ Vẽ đƣờng cong phụ thuộc tín hiệu nồng độ, sau quan sát Độ lặp lại độ thu hồi phƣơng pháp of 2.4.5.4 M phụ thuộc khơng cịn tuyến tính Co py rig ht © Sc ho ol Độ lặp lại (độ chụm): mức độ gần giá trị riêng lẻ phép đo lặp lại đƣợc biểu diễn độ lệch chuẩn S hay độ lệch chuẩn tƣơng đối RSD (%): 𝑅𝑆𝐷 (%) = ∑𝑁 𝑆 100 𝑥 (𝑥𝑖 − 𝑥)2 𝑆 = √ 𝑖=1 𝑁 − Trong đó: Tải FULL (75 trang): https://bit.ly/3K8TXq1 Dự phòng: fb.com/TaiHo123doc.net - xi: Nồng độ tính đƣợc lần thử nghiệm thứ i - 𝑥: Nồng độ trung bình tính đƣợc N lần thử nghiệm 23 - N: Số lần thử nghiệm NU Độ phƣơng pháp: khái niệm mức độ gần giá trị trung bình kết thử nghiệm giá trị thực giá trị đƣợc chấp nhận ar Trong đó: m 𝐶− 𝐶𝑜 100 % 𝐶𝑥 𝑅(%)= ac y, V Độ thu hồi (đánh giá độ đúng): tỷ lệ phần trăm giá trị thu đƣợc so với giá trị lý thuyết Ph - R: độ thu hồi (%) d - C: Nồng độ chất phân tích mẫu thử thêm chuẩn (mg/mL) an - CO: Nồng độ chất phân tích ban đầu có mẫu thử (mg/mL) Co py rig ht © Sc ho ol of M ed ici ne - Cx: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (mg/mL) 24 6815980