Tiêu chuẩn hóa dược liệu đương qui nhật bản di thực từ rễ củ cây angelica acutiloba (sieb et zucc ) kitagawa trồng tại việt nam 25

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TIÊU CHUẨN HOÁ DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN DI THỰC TỪ CÂY ANGELICA ACUTILOBA (SIEB ET ZUCC ) KITAGAWA TRỒNG TẠI VIỆT NAM Ngành Kiểm nghiệm thuốc và độc chất Mã số 62 72 04 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ YDƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2022 Công trình được hoàn thành tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học Phản biện 1 Phản biện 2 Phản biện 3 Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp t.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - TIÊU CHUẨN HOÁ DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN DI THỰC TỪ CÂY ANGELICA ACUTILOBA (SIEB ET ZUCC ) KITAGAWA TRỒNG TẠI VIỆT NAM Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 62 72 04 10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y/DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ , Thạch Giang , Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Ngọc Vinh , Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Phân lập tinh chế Z ligustilid từ Đương Quy Nhật Bản làm chất đối chiếu”, Tạp chí Dược học, Số 498, năm 57, Số 10/2017, tr 55-58 , Hồ Xuân Hương , Lê Khánh Trúc Diễm, Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Ứng dụng kỹ thuật DNA barcoding định danh số giống đương quy lưu hành Việt Nam”, Tạp chí Dược học, Số 501, năm 58, Số 01/2018, tr 63-67 , Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Văn Thanh, (2020), "Phân lập furanocoumarin từ rễ Angelica acutiloba Kitagawa trồng Lâm Đồng”,Tạp chí Y Dược học, Số 8, tháng 11/2020, tr 37-41 Thi Minh Tam Pham, Thi Thu Cuc Le, Van Thanh Nguyen, Viet Hung Tran, (2021), “Simultaneous quantitative analysis of five components in Angelica sinensis and Angelica acutiloba acclimatized growing in vietnam by high-performance liquid chromatography with photodiode array detector”,World Journal of Traditional Chinese Medicine, Volume | Issue | January-March 2021, DOI: 10 4103/wjtcm wjtcm_28_20 Pham T M T , Le T T C , Tran V H , Nguyen V T (2021), “Isolation and identification of two flavonoid compounds from acclimatized Angelica acutiloba Kitagawa growing in Vietnam”, World Journal of Traditional Chinese Medicine, 2021(x), xx-xx (Accepted by July 1st, 2021) -‐ - ‐ GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Đương quy dược liệu quý phổ biến Đông y, đa phần dược liệu Đương quy (Angelica sinensis) nhập từ Trung quốc Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) trồng nhiều tỉnh khu vực miền Trung, Tây Nguyên Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắk Lắk, Quảng Nam, tỉnh vùng núi phía Bắc Lào Cai, Sơn La, Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đại vào công tác kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng dược liệu yêu cầu cấp bách cần thiết để theo kịp với giới, phục vụ cho nhu cầu xã hội, động thái để tìm đầu cho Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) nhân dân trồng quy mô công nghiệp Mục tiêu nghiên cứu Vì tính chất cấp thiết trên, đề tài: "Tiêu chuẩn hóa dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực từ Angelica acutiloba (Sieb et Zucc ) Kitagawa trồng Việt Nam" thực với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn thiết lập sở khoa học nhằm đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận "Đương quy di thực" với mục tiêu cụ thể sau: Định danh thuốc Angelica acutiloba (Sieb et Zucc ) Kitagawa phương pháp phân tích thực vật giải trình tự gen -‐ - ‐ Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc số thành phần hóa học Angelica acutiloba (Sieb et Zucc ) Kitagawa Thiết lập số chất đối chiếu hóa học đặc trưng cho dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực Radix Angelicae acutilobae Xây dựng quy trình định tính định lượng đồng thời số chất dược liệu Radix Angelicae acutilobae Tiêu chuẩn hoá dược liệu từ Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam, từ thiết lập dược liệu đối chiếu rễ Đương quy Nhật Bản Radix Angelicae acutilobae Đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận "Đương quy Nhật Bản di thực (rễ) Radix Angelicae acutilobae" Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn Đánh giá mức độ phân biệt trình tự ITS, rbcL, matK, đoạn chèn trnH-psbA A acutiloba Đề xuất trình tự tham chiếu ITS, matK, đoạn chèn trnH-psbA làm sở liệu so sánh Đề xuất bước để định danh dược liệu A acutiloba phương pháp giải trình tự gen dựa trình tự tham chiếu theo mơ hình Dược điển Anh Phân lập 11 chất từ Angelica acutiloba; rutin isoquercitrin báo cáo giới phân lập từ A acutiloba Thiết lập chuẩn đối chiếu từ A acutiloba Trong Z- ligustilid chuẩn Việt Nam -‐ - ‐ Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời chất acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin Z-ligustilid phương pháp HPLC đầu dò PDA Xây dựng thẩm định quy trình định lượng monosaccharid cấu thành polysaccharid phương pháp thuỷ phân tạo dẫn xuất với PMP, sau phân tích HPLC với đầu dò PDA Tách phân đoạn polysaccharid dựa mức độ không tan EtOH nồng độ khác xác định tỷ lệ monosaccharid phân đoạn phân lập Đã thiết lập "Bảng điểm đánh giá marker" áp dụng cho dược liệu dựa theo tiêu chí WHO Dựa vào nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học dược liệu, xây dựng toàn văn tiêu chuẩn dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận dược điển Đương quy Nhật Bản Đề xuất đổi tên Việt Nam chuyên luận Radix Angelicae acutilobae từ "Đương quy di thực" thành "Đương quy Nhật Bản di thực" Bố cục luận án Luận án gồm 148 trang: Mở đầu trang, tổng quan 33 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết nghiên cứu 61 trang, bàn luận 24 trang, điểm luận án trang, kết luận trang kiến nghị trang Luận án có 64 bảng, 49 hình, sơ đồ, 177 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt 169 tài liệu tiếng Anh, 35 phụ lục thể kết thực nghiệm Cài đặt hệ thống: nhiệt độ cột 25 ºC, tốc độ dịng ml/phút, detector 245 nm, thể tích tiêm 10 µl Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ Mẫu theo Độ hấp thụ Độ hấp thụ Nồng độ Hàm lượng trung bình (mg/ ml) nguyên trạng qui định ICH ĐQ Đắk Nông 0,4934 0,4934 0,0394 82 08 % 0,4933 ĐQ Đơn 0,6823 0,6827 0,0547 88 23 % Dương 0,6830 -‐ 14 -‐ 5 Ứng dụng khảo sát định tính định lượng monosaccharid cấu thành Hình 3-2: Thành phần tỷ lệ monosaccharid mẫu polysaccharid tồn phần Hình 3-3: Thành phần monosaccharid mẫu chưa thuỷ phân, mẫu PĐ20 sau thuỷ phân mẫu chuẩn -‐ 15 -‐ Hình 3-4: Thành phần monosaccharid mẫu chưa thuỷ phân, mẫu PĐ30 sau thuỷ phân mẫu chuẩn Tiêu chuẩn hoá dược liệu đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực cho Dược điển Việt Nam Tiêu chuẩn hóa Chọn lựa tiêu chí kiểm nghiệm theo quy định WHO Tiêu chí Điểm 1 Chưa có nghiên cứu hoạt tính sinhdược học điển Hoạt 2 Khơng có hoạt tính sinh học chọn marker Xây dựng bảng điểm tính Đã có 2 Có 2 Hoạt tính sinh học khơng/chưa có Bảng 3-6: Xâycổdựng Bảng điểm sinh nghiên hoạt liên quan tác dụng trị liệu (trong y học học cứu tính sinh truyền đại) đánh giátrịchọn hoạt học 1222 2 Tác dụng liệu lựa 2marker cho tính Hoạt tính chất sử dụng dược liệu -‐ 16 -‐ sinh học (nhóm sinh học có trị liệu) liên quan gián tiếp (chất hỗ trợ) tác dụng trị liệu (trong y học cổ truyền đại) 1223 Hoạt tính sinh học có liên quan trực tiếp đến tác dụng trị liệu (trong y học cổ truyền đại) không liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 2 2 Tác dụng trị liệu chất sử dụng liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 2 Tác dụng trị liệu chất sử dụng không liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 2 Tác dụng trị liệu 10 chất sử dụng liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu Có Hoạt tính sinh học liên quan trực hoạt triếp đên độc tính dược liệu tính sinh 3 Hoạt tính sinh học khơng liên học quan trực triếp đên độc tính dược liệu (nhóm độc tính) 124 Là chất có liên quan đến chất có ½* Nhóm hoạt tính sinh học, hoạt tính trị liệu (tiền điểm chất, sản phẩm chất chuyển hóa phụ sinh phản ứng hóa học enzym) học 21 Hàm lượng thấp < µg/g Khả Hàm Hàm lượng trung bình 5-50 µg/g lượng Hàm lượng cao > 50 µg/g phân 2 Có tính điểm địa lý đặc trưng cho dướ i tích Tính lồi -‐ 17 -‐ đặc trưng 23 chất chuẩn Đặc trưng cho loài chi Đặc trưng cho chi Có sẵn Chưa có 1 * ½ số điểm nhóm Chọn marker dựa tài liệu tham khảo Bảng 3-7: Kết chọn marker Đã chọn làm marker cho dược liệu mang tên Đương Quy Có tác dụng trị liệu liên quan đến tác dụng trị liệu dược liệu Tác dụng sinh học hỗ trợ tác dụng trị liệu Đã có thực đánh giá chuẩn Có thể chiết xuất, định tính định lượng Hàm lượng cao dược liệu Có tính đặc trưng Có độc tính CGA LIG khảo dựaSCO trênFA tài XAN liệu tham x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Nhận xét: Dựa Bảng 6, đưa marker có khả acid chlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin, Zligustilid Chọn marker dựa thực nghiệm: xác định tính đặc trưng TLC HPLC -‐ 18 -‐ Z-ligustdXanhoxAcferSpidlgn HPLCT H Bảng3-8:TổkếtquháosíđặcưrêLCvàHP CTL Dựavàothmkảilệucng,ọadhoreispltcfu, + + + + - - - + + + + - - - - + - - + - - - + - - + - - + + + + + + + - - - - - - - - + - - - - - ND ND ND ND ND ND ND + + + + + + + ND ND ND ND ND ND ND Levistcumofnal Ligustcmwalh Angelicadhur Angelicapubs Angelicas Đỉnh/vết Angelicautob Angelicas xanthoivàZ-lgusdđểcấm -‐ 19 -‐ Tổng kết kết chọn matker Bảng 3-9: Kết chấm điểm Đặc điểm CGA SCO marker FA XAN Hoạt tính sinh hoc 2 10 11 10 Hóa học-phân tích 2 Cộng 12 18 15 LIG Kết luận: Dựa điểm số, chọn xanthotoxin Z-ligustilid làm marker Xác định mức chất lượng marker Đánh giá hàm lượng xanthotoxin z-ligustild vùng nguyên liệu Đak Nông, Đà Lạt, Đơn Dương, Quảng Nam Lào Cai Từ xác định mức chất lượng xanthotoxin:”không Chỉ tiêu Mô tả Mức chất lượng 0,015%” zPhương Ghi pháp :”Khơng ligustilid Rễ ngắn mập, dài 0,05%” 10-20 cm, đường kính cm trở lên, có nhiều rễ nhánh dài3 Chuyên Tómluận tắt dự thảo đề xuất 15-20 cm, đường kính 0,2 cấpquy chuyên luận Đương quy cm trở lên Mặt màu nâng Đương nâu tối, có nhiều nếp nhăn di thực, Nhật Bản di thực dọc, nhiều sẹo lồi nằm ngang DĐVN vết tích củaBảng rễ con3-10: Mặttóm cắt tắt dự thảo chuyên luận Đương quy ngang màu trắng ngà có vân thực trịn nhiều Nhật điểm Bản tinh di dầu -‐ 20 -‐ Soi bột Định tính TLC Mất khối lượng làm khơ Tro khơng tan acid Tro tồn phần Mùi thơm hắc, vị nhẹ, sau cay nóng Có nhiều hạt tinh bột hình trịn hay hình trứng nhỏ đứng riêng lẻ hay đám, đường Chuyên luận kính từ 5-20 µm Mảnh mạch Đương quy mạng, mạch xoắn, mạch di thực, điểm Mảnh mơ mềm có DĐVN nhiều hạt tinh bột, rải rác có giọt dầu màu vàng nhạt Chuyên luận So sánh với dược liệu chuẩn Đương quy di thực, DĐVN Phương pháp Tham sấy, Phụ lục ≤≤ 15 % khảo 6, DĐVN BP, EP ≤≤ 4,5 % Phụ lục 7, DĐVN ≤≤ % Phụ lục 8, Tham DĐVN khảo JP Chuyên luận Đương quy di thực, DĐVN Chuyên luận Đương quy di thực, DĐVN Phụ lục 12 7, DĐVN Thân hoa: ≤≤ % Khác ≤≤ % Tạp chất Chất chiết dược ≥ 35 % liệu 10 Định lượng ≥ 0,1 % tinh dầu tính theo tinh dầu dược liệu khô Định lượng Xanthotoxin ≥ 0,15 mg/g dược liệu Z-ligustilid ≥ mg/g dược liệu Bổ sung Theo dự thảo tiêu chuyên luận đề xuất -‐ 21 -‐ Thiết lập chuẩn dược liệu Dược liệu xác định tên khoa học phương pháp giải trình tự gen ITS, kiểm tra phận dùng vi phẫu soi bột Đánh giá chất lượng dược liệu theo dự thảo chuyên luận đề xuất Kết Chỉ tiêu kết Yêu cầu Mô tả Soi bột Như Bảng 3-10 Bảng 3-11: Đúng Kết kiểm tra chất Như Bảng 3-10 Đúng Định tính TLC Như Bảng 3-10 Mất khối lượng làm ≤≤ 15 % khô ≤≤ 4,5 % Đạt (3,08 %) Tro không tan acid Tro toàn phần ≤≤ % Đạt (5,75 %) Tạp chất Thân hoa: ≤≤ % Khác ≤≤ % Đạt (0 %) Chất chiết từ dược liệu ≥ 35 % Đạt (37,49 %) Định lượng tinh dầu ≥ 0,1 % tinh dầu tính Đạt (0,1 %) theo dược liệu khơ kiệt 10 Định lượng (Tính dược liệu khơ kiệt) Xanthotoxin ≥ 0,15 mg/g Z-ligustilid ≥ 0,5 mg/g lượng dược liệu Đúng Đạt (10,09 %) Đạt (0,26 mg/g) Đạt (1,65 mg/g) Dược liệu đạt chất lượng đóng lọ 5g/lọ kiểm tra độ đồng lọ, thiết lập hồ sơ dược liệu chuẩn dán nhãn -‐ 22 -‐ KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã mô tả thực vật, phân tích hoa vi phẫu Đương quy Nhật Bản trồng Việt a Nam Luận án chiết tách DNA 17 mẫu dược liệu mang tên Đương quy, khuếch đại giải trình tự trình tự gen ITS, trnH-psbA, rbcL matK định danh 17 mẫu nghiên cứu Đã phân tích xác định trình tự phù hợp để định danh dược liệu mang tên Đương quy Đề xuất trình tự tham chiếu ITS, trnH-psbA matK cho dược liệu A acutiloba Đề xuất bước để định danh dược liệu A acutiloba phương pháp giải trình tự gen dựa trình tự tham chiếu theo mơ hình Dược điển Anh Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc 11 hợp chất từ Đương quy Nhật Bản: (1) hợp chất thuộc khung phthalid Z-ligustilid, senkyunolid I, senkyunolid H, (2) hợp chất thuộc khung furanocouarin psoralen, xanthotoxin, bergapten isopimpinellin, (3) hợp chất phenylpropanoid acid chlorogenic acid ferulic (4) flavonoid rutin isoquercitrin Đây báo cáo giới phân lập rutin isoquercitrin từ Angelica acutiloba Đã thiết lập chuẩn đối chiếu hóa học (acid chlorogenic, acid ferulic, xanthotoxin Z-ligustilid) từ rễ Đương quy Nhật Bản với liệu chuẩn bao gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR Đã xây dựng quy trình đánh giá chất chuẩn -‐ 23 -‐ áp dụng Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chất acid cacid ferulic, hscopoletin, lxanthotoxin o r o g e n i c , Z-ligustilid dược liệu Đương quy Đã áp dụng quy trình để khảo sát 12 mẫu dược liệu mang tên Đương quy, có mẫu dược liệu có nguồn gốc Trung Quốc Nhật Bản, mẫu có nguồn gốc nước Luận án khảo sát phương pháp chiết xuất, thủy phân định tính, định lượng monosaccharid tạo thành polysaccharid dược xanthotoxin liệu Đã áp dụng quy 0,15 mg/g Z-ligustilid 0,5 trình để khảo mg/g dược liệu Từ sát monosaccharid tạo xây dựng tiêu chuẩn đề xuất thành polysaccharid toàn dự thảo toàn văn chuyên luận phần "Dược liệu Đương quy Nhật mẫu dược liệu Bản di thực (rễ) Radix monosaccharid tạo thành Angelicae acutilobae" cho Dược điển Việt phân đoạn nam: polysaccharid tách chiết Từ tính tỷ lệ mol tạo thành carbohydrat toàn phần mẫu phân đoạn polysaccharid Luận án xây dựng bảng điểm để đánh giá chọn lựa marker cho dược liệu dựa yêu cầu WHO Đã áp dụng bảng điểm để chọn lựa đề xuất marker cho dược liệu Đương quy Nhật Bản xanthotoxin Zligustilid Đã khảo sát hàm lượng marker vùng dược liệu khác xác định mức giới hạn chất lượng -‐ 24 -‐ Thiết lập dược liệu chuẩn đối chiếu cho Radix Angelica acutilobae Các khảo sát cho thấy Đương quy Nhật Bản Đương quy Trung Quốc khác thành phần hóa học phân biệt nhờ vào định danh DNA phương pháp hoá học Kiến nghị Căn vào nghiên cứu dược liệu Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam, đề xuất Hội đồng Dược điển Việt Nam xem xét lấy ý kiến tiến hành khảo nghiệm để nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực lần xuất Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm in vitro in vivo định hướng trị liệu Từ đó, có mở rộng hướng dẫn cụ thể cho việc sử dụng dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực văn pháp lý Nghiên cứu phân lập tinh chế polysaccharid dược liệu Thử hoạt tính in vitro in vivo polysaccharid tinh chế từ dược liệu Áp dụng phương pháp phân tích monosaccharid để phân biệt dược liệu theo dấu địa lý Hiện nay, Đương quy Nhật Bản trồng phát triển tốt nhiều vùng khác Việt Nam Việc phát triển ạt vùng ngun liệu khơng có hướng tiêu thụ dẫn đến việc ùn ứ nơng sản có nguy vùng nguyên liệu kéo dài Vì vậy, cần phải có định hướng hợp lý để tiêu thụ, xuất ... thời số chất dược liệu Radix Angelicae acutilobae Tiêu chuẩn hoá dược liệu từ Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam, từ thiết lập dược liệu đối chiếu rễ Đương quy Nhật Bản Radix Angelicae acutilobae... cấp thiết trên, đề tài: "Tiêu chuẩn hóa dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực từ Angelica acutiloba (Sieb et Zucc ) Kitagawa trồng Việt Nam" thực với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn thiết lập sở khoa... trúc số thành phần hóa học Angelica acutiloba (Sieb et Zucc ) Kitagawa Thiết lập số chất đối chiếu hóa học đặc trưng cho dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực Radix Angelicae acutilobae Xây dựng