Tiêu chuẩn hóa dược liệu Đương qui Nhật Bản di thực từ rễ củ cây Angelica acutiloba (Sieb. et Zucc.) Kitagawa trồng tại Việt Nam

TÓM TẮT NHỮNG KẾT LUẬN MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đánh giá mức độ phân biệt của 4 trình tự DNA: ITS, rbcL, matK, đoạn chèn trnH-psbA trên Angelica acutiloba. Đề xuất trình tự tham chiếu của ITS, matK, đoạn chèn trnH-psbA làm cơ sở dữ liệu so sánh. Đề xuất các bước để định danh dược liệu A. acutiloba bằng phương pháp giải trình tự gen dựa trên trình tự tham chiếu theo mô hình Dược điển Anh. 2. Phân lập 11 chất từ A. acutiloba, trong đó rutin và isoquercitrin là báo cáo đầu tiên trên thế giới phân lập từ A. acutiloba. 3. Thiết lập 4 chuẩn đối chiếu từ A. acutiloba. 4. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng 5 chất acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin và Z-ligustilid bằng phương pháp HPLC đầu dò PDA. 5. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng các monosaccharid cấu thành polysaccharid bằng phương pháp thủy phân và tạo dẫn xuất với PMP, sau đó phân tích bằng HPLC với đầu dò PDA. Tách các phân đoạn polysaccharid dựa trên mức độ không tan trong EtOH ở các nồng độ khác nhau và xác định tỷ lệ monosaccharid của các phân đoạn phân lập được. Thiết lập một "Bảng điểm đánh giá marker" áp dụng cho các dược liệu dựa theo các tiêu chí của WHO. Xây dựng toàn văn dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận dược điển Đương quy Nhật Bản. Đề xuất đổi tên Việt Nam của chuyên luận Radix Angelicae acutilobae từ "Đương quy di thực" thành "Đương quy Nhật Bản di thực".

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - PHẠM THỊ MINH TÂM TIÊU CHUẨN HOÁ DƯỢC LIỆU ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN DI THỰC TỪ CÂY ANGELICA ACUTILOBA (SIEB ET ZUCC.) KITAGAWA TRỒNG TẠI VIỆT NAM Ngành: Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số: 62.72.04.10 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y/DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh, năm 2022 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nguyễn Văn Thanh TS Lê Thị Thu Cúc Phản biện 1: ……………………………………………… Phản biện ……………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP HCM - Thư viện Đại học Y Dược TP HCM DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Phạm Thị Minh Tâm, Thạch Giang , Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Ngọc Vinh , Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Phân lập tinh chế Z ligustilid từ Đương Quy Nhật Bản làm chất đối chiếu”, Tạp chí Dược học, Số 498, năm 57, Số 10/2017, tr 55-58 Phạm Thị Minh Tâm, Hồ Xuân Hương , Lê Khánh Trúc Diễm, Nguyễn Ngọc Vinh, Nguyễn Văn Thanh, (2018), “Ứng dụng kỹ thuật DNA barcoding định danh số giống đương quy lưu hành Việt Nam”, Tạp chí Dược học, Số 501, năm 58, Số 01/2018, tr 63-67 Phạm Thị Minh Tâm, Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Văn Thanh, (2020), "Phân lập furanocoumarin từ rễ Angelica acutiloba Kitagawa trồng Lâm Đồng”,Tạp chí Y Dược học, Số 8, tháng 11/2020, tr 37-41 Thi Minh Tam Pham, Thi Thu Cuc Le, Van Thanh Nguyen, Viet Hung Tran, (2021), “Simultaneous quantitative analysis of five components in Angelica sinensis and Angelica acutiloba acclimatized growing in vietnam by high-performance liquid chromatography with photodiode array detector”,World Journal of Traditional Chinese Medicine, Volume | Issue | January-March 2021, DOI: 10.4103/wjtcm.wjtcm_28_20 Pham T.M.T., Le T.T.C., Tran V.H., Nguyen V.T (2021), “Isolation and identification of two flavonoid compounds from acclimatized Angelica acutiloba Kitagawa growing in Vietnam”, World Journal of Traditional Chinese Medicine, 2021(x), xx-xx (Accepted by July 1st, 2021) -­‐  1  -­‐     GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Đương quy dược liệu quý phổ biến Đông y, đa phần dược liệu Đương quy (Angelica sinensis) nhập từ Trung quốc Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) trồng nhiều tỉnh khu vực miền Trung, Tây Nguyên Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắk Lắk, Quảng Nam, tỉnh vùng núi phía Bắc Lào Cai, Sơn La, Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đại vào công tác kiểm nghiệm, đánh giá chất lượng dược liệu yêu cầu cấp bách cần thiết để theo kịp với giới, phục vụ cho nhu cầu xã hội, động thái để tìm đầu cho Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) nhân dân trồng quy mô công nghiệp Mục tiêu nghiên cứu Vì tính chất cấp thiết trên, đề tài: "Tiêu chuẩn hóa dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực từ Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.) Kitagawa trồng Việt Nam" thực với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn thiết lập sở khoa học nhằm đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận "Đương quy di thực" với mục tiêu cụ thể sau:   Định danh thuốc Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.) Kitagawa phương pháp phân tích thực vật giải trình tự gen -­‐  2  -­‐       Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc số thành phần hóa học Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.) Kitagawa   Thiết lập số chất đối chiếu hóa học đặc trưng cho dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực Radix Angelicae acutilobae   Xây dựng quy trình định tính định lượng đồng thời số chất dược liệu Radix Angelicae acutilobae   Tiêu chuẩn hoá dược liệu từ Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam, từ thiết lập dược liệu đối chiếu rễ Đương quy Nhật Bản Radix Angelicae acutilobae Đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận "Đương quy Nhật Bản di thực (rễ) Radix Angelicae acutilobae" Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn   Đánh giá mức độ phân biệt trình tự ITS, rbcL, matK, đoạn chèn trnH-psbA A acutiloba Đề xuất trình tự tham chiếu ITS, matK, đoạn chèn trnH-psbA làm sở liệu so sánh Đề xuất bước để định danh dược liệu A acutiloba phương pháp giải trình tự gen dựa trình tự tham chiếu theo mơ hình Dược điển Anh   Phân lập 11 chất từ Angelica acutiloba; rutin isoquercitrin báo cáo giới phân lập từ A acutiloba   Thiết lập chuẩn đối chiếu từ A acutiloba Trong Z- ligustilid chuẩn Việt Nam -­‐  3  -­‐       Xây dựng thẩm định quy trình định lượng đồng thời chất acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin Z-ligustilid phương pháp HPLC đầu dò PDA   Xây dựng thẩm định quy trình định lượng monosaccharid cấu thành polysaccharid phương pháp thuỷ phân tạo dẫn xuất với PMP, sau phân tích HPLC với đầu dò PDA Tách phân đoạn polysaccharid dựa mức độ không tan EtOH nồng độ khác xác định tỷ lệ monosaccharid phân đoạn phân lập   Đã thiết lập "Bảng điểm đánh giá marker" áp dụng cho dược liệu dựa theo tiêu chí WHO Dựa vào nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học dược liệu, xây dựng tồn văn tiêu chuẩn dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận dược điển Đương quy Nhật Bản Đề xuất đổi tên Việt Nam chuyên luận Radix Angelicae acutilobae từ "Đương quy di thực" thành "Đương quy Nhật Bản di thực" Bố cục luận án Luận án gồm 148 trang: Mở đầu trang, tổng quan 33 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết nghiên cứu 61 trang, bàn luận 24 trang, điểm luận án trang, kết luận trang kiến nghị trang Luận án có 64 bảng, 49 hình, sơ đồ, 177 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt 169 tài liệu tiếng Anh, 35 phụ lục thể kết thực nghiệm -­‐  4  -­‐     Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trình bày vấn đề sau   Tổng quan dược liệu mang tên Đương quy   Thành phần hóa học Đương quy Nhật Bản   Tác dụng dược lý Đương quy Nhật Bản   Tổng quan tiêu phương pháp kiểm nghiệm   Tổng quan tiêu chuẩn hóa dược liệu, chuẩn đối chiếu chất đánh dấu Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam, Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.) Kitagawa, hợp chất tự nhiên thành phần hố học chọn làm chuẩn đối chiếu Ngun liệu dùng cho nghiên cứu thân, rễ củ Đương quy tươi khô qua chế biến thành dược liệu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Định danh thuốc phân tích thực vật giải trình tự gen 2.2.2 Chiết xuất, phân lập, tinh chế xác định cấu trúc 2.2.3 Thiết lập chuẩn đối chiếu từ dược liệu 2.2.4 Xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin Z-ligustilid 2.2.5 Phân tích carbohydrat -­‐  5  -­‐     2.2.6 Tiêu chuẩn hoá đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực (rễ) Radix Angelicae acutilobae 2.2.7 Thiết lập chuẩn dược liệu Radix Angelicae acutilobae Chương 3: KẾT QUẢ 3.1 - Định danh dược liệu Bảng 3-1: Khoảng cách loài ITS trnH-psbA rbcL matK (#600bp) (#220 bp) (#500bp) (#800 bp) A gigas 0,0164 1,0423 0,0013 0,0195 A sinensis 8,1889 1,5399 0.0027 0,0308 Levisticum officinale 7,6995 1,4055 0,0028 0,0146 Từ phân loài khoảng cách loài, chọn ITS > trnH-psbA > matK làm marker sinh học để định danh dược liệu Angelica acutiloba Xác định trình tự tham chiếu trình tự key base đoạn trình tự/gen sau: Trình tự ITS có 618 base với 98 key base: TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGTCGAATCCTGCAATAG CAGAATGACCCGCTAACACGtcaacattttgggcgAGCGTCGGGGGGCCTC GGTCTCCTGTCTGCGAATCCCTGGTAGGTggccactcccgggtggCCACTG GCCTGCAAAATCATTCGGGCGCGGAATGCGCCAAGGACCTTAAAA CTGAATTGTACGTCCGTATCCCGTTagcgggcaccggcgtcattccaaaacACAA CGACTCTCGACAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACG TAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCA   -­‐  6  -­‐   TCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCACTAGGCTgagggca cgcctgcctgggtgtcacgcatcgtcttgcccacAAACCACTCACACCTGAGAAGTTG TGCCGGTTTGGGGCGGAAACTGGCCTCCCGTACCTTGTCGTGCGGT TGGCGGAAAAACGAGTCTCCGGCGACGGACGTCGCGACATCGGTG GTTGTAAAAGACCCTCTTGTCTTGTCGTGCGAATCCTCGTCATCTTA GCGAGCTCCAGGACCCTTAGGCAGCACACACTCTGTGCGCTTCGAC TGTGACCCCAGGTCAGGCGGGACTACCCGCTGAGTTTAAGCATATC AATAAG Trình tự đoạn chèn trnH-psbA có 268 base với 41 key base: CTTGGCTACATCCGCCCCGCCAattttcttttatttatttattaaatatttattaAAGaaa aaaaaGGATTCCTTTTTGATCATTCAAAAATATTTGTTTATCTAAAAC AGTCTGAAATATAAAAAGAAGAAATACCGCCCTCTTGATAGAACA AGAGGGCGGTATTTCTTCTTTTTATTTCAAAAAACTCGTATATACTA AAACCCGGTCTTACCCATTTGTAGATGGAGCTTCAACAGCAGCTAG GTCTAGAGGAAAGTTATGAGCATTACGTTCGTGCATAAC Trình tự gen matK có 816 base vói 75 key base AGTCGAAGTATATACTTTATTCGATACAAACTCtttttttGTGAGGATCC ACTATAATAATGAGAAATATTTCTGcagatacgcccaaatcggacaacAATAT CAGAATCTGATAAATCAGTCCAAACCGCCTTACTAATAGGGTGCCC CAATACGTTACAAAATCTCGCCTTAGacaaTGATCCAATTAGAGGAA CAATTGGAACAAGAGTATCGAACTTATTAATAGGATTATCAATTAT AAATGCATTTTCTAGCATTTGACTGCGTACCATTGAAGGGTTTAGT CGCGCACTTGATAGATAGCCCAGAAGAGCTAGGGAATGATTATAT AATTGGTTTATACAGATCCGTCCCGGCTGAGACCATAGGTAAAAAT GACATTTCCATAAATtgacaaaataatatgtccattttttcatcaaaaggggcgtcCCTTT -­‐  10  -­‐     3.3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng Bảng 3-2: Điều kiện sắc ký lỏng hiệu cao   Hợp chất CGA FA XAN LIG Nhiệt độ Cột Tốc độ dịng Nồng độ (µg/ml) 200 200 250 200 Pha động Bước sóng ACN - AcOH % (gradient) ACN - dd AcOH 1% (17:83) ACN - nước (50:50) ACN - dd AcOH 1% (65:35) 30ºC Gemini NX C18 (150 x 4,6mm); µm ml/phút 325 316 248 328 Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ theo qui định ICH 3.3.2 Xây dựng tiêu chuẩn chất chuẩn đối chiếu Bảng 3-3: Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất đối chiếu Chỉ tiêu Mô tả/cảm quan Định tính UV (λmax) CGA FA XAN LIG Bột vơ định Bột vơ định Tinh thể hình Dung dịch hình màu hình màu kim, màu màu vàng trắng xám trắng xám trắng nhạt 217 ± nm, 216 ± nm, 218 ± nm, 334 ± nm 316 ± nm 248 ± nm, 301 ± nm 280 ± nm, 328 ± nm TLC IR HPLC Mẫu thử có màu Rf trùng với mẫu chuẩn Phổ IR trùng với phổ IR chất chuẩn Thời gian lưu trùng với đỉnh chuẩn Điểm chảy 204-210 °C 168-174 °C 146-148 °C NA Độ ẩm £ % £ % £ % NA Định lượng Tạp chất liên quan ≥ 95 % ≥ 95 % ≥ 95 % ≥ 95 % £ % £ % £ % £ % -­‐  11  -­‐     3.3.3 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu Bảng 3-4: Giá trị ấn định độ không đảm bảo đo Hoạt chất CGA FA XAN LIG Giá trị ấn định (%) 98,19 97,92 96,30 96,45 Độ lệch chuẩn (s) 0,684 1,211 0,356 0,678 Độ không đảm bảo đo U(x) 0,200 0,356 0,106 0,200 3.4 Định lượng đồng thời acid chlorogenic, scopoletin, acid ferulic, xanthotoxin Z-ligustilid dược liệu 3.4.1 Chọn lựa chất theo tài liệu tham khảo Z-ligustilid acid ferulic đóng vai trị trị liệu dược liệu, acid chlorogenic, xanthotoxin z-ligustilid có hàm lượng cao dược liệu, acid chlorogenic scopoletin có tác dụng hỗ trợ trị liệu scopoletin xanthotoxin có tính đặc trưng xanthotoxin cho có độc tính (khi kết hợp với UV) 3.4.2 Chọn lựa phương pháp chiết xuất Chiết siêu âm h, 10 ml MeOH cho g dược liệu 3.4.3 Thẩm định quy trình Điều kiện sắc ký Pha động: Hệ dung môi ACN: AcOH 1%, gradient Pha tĩnh: Cột Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm); 5µm Cài đặt hệ thống: nhiệt độ cột: 30 0C, tốc độ dòng ml/min, detector 321 nm, thể tích tiêm: 10µl -­‐  12  -­‐     Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ theo qui định ICH 3.4.4 Ứng dụng quy trình khảo sát mẫu dược liệu Hình 3-1: So sánh tương quan hàm lượng chất dược liệu Đương quy khác Nhận xét: Các điểm khác biệt thành phần hoá học rễ A acutiloba A sinensis:   Xanthotoxin scopoletin có A acutiloba khơng có A sinensis,   Hàm lượng acid ferulic Z-ligustilid A sinensis cao A acutiloba 3.5 Phân tích carbohydrat 3.5.1 Chọn lựa, tối ưu hóa điều kiện chiết xuất Điều kiện chiết xuất: tỉ lệ nước: dược liệu = 10, 80 ºC thời gian 3.5.2 Định lượng polysaccharid toàn quy sang glucose phương phápđo quang với thuốc thử phenol sulfuric -­‐  13  -­‐     Thực phản ứng tạo dẫn xuất furan tạo màu với phenol Đo quang 490 nm Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ theo qui định ICH Bảng 3-5: Kết định lượng hàm lượng polysaccharid quy glucose Mẫu Độ hấp thụ Độ hấp thụ Nồng độ Hàm lượng trung bình (mg/ ml) nguyên trạng ĐQ Đắk Nông 0,4934 0,4934 0,0394 82.08 % 0,4933 ĐQ Đơn 0,6823 0,6827 0,0547 88.23 % Dương 0,6830 3.5.3 Tối ưu hóa phản ứng thủy phân Điều kiện tối ưu 120 °C nồng độ TFA M 3.5.4 Định tính định lượng đồng thời monosaccharid cấu thành polysaccharid Pha động: Hệ dung môi ACN: Amonium acetat 20 nM, gradient Pha tĩnh: cột Gemini NX C18 (250 x 4,6 mm); µm Cài đặt hệ thống: nhiệt độ cột 25 ºC, tốc độ dòng ml/phút, detector 245 nm, thể tích tiêm 10 µl Dữ liệu thẩm định cho thấy phương pháp đạt tất yêu cầu tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ theo qui định ICH -­‐  14  -­‐      5.5 Ứng dụng khảo sát định tính định lượng monosaccharid cấu thành Hình 3-2: Thành phần tỷ lệ monosaccharid mẫu polysaccharid toàn phần Hình 3-3: Thành phần monosaccharid mẫu chưa thuỷ phân, mẫu PĐ20 sau thuỷ phân mẫu chuẩn -­‐  15  -­‐     Hình 3-4: Thành phần monosaccharid mẫu chưa thuỷ phân, mẫu PĐ30 sau thuỷ phân mẫu chuẩn 3.6 Tiêu chuẩn hoá dược liệu đề xuất dự thảo nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực cho Dược điển Việt Nam 3.6.1 Tiêu chuẩn hóa Chọn lựa tiêu chí kiểm nghiệm theo quy định WHO dược điển Xây dựng bảng điểm chọn marker Bảng 3-6: Xây dựng Bảng điểm đánh giá chọn lựa marker cho dược liệu Hoạt tính sinh học Tiêu chí Điểm 1.1 Chưa có nghiên cứu hoạt tính sinh học 1.2 1.2.1 Khơng có hoạt tính sinh học Đã có 1.2.2 Có 1.2.2.1 Hoạt tính sinh học khơng/chưa có nghiên hoạt liên quan tác dụng trị liệu (trong y học cổ cứu tính sinh truyền đại) hoạt học 1.2.2.2 1.2.2.2.1 Tác dụng trị liệu tính Hoạt tính chất sử dụng -­‐  16  -­‐     sinh học (nhóm sinh học có trị liệu) liên quan gián tiếp (chất hỗ trợ) tác dụng trị liệu (trong y học cổ truyền đại) 1.2.2.3 Hoạt tính sinh học có liên quan trực tiếp đến tác dụng trị liệu (trong y học cổ truyền đại) không liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 1.2.2.2.2 Tác dụng trị liệu chất sử dụng liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 1.2.2.3.1 Tác dụng trị liệu chất sử dụng không liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 1.2.2.3.2 Tác dụng trị liệu chất sử dụng liên quan đến việc sử dụng y học cổ truyền/ y học đại dược liệu 1.2.3 Có 1.2.3.1 Hoạt tính sinh học liên quan trực hoạt triếp đên độc tính dược liệu tính sinh 1.2.3.3 Hoạt tính sinh học không liên học quan trực triếp đên độc tính dược liệu (nhóm độc tính) 1.2.4 Là chất có liên quan đến chất có Nhóm hoạt tính sinh học, hoạt tính trị liệu (tiền điểm chất, sản phẩm chất chuyển hóa phụ sinh phản ứng hóa học enzym) học 2.1 Hàm lượng thấp < µg/g Khả Hàm Hàm lượng trung bình 5-50 µg/g lượng Hàm lượng cao > 50 µg/g phân 2.2 Có tính điểm địa lý đặc trưng cho tích Tính lồi 10 ½* -­‐  17  -­‐     đặc trưng 2.3 chất chuẩn Đặc trưng cho lồi chi Đặc trưng cho chi Có sẵn Chưa có 1 * ½ số điểm nhóm Chọn marker dựa tài liệu tham khảo Bảng 3-7: Kết chọn marker dựa tài liệu tham khảo Đã chọn làm marker cho dược liệu mang tên Đương Quy Có tác dụng trị liệu liên quan đến tác dụng trị liệu dược liệu Tác dụng sinh học hỗ trợ tác dụng trị liệu Đã có thực đánh giá chuẩn Có thể chiết xuất, định tính định lượng Hàm lượng cao dược liệu Có tính đặc trưng Có độc tính CGA SCO FA XAN LIG x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Nhận xét: Dựa Bảng 6, đưa marker có khả acid chlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin, Z-ligustilid Chọn marker dựa thực nghiệm: xác định tính đặc trưng TLC HPLC ND ND ND ND ND ND Angelica acutiloba Levisticum officinale Ligusticum walchilli Angelica gigas Angelica dahurica Angelica pubescens ND ND + + ND ND ND ND ND + + + + + - - - - - - - - - + - - - + + + - - + - + - - - - + - - + + + + + + + + - + + - - - + + + HPLC TLC HPLC TLC HPLC TLC HPLC TLC HPLC Dựa vào tham khảo tài liệu thực nghiệm, chọn acid chlorogenic, scopoletin, acidferulic, xanthotoxin Z-ligustlid để chấm điểm ND TLC Acid chlorogenic Scopoletin Acid ferulic Xanthotoxin Z-ligustilid Angelica sinensis Đỉnh / vết Bảng 3-8: Tổng kết kết khảo sát tính đặc trưng TLC HPLC   -­‐  18  -­‐   -­‐  19  -­‐     Tổng kết kết chọn matker Bảng 3-9: Kết chấm điểm marker Đặc điểm CGA SCO FA XAN LIG Hoạt tính sinh hoc 2 10 11 10 Hóa học-phân tích 2 Cộng 12 18 15 Kết luận: Dựa điểm số, chọn xanthotoxin Z-ligustilid làm marker Xác định mức chất lượng marker Đánh giá hàm lượng xanthotoxin z-ligustild vùng nguyên liệu Đak Nông, Đà Lạt, Đơn Dương, Quảng Nam Lào Cai Từ xác định mức chất lượng xanthotoxin:”khơng 0,015%” z-ligustilid :”Không 0,05%” 3.6.2 Tóm tắt dự thảo đề xuất nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực Bảng 3-10: tóm tắt dự thảo chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực Phương pháp Chỉ tiêu Mức chất lượng Mô tả Rễ ngắn mập, dài 10-20 cm, đường kính cm trở lên, có nhiều rễ nhánh dài 15-20 cm, đường kính 0,2 Chuyên luận cm trở lên Mặt ngồi màu Đương quy nâu tối, có nhiều nếp nhăn di thực, dọc, nhiều sẹo lồi nằm ngang DĐVN vết tích rễ Mặt cắt ngang màu trắng ngà có vân trịn nhiều điểm tinh dầu Ghi   10 -­‐  20  -­‐   Mùi thơm hắc, vị nhẹ, sau cay nóng Có nhiều hạt tinh bột hình trịn hay hình trứng nhỏ đứng riêng lẻ hay đám, đường Chuyên luận kính từ 5-20 µm Mảnh mạch Đương quy Soi bột mạng, mạch xoắn, mạch di thực, điểm Mảnh mơ mềm có DĐVN nhiều hạt tinh bột, rải rác có giọt dầu màu vàng nhạt Chuyên luận Định tính Đương quy So sánh với dược liệu chuẩn TLC di thực, DĐVN Phương pháp Mất khối Tham sấy, Phụ lục lượng £ 15 % khảo 9.6, DĐVN làm khô BP, EP Tro không Phụ lục 9.7, tan £ 4,5 % DĐVN acid Tro toàn Phụ lục 9.8, Tham £ % phần DĐVN khảo JP Chuyên luận Thân hoa: £ % Đương quy Tạp chất di thực, Khác £ % DĐVN Chuyên luận Chất chiết Đương quy dược ≥ 35 % di thực, liệu DĐVN Định lượng ≥ 0,1 % tinh dầu tính theo Phụ lục 12.7, tinh dầu dược liệu khô DĐVN Định lượng Bổ sung Theo dự thảo tiêu Xanthotoxin ≥ 0,15 mg/g dược liệu chuyên luận Z-ligustilid ≥ 0.5 mg/g dược liệu đề xuất -­‐  21  -­‐     3.7 Thiết lập chuẩn dược liệu Dược liệu xác định tên khoa học phương pháp giải trình tự gen ITS, kiểm tra phận dùng vi phẫu soi bột Đánh giá chất lượng dược liệu theo dự thảo chuyên luận đề xuất Bảng 3-11: Kết kiểm tra chất lượng dược liệu Chỉ tiêu kết Yêu cầu Mô tả Như Bảng 3-10 Soi bột Như Bảng 3-10 Định tính TLC Như Bảng 3-10 Mất khối lượng làm £ 15 % khô Tro khơng tan £ 4,5 % acid Tro tồn phần £ % Kết Đúng Đúng Đúng Đạt (10,09 %) Đạt (3,08 %) Đạt (5,75 %) Đạt (0 %) Thân hoa: £ % Khác £ % Chất chiết từ dược liệu ≥ 35 % Đạt (37,49 %) Định lượng tinh dầu ≥ 0,1 % tinh dầu tính Đạt (0,1 %) theo dược liệu khơ kiệt 10 Định lượng (Tính dược liệu khơ kiệt) Xanthotoxin ≥ 0,15 mg/g Đạt (0,26 mg/g) Z-ligustilid ≥ 0,5 mg/g Đạt (1,65 mg/g) Tạp chất Dược liệu đạt chất lượng đóng lọ 5g/lọ kiểm tra độ đồng lọ, thiết lập hồ sơ dược liệu chuẩn dán nhãn -­‐  22  -­‐     KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận   Đã mơ tả thực vật, phân tích hoa vi phẫu Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam a Luận án chiết tách DNA 17 mẫu dược liệu mang tên Đương quy, khuếch đại giải trình tự trình tự gen ITS, trnH-psbA, rbcL matK định danh 17 mẫu nghiên cứu Đã phân tích xác định trình tự phù hợp để định danh dược liệu mang tên Đương quy Đề xuất trình tự tham chiếu ITS, trnH-psbA matK cho dược liệu A acutiloba Đề xuất bước để định danh dược liệu A acutiloba phương pháp giải trình tự gen dựa trình tự tham chiếu theo mơ hình Dược điển Anh   Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc 11 hợp chất từ Đương quy Nhật Bản: (1) hợp chất thuộc khung phthalid Z-ligustilid, senkyunolid I, senkyunolid H, (2) hợp chất thuộc khung furanocouarin psoralen, xanthotoxin, bergapten isopimpinellin, (3) hợp chất phenylpropanoid acid chlorogenic acid ferulic (4) flavonoid rutin isoquercitrin Đây báo cáo giới phân lập rutin isoquercitrin từ Angelica acutiloba   Đã thiết lập chuẩn đối chiếu hóa học (acid chlorogenic, acid ferulic, xanthotoxin Z-ligustilid) từ rễ Đương quy Nhật Bản với liệu chuẩn bao gồm điểm chảy, phổ UV, IR, MS, NMR Đã xây dựng quy trình đánh giá chất chuẩn -­‐  23  -­‐     áp dụng Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh   Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chất acid chlorogenic, acid ferulic, scopoletin, xanthotoxin Z-ligustilid dược liệu Đương quy Đã áp dụng quy trình để khảo sát 12 mẫu dược liệu mang tên Đương quy, có mẫu dược liệu có nguồn gốc Trung Quốc Nhật Bản, mẫu có nguồn gốc nước   Luận án khảo sát phương pháp chiết xuất, thủy phân định tính, định lượng monosaccharid tạo thành polysaccharid dược liệu Đã áp dụng quy trình để khảo sát monosaccharid tạo thành polysaccharid toàn phần mẫu dược liệu monosaccharid tạo thành phân đoạn polysaccharid tách chiết Từ tính tỷ lệ mol tạo thành carbohydrat toàn phần mẫu phân đoạn polysaccharid   Luận án xây dựng bảng điểm để đánh giá chọn lựa marker cho dược liệu dựa yêu cầu WHO Đã áp dụng bảng điểm để chọn lựa đề xuất marker cho dược liệu Đương quy Nhật Bản xanthotoxin Z-ligustilid Đã khảo sát hàm lượng marker vùng dược liệu khác xác định mức giới hạn chất lượng xanthotoxin 0,15 mg/g Z-ligustilid 0,5 mg/g dược liệu Từ xây dựng tiêu chuẩn đề xuất dự thảo toàn văn chuyên luận "Dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực (rễ) Radix Angelicae acutilobae" cho Dược điển Việt nam: -­‐  24  -­‐       Thiết lập dược liệu chuẩn đối chiếu cho Radix Angelica acutilobae Các khảo sát cho thấy Đương quy Nhật Bản Đương quy Trung Quốc khác thành phần hóa học phân biệt nhờ vào định danh DNA phương pháp hoá học Kiến nghị   Căn vào nghiên cứu dược liệu Đương quy Nhật Bản trồng Việt Nam, đề xuất Hội đồng Dược điển Việt Nam xem xét lấy ý kiến tiến hành khảo nghiệm để nâng cấp chuyên luận Đương quy Nhật Bản di thực lần xuất   Tiến hành nghiên cứu thử nghiệm in vitro in vivo định hướng trị liệu Từ đó, có mở rộng hướng dẫn cụ thể cho việc sử dụng dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực văn pháp lý   Nghiên cứu phân lập tinh chế polysaccharid dược liệu Thử hoạt tính in vitro in vivo polysaccharid tinh chế từ dược liệu Áp dụng phương pháp phân tích monosaccharid để phân biệt dược liệu theo dấu địa lý Hiện nay, Đương quy Nhật Bản trồng phát triển tốt nhiều vùng khác Việt Nam Việc phát triển ạt vùng ngun liệu khơng có hướng tiêu thụ dẫn đến việc ùn ứ nơng sản có nguy vùng nguyên liệu kéo dài Vì vậy, cần phải có định hướng hợp lý để tiêu thụ, xuất ... Minh Tâm, Lê Thị Thu Cúc, Nguyễn Văn Thanh, (2020), "Phân lập furanocoumarin từ rễ Angelica acutiloba Kitagawa trồng Lâm Đồng”,Tạp chí Y Dược học, Số 8, tháng 11/2020, tr 37-41 Thi Minh Tam Pham, ... Traditional Chinese Medicine, 2021(x), xx-xx (Accepted by July 1st, 2021) -­‐  1  -­‐     GIỚI THI? ??U LUẬN ÁN Tính cấp thi? ??t luận án Đương quy dược liệu quý phổ biến Đông y, đa phần dược liệu Đương quy (Angelica... chất cấp thi? ??t trên, đề tài: "Tiêu chuẩn hóa dược liệu Đương quy Nhật Bản di thực từ Angelica acutiloba (Sieb et Zucc.) Kitagawa trồng Việt Nam" thực với mục tiêu xây dựng tiêu chuẩn thi? ??t lập