Thu nhận ginsenoside bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ nhân sâm panax ginseng c a meyer

Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH THU NHẬN GINSENOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY RỄ TƠ NHÂN SÂM PANAX GINSENG C.A MEYER SVTH: NGUYỄN THỊ HƯƠNG HẠ MSSV: 60700701 GVHD: LÊ THỊ THỦY TIÊN Tp HCM, Tháng 5/2011 GVHD: Lê Thị Thủy Tiên i SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer LỜI MỞ ĐẦU Nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) thuộc họ Araliacease, từ xa xưa coi số thuốc có tác dụng đồng hóa sản phẩm tế bào, thích nghi di truyền, kháng sinh, điều hòa lượng đường huyết, thần kinh chống ung thư, v.v Thành phần ginsenoside ghi nhận hợp chất có hoạt tính quan trọng rễ nhân sâm Mặt khác nhân sâm có thành phần khác chất chống oxy hóa, peptides, polysaccharides, axit béo, rượi vitamin Nhu cầu sử dụng Nhân sâm chiết suất hoạt chất chúng tăng nhanh theo thời gian Nhưng để thu hoạch rễ sâm trồng đồng ruộng phải từ 4-6 năm nhân công lao động làm cho giá thành tăng lên cao Ngoài ra, việc điều khiển loại dịch bệnh, kháng loại thuốc trừ sâu vấn đề nghiêm trọng Trong năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật thành công sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm nguyên liệu thô dược phẩm, sắc tố hóa chất khác Hiện nay, nhà khoa học nghiên cứu sản xuất ginsenoside Panax ginseng đường nuôi cấy tế bào Rễ tơ P.ginseng sản xuất giensenoside có tính chất học dược lí rễ tự nhiên Việc sản xuất ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ rút ngắn thời gian sản xuất so với việc nuôi cấy rễ tự nhiên Bên cạnh việc ni cấy rễ tơ cịn làm giảm giá thành sản phẩm Ngồi ra,có thể áp dụng sản xuất ginsenoside từ nuôi cấy rễ tơ bioreactor quy mô công nghiệp GVHD: Lê Thị Thủy Tiên i SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer GVHD: Lê Thị Thủy Tiên i SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer MỤC LỤC Đề mục Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi Danh mục chữ viết tắc viii CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CHI NHÂN SÂM PANAX L 1.2 SÂM TRIỀU TIÊN PANAX GINSENG C.A MEYER 1.2.1 Giới thiệu 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Hình thái thực vật 1.2.4 Thành phần hóa học 1.2.5 Tác dụng dược lí thực nghiệm Nhân sâm Triều Tiên 1.2.5.1 Tác dụng dược lí 1.2.5.2 Độc tính 1.2.6 Thực trạng sản xuất 1.3 GINSENOSIDE 1.3.1 Giới thiệu 1.3.2 Phân loại 1.3.3 Con đường sinh tổng hợp 12 1.3.4 Phương pháp chiết tách 12 1.3.5 Chế biến loại sản phẩm 14 CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 17 2.1 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ SẸO 17 2.1.1 Sản xuất ginsenoside nuôi cấy mô sẹo Nhân sâm Panax biến nạp với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes (Takafumi Yoshikawa Tsutomu Furuya, năm 1987) 17 2.1.1.1 Giới thiệu 17 2.1.1.2 Vật liệu phương pháp 17 2.1.1.3 Kết 19 2.1.1.4 Kết luận 23 2.2 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY RỄ TƠ 23 GVHD: Lê Thị Thủy Tiên iv SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer 2.2.1 Sản xuất ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ảnh hưởng nhiệt độ chất lượng ánh sáng (Kee-Won Yu cộng sự, năm 2004) 23 2.2.1.1 Vật liệu rễ tơ 23 2.2.1.2 Thiết lập nuôi cấy quy mô lớn dịch huyền phù bioracter 23 2.2.1.3 Xác định trọng lượng tỷ lệ tăng trưởng rễ 24 2.2.1.4 Xác định hàm lượng ginsenoside 24 2.2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng Kết 25 2.2.1.6 Kết luận 26 2.2.2 Sản xuất ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ảnh hưởng polyamine chất điều hòa tăng trưởng thực vật (PGR) (Sung Jin Hwang cộng sự, năm 1999) 26 2.2.2.1 Vật liệu phương pháp 26 2.2.2.2 Kết 27 2.2.2.3 Kết luận 28 2.2.3 Khảo sát hình thành tăng trưởng rễ từ phần chóp rễ tơ Panax ginseng C.A Meyer (Gwi Taek Jeong cộng sự, năm 2004) 28 2.2.3.1 Nuôi cấy rễ tơ 29 2.2.3.2 Phương pháp phân tích 29 2.2.3.3 Kết 30 2.2.3.4 Kết luận 35 2.2.4 Tối ưu hóa chất dinh dưỡng hữu để nuôi cấy rễ tơ sản xuất ginsenoside quy mô lớn bioreactor (G Sivakumar cộng sự, năm 2005) 36 2.2.4.1 Vật liệu phương pháp 36 2.2.4.2 Kết 38 2.2.4.3 Kết luận 45 CHƯƠNG KẾT LUẬN CHUNG 46 GVHD: Lê Thị Thủy Tiên iv SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: So sánh hàm lượng saponin loài nhân sâm khác Bảng 1.2: Thành phần hóa học Bảng 1.3: Thành phần dinh dưỡng Bảng 1.4: Ginsenoside dẫn chất 20(S)-protopanaxadiol 20(S)protopanaxatriol bạch sâm GVHD: Lê Thị Thủy Tiên iv 11 SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hệ thống phân lồi chi Panax L Hình 1.2: Các lồi nhân sâm Hình 1.3: Sâm theo năm tuổi Hình 1.5: Hình thái thực vật sâm Triều Tiên Hình 1.6: Hệ thống bioreactor 10.000 lít Hình 1.7: Cấu trúc 20(S)-protopanaxadiol 20(S)-protopanaxatriol 11 Hình 1.8: Các sảm phẩm từ sâm củ 15 Hình 1.9: Các sản phẩm cao viên 15 Hình 1.10: Các loại sản phẩm khác từ sâm 16 Hình 1.11: Sảm phẩm Sun ginseng 16 Hình 2.1: Q trình hình thành rễ tơ từ mơ sẹo 20 Hình 2.2: Giấy phân tích điện di chất chiết xuất từ rễ ni cấy bình thường rễ tơ Nhân sâm Panax 22 Hình 2.3: Ni cấy rễ tơ mơi trường MS lỏng 27 Hình 2.4: Ni cấy rễ tơ mơi trường MS lỏng 28 Hình 2.5: Sự tăng trưởng rễ hình thành từ chóp rễ sau 30 ngày ni cấy 30 Hình 2.6: Phát triển phân đoạn rễ tơ P.ginseng nuôi cấy 10 ngày 31 Hình 2.7: Ảnh hưởng số lượng chóp rễ lên tốc độ tăng trưởng rễ tơ ni cấy 30 ngày 32 Hình 2.8: Ảnh hưởng chiều dài chóp rễ lên tốc độ tăng trưởng rễ tơ ni cấy 30 ngày 32 Hình 2.9: Ảnh hưởng tuổi nuôi cấy lên tốc độ tăng trưởng rễ tơ nuôi cấy 30 ngày 33 Hình 2.10: Ảnh hưởng lượng mẫu ni cấy lên tốc độ tăng trưởng rễ tơ nuôi cấy 15 ngày 34 Hình 2.11: Ảnh hưởng lượng mẫu nuôi cấy lên tốc độ tăng trưởng rễ tơ ni cấy bioreacter 32 ngày 35 Hình 2.12: Phân tích PCR rễ biến nạp khơng biến nạp với mồi rolC 39 Hình 2.14: Sự thay đổi hàm lượng đường độ dẫn điện trình nuôi cấy rễ tơ môi trường MS bioreactor 20 lít 41 Hình 2.15: Sự thay đổi lượng anion (a) cation (b) nuôi cấy rễ tơ với mơi trường MS bioreactor 20 lít 42 GVHD: Lê Thị Thủy Tiên vi SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer Hình 2.16: Sự thay đổi ginsenoside, tinh bột, lượng đường tiêu thụ tổng lượng đường môi trường MS nuôi cấy rễ tơ Panax ginseng với nồng độ sucrose khác 44 GVHD: Lê Thị Thủy Tiên vii SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮC HPLC: Sắc kí lỏng cao áp MS: Môi trường Murashige Skoog 2,4-D : 2,4-dichloro-phenoxyacetic acid K: Kinetin IAA: indole-β-acetic acid IBA: Indole-β-butyric acid NAA: naphtyl-α-acetic acid GA: Gibberellin v/v : Thể tích/thể tích w/v: Khối lượng/thể tích vvm: Thể tích khơng khí/phút SH: Mơi trường Schenk Hildebrand PFD: Dòng mật độ photon FL: Ánh sáng huỳnh quang MH: Ánh sáng đèn metal halide R: Ánh sáng đơn sắc đỏ B: Ánh sáng đơn sắc xanh RB: Ánh sáng đỏ cộng với xanh PGR: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật GR: tốc độ tăng trưởng bình qn DW: Trọng lượng khơ FW: Trọng lượng tươi TLC: Sắc kí lớp mỏng GVHD: Lê Thị Thủy Tiên vii SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ Thu nhận ginsenoside phương pháp nuôi cấy rễ tơ Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 CHI NHÂN SÂM PANAX L Nhân sâm biết đến hàng trăm nay với tác dụng phục hồi suy giảm chức năng, đưa hoạt động thể trở lại bình thường Từ “sâm” dùng để nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer), thuốc bổ hàng đầu y học cổ truyền phương Đơng Nó cịn mở rộng để số lồi chi Panax Hệ thống phân loài chi Panax L Cho đến người ta biết khoảng 14 loài thuộc chi Panax với phân bố sau : - Panax ginseng C.A Meyer (Nhân sâm) = Panax Schinseng Nees: loại hoang dại, hiếm, trồng vùng Đông Bắc Châu Á - Panax quinquefolium L (sâm Mỹ) mọc hoang trồng vùng Bắc Mỹ - Panax trifoliatus L (Dwarf ginseng “Sâm lùn”): có Bắc Mỹ - Panax notoginseng F.H Chen ex C.Y.Wu et K.M.Feng: trồng Việt Nam, Trung Quốc - Panax pseudo-ginseng Wall Subsp pseudo-ginseng Hara: mọc hoang dại, hiếm, tìm thấy phía Đơng dãy Himalaya - Panax japonicus C.A Meyer (Panax pseudo-ginseng Wall Subsp Japonicus Meyer Hara): mọc hoang dại Nhật Bản miền Nam Trung Quốc - Panax japonicus C.A Meyer var agustifolius (Burk) Chen et Chu: mọc hoang dại miền Nam Trung Quốc - Panax japonicus C.A Meyer var bipinnatifidus (Seem) C.Y Wu et K.M Feng: mọc hoang dại miền Nam Trung Quốc - Panax zingiberensis C.Y Wu et K.M Feng: mọc hoang miền Nam Trung Quốc - Panax stipulenatus H.Tsai et K.M.Feng: mọc hoang dại miền Nam Trung Quốc từ Vân Nam đến Tây Tạng miền Bắc Việt Nam - Panax pseudo-ginseng Wall Subsp Himalaycus Hara: mọc hoang dại phía đơng dãy Himalaya - Panax sp.: gồm mẫu thu hái Chame, Nepal mẫu thu hái Ghorapani, mọc hoang dại Trung Nepal - Panax vietnamensis (sâm Ngọc Linh) Ha et Grushv.: mọc hoang dại trồng tỉnh Kon Tum Quảng Nam Nhiều nhà phân loại học có nghiên định thực vật học loài thuộc chi Panax Tuy nhiên, kể từ năm 1942 đến phân loại có thay đổi đáng kể, hệ thống phân loại Jun Wen thống kê 12 14 loài thứ loài chi Panax (Dong cộng sự, 2007) GVHD: Lê Thị Thủy Tiên SVTH: Nguyễn Thị Hương Hạ