Khảo sát khả năng thu nhận polysaccharide từ nấm linh chi ganoderma lucidum việt nam bằng phương pháp nuôi cấy tế bào

I HỌ QUỐ GI TH NH PHỐ HỒ H MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN PHAN KHÁNH HÕA KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THU NHẬN POLYSACCHARIDE TỪ NẤM LINH CHI Ganoderma lucidum VIỆT NAM BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYÊN NG NH : ÔNG NGHỆ SINH HỌ MÃ SỐ NG NH : 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG TS LÊ THỊ THỦY TIÊN TP HỒ H MINH, THÁNG 02 NĂM 2012 ơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng ại học Bách Khoa – H QG – TP HCM án hƣớng dẫn khoa học 1: PGS TS NGUYỄN Ứ LƢỢNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) án hƣớng dẫn khoa học 2: TS LÊ THỊ THỦY TIÊN (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) án chấm nhận xét 1: TS PH N NGỌ HÕ (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) án chấm nhận xét 2: PGS TS NGUYỄN THÖY HƢƠNG (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ Trƣờng ại học Bách Khoa, H QG Tp HCM ngày 11 tháng …02… năm …2012… Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: TS NGUYỄN HỮU PHÖ TS PH N NGỌ HÕ PGS TS NGUYỄN THÖY HƢƠNG TS HUỲNH NGỌ O NH PGS TS NGUYỄN Ứ LƢỢNG Xác nhận hủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trƣởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn đƣợc sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TS NGUYỄN HỮU PHƯ TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC I HỌ QUỐ GI TP H M CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ộc lập - Tự - Hạnh phúc - - - - - - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN PHAN KHÁNH HÒA MSHV: 09310570 Sinh ngày: 11/04/1986 Nơi sinh: HUẾ ÔNG NGHỆ SINH HỌ Mã ngành:60.42.80 Chuyên ngành: I TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát khả thu nhận polysaccharide từ nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum Việt Nam phƣơng pháp nuôi cấy tế bào NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG LUẬN VĂN: - Theo dõi gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide theo thời gian chủng Ganoderma lucidum - Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố dinh dƣỡng (đƣờng nitơ) lên gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide - Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện ánh sáng lên gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/02/2011 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 26/12/2012 IV CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS TS NGUYỄN Ứ LƢỢNG TS LÊ THỊ THỦY TIÊN Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2012 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN (họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN (họ tên chữ ký) TRƢỞNG KHOA (họ tên chữ ký) LỜI CÁM ƠN Lời đầu tiên, xin cám ơn thầy Nguyễn ức Lƣợng, thầy ngƣời đƣa đến với khái niệm ông nghiệp ông nghệ Sinh học Xin cám ơn kiến thức kinh nghiệm quý giá thầy, điều giúp tự tin thêm yêu đƣờng chọn Xin cám ơn thầy cho góp ý, bổ sung để hồn chỉnh luận văn Tôi xin cám ơn cô Nguyễn Thúy Hƣơng, ngƣời theo suốt lớp tháng ngày qua Xin cám ơn hết lịng chăm lo hỗ trợ từ điều nhỏ nhặt Tôi xin cám ơn cô Lê Thị Thủy Tiên, giáo viên hƣớng dẫn tôi, ngƣời suốt năm làm luận văn vừa qua ô cho tảng kiến thức nhƣ thực nghiệm Xin cám ơn cô lắng nghe ủng hộ ý kiến, ý tƣởng để tơi xây dựng nên đề tài hồn chỉnh Xin cám ơn cô ngày cuối học tập mái trƣờng này, cô theo sát bạn, động viên chúng tơi hồn thành tốt cơng việc Tơi xin cám ơn Bộ môn ông nghệ Sinh học giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi đƣợc triển khai thí nghiệm thành công Tôi xin cám ơn Dƣợc sĩ Phạm Văn ạt, ngƣời động viên bƣớc vào đƣờng Thạc sĩ từ cơng trình nghiên cứu gợi cho ý tƣởng đề tài luận văn Tôi xin cám ơn anh Mỹ ông, anh Mẫn Khanh, anh Quốc Trung, chị Thủy Thƣơng, chị Quỳnh Mai, chị Hải Yến, chị Hồng hâu, chị Minh hâu, chị Trúc Thanh; xin cám ơn bạn Kim Thúy, Lê Thúy, Huyền Trang, nh Khoa, Mạnh Hùng, Mỹ Trâm, ức Tính; tơi xin cám ơn em Thanh Phúc, Thanh Hƣơng, Kiều Uyên, Song Phƣơng, Quốc nh, Ngọc Duy, Thành Trung, ức Thiện chia sẻ kinh nghiệm, kiến thức, đem lại nhiều niềm vui, tiếng cƣời trình học tập nghiên cứu Và cuối cùng, xin gửi lời cám ơn chân thành đến ba mẹ tôi, ngƣời ủng hộ vật chất, lẫn tinh thần, yêu thƣơng tin tƣởng ám ơn hai em tơi, Khánh Hà Hồng Hải, ln dõi theo mong cho điều tốt TP Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 02 năm 2012 Học viên Nguyễn Phan Khánh Hịa i TĨM TẮT Polysaccharide từ nấm Linh chi nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học cao Thu nhận polysaccharide phƣơng pháp ni cấy tế bào chìm góp phần khắc phục nhƣợc điểm phƣơng pháp nuôi trồng truyền thống nâng cao suất thu nhận hợp chất Những khảo sát ban đầu về ni cấy tế bào chìm chủng Ganoderma lucidum Việt Nam ( L TP) cho thấy ngày ni cấy thứ 10 thời điểm thích hợp để thu sinh khối với hàm lƣợng EPS IPS cao ối với chủng L, sinh khối, hàm lƣợng EPS IPS cao sử dụng lactose 60 g/l làm nguồn cung cấp carbon; sucrose 60 g/l thích hợp cho việc thu nhận sinh khối, IPS, EPS chủng TP Nitơ hữu thích hợp cho sinh trƣởng tổng hợp polysaccharide chủng L TP Hàm lƣợng IPS EPS chủng L TP cao có kết hợp cao nấm men 7.5 g/l peptone 2.5 g/l môi trƣờng nuôi cấy Ánh sáng ảnh hƣởng đến kích thƣớc, hình dạng màu sắc cụm tế bào chủng L TP nuôi cấy chìm Khi ni cấy điều kiện tối hồn tồn hàm lƣợng EPS cao đáng kể so với nuôi cấy điều kiện ánh sáng phịng thí nghiệm chủng khảo sát Trong điều kiện tối ƣu nguồn đƣờng, nguồn nitơ ánh sáng, sinh khối, hàm lƣợng IPS EPS chủng L lần lƣợt 13.897 ± 0.274 g DW/l, 15.33 ± 0.97 mg/100mg DW 2349.76 ± 46.94 mg/l, chủng TP lần lƣợt 13.930 ± 0.634 g DW/l, 15.61 mg/100mg DW 2496.76 ± 73.15 mg/l ii MỤC LỤC TRANG LỜI ẢM ƠN i TÓM TẮT ii MỤ LỤ iii D NH MỤ Á HỮ VIẾT TẮT v D NH MỤ ẢNH vi D NH MỤ HÌNH vii D NH MỤ BẢNG viii HƢƠNG 1: MỞ ẦU 1.1 ẶT VẤN Ề 1.2 MỤ TIÊU V NỘI DUNG NGHIÊN ỨU HƢƠNG 2: TỔNG QU N T I LIỆU 2.1 TỔNG QU N VỀ NẤM LINH HI Ỏ Ganoderma lucidum 2.1.1 Giới thiệu nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum 2.2.2 Polysaccharide nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum 12 2.2 ÔNG NGHỆ NUÔI ẤY TẾ B O 15 2.2.1 Giới thiệu chung nuôi cấy tế bào 15 2.2.2 ác phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 15 2.2.3 Nuôi cấy tế bào đối tƣợng nấm lớn 17 2.3.4 ác yếu tố ảnh hƣởng q trình ni cấy chìm Ganoderma lucidum 19 HƢƠNG 3: VẬT LIỆU V PHƢƠNG PHÁP 3.1 VẬT LIỆU 29 3.1.1 ối tƣợng nghiên cứu 29 3.1.2 Hóa chất 29 3.1.3 Môi trƣờng dinh dƣỡng 30 3.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN ỨU 31 3.2.1 giống bảo quản giống 32 3.2.2 Giai đoạn tiền nuôi cấy 32 iii 3.2.3 Tiến hành thí nghiệm 33 3.3 PHƢƠNG PHÁP PHÂN T H 37 3.3.1 Phƣơng pháp sinh hóa 37 3.3.2 Phƣơng pháp phân tích xử lý số liệu 38 HƢƠNG 4: KẾT QUẢ V BIỆN LUẬN 4.1 ặc điểm giống Ganoderma lucidum ni cấy chìm 39 4.2 Khảo sát trình tăng sinh hình thành polysaccharide 43 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng đến gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide Ganoderma lucidum 47 4.4 Khảo sát ảnh hƣởng nguồn nitơ đến gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide Ganoderma lucidum 58 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng ánh sáng đến gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide Ganoderma lucidum 62 HƢƠNG 5: KẾT LUẬN V KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 68 5.2 KIẾN NGHỊ 68 T I LIỆU TH M KHẢO 70 PHỤ LỤ iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT EPS (extracellular polysaccharide) : polysaccharide ngoại bào IPS (intracellular polysaccharide) : polysaccharide nội bào : interferon INF DW (dry weight) : khối lƣợng khô DO (dissolved oxygen) : oxygen hòa tan SOUR (special oxygen uptake rate) : tỷ lệ hấp thu oxy riêng v DANH MỤC ẢNH Ảnh 2.1: Tế bào khối u đƣợc xử lí với với dịch chiết từ nấm Linh chi trƣớc (a) sau (b) 72 10 Ảnh 3.1: Ganoderma lucidum môi trƣờng PG 29 Ảnh 3.1: Giống chuẩn bị cho giai đoạn tiền nuôi cấy 32 Ảnh 3.2: ác miếng thạch có hệ sợi tơ nấm đƣợc chuyển vào ống nghiệm có chứa nƣớc cất vơ trùng 33 Ảnh 3.3: chuyền giống vào bình chứa mơi trƣờng tiền nuôi cấy 33 Ảnh 4.1: Mẫu cấy môi trƣờng PG 39 Ảnh 4.2: Hệ sợi tơ G lucidum sau ngày nuôi cấy lên môi trƣờng PG Ảnh 4.3 : G lucidum sau ngày nuôi cấy môi trƣờng PG 39 39 Ảnh 4.4 : Hình dạng cụm tế bào chủng L sau bƣớc giai đoạn tiền nuôi cấy 41 Ảnh 4.5 : Hình dạng cụm tế bào chủng TP sau bƣớc giai đoạn tiền nuôi cấy 41 Ảnh 4.6 : Hình dạng cụm tế bào chủng L sau bƣớc giai đoạn tiền nuôi cấy 42 Ảnh 4.7 : Hình dạng cụm tế bào chủng TP sau bƣớc giai đoạn tiền nuôi cấy 42 Ảnh 4.8: Sinh khối chủng TP sau 10 ngày nuôi cấy nguồn đƣờng khác nồng độ 60 g/l 53 Ảnh 4.9: Sinh khối chủng L điều kiện ánh sáng khác 65 Ảnh 4.10: Sinh khối chủng TP điều kiện ánh sáng khác 65 Ảnh 4.11: Màu sắc cụm tế bào chủng L điều kiện ánh sáng khác 66 Ảnh 4.12: Hình dạng tế bào chủng L điều kiện ánh sáng khác 66 Ảnh 4.13: Màu sắc cụm tế bào chủng TP điều kiện ánh sáng khác 67 Ảnh 4.14: Hình dạng tế bào chủng TP điều kiện ánh sáng khác 67 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1.: hu trình sống nấm ảm (Basidiomycota) Hình 2.2: Quả thể nấm Linh chi đỏ Hình 2.3: ấu trúc phân tử triterpen nấm Linh chi Hình 2.4: ấu trúc phân tử β-D-glucan 12 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 31 Hình 4.1: ƣờng cong sinh trƣởng chủng L TP 44 Hình 4.2: Sự thay đổi hàm lƣợng EPS IPS theo thời gian nuôi cấy chủng L 45 Hình 4.3: Sự thay đổi hàm lƣợng EPS IPS theo thời gian nuôi cấy chủng TP 46 Hình 4.4: Ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng ban đầu đến gia tăng sinh khối chủng L 50 Hình 4.5: Ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng ban đầu đến hàm lƣợng IPS chủng L 51 Hình 4.6: Ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng ban đầu đến hàm lƣợng EPS chủng L 52 Hình 4.7: Ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng ban đầu đến gia tăng sinh khối chủng TP 55 Hình 4.8: Ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng ban đầu đến hàm lƣợng IPS chủng TP 56 Hình 4.9: Ảnh hƣởng loại đƣờng nồng độ đƣờng ban đầu đến hàm lƣợng EPS chủng TP 56 Hình 4.10: Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến gia tăng sinh khối hàm lƣợng EPS, IPS chủng L 60 Hình 4.11: Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến gia tăng sinh khối hàm lƣợng EPS, IPS chủng TP 61 Hình 4.12: Ảnh hƣởng chế độ ánh sáng đến gia tăng sinh khối tổng hợp EPS, IPS chủng L 63 Hình 4.13: Ảnh hƣởng chế độ ánh sáng đến gia tăng sinh khối tổng hợp EPS, IPS chủng TP 64 vii ... tài: ? ?Khảo sát khả thu nhận polysaccharide từ nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum Việt Nam phƣơng pháp nuôi cấy tế bào? ?? 1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu đƣợc thực chủng Ganoderma lucidum. .. TÀI: Khảo sát khả thu nhận polysaccharide từ nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum Việt Nam phƣơng pháp nuôi cấy tế bào NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG LUẬN VĂN: - Theo dõi gia tăng sinh khối tổng hợp polysaccharide. .. chung nuôi cấy tế bào 15 2.2.2 ác phƣơng pháp nuôi cấy tế bào 15 2.2.3 Nuôi cấy tế bào đối tƣợng nấm lớn 17 2.3.4 ác yếu tố ảnh hƣởng q trình ni cấy chìm Ganoderma lucidum