Khảo sát khả năng thu nhận capsaicin bằng phương pháp nuôi cấy tế bào cây ớt capsicum sp

Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐỖ THỊ HOÀNG TUYẾN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THU NHẬN CAPSAICIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO CÂY ỚT CAPSICUM SP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ CBHD: T.S Lê Thị Thủy Tiên TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2011 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng năm TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM KHOA ………………………………… Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo Tp HCM, ngày tháng năm NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: … Phái: …………………… Ngày, tháng, năm sinh: Nơi sinh: Chuyên ngành: MSHV: 1- TÊN ĐỀ TÀI: 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi đầy đủ học hàm, học vị ): Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Họ tên chữ ký) CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) ii KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên chữ ký) LỜI CÁM ƠN Luận văn thạc sĩ hồn thành khơng cơng sức lao động cá nhân tơi mà cịn nhờ giúp đỡ nhiều người Trước tiên, xin cảm ơn thầy cô môn Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa truyền đạt kiến thức chuyên môn kỹ nghiên cứu cho Tôi xin chân thành cảm ơn cô hướng dẫn, tiến sĩ Lê Thị Thủy Tiên tận tình dạy tơi suốt q trình thực luận văn Nhờ cô, học nhiều phương pháp nghiên cứu biết thêm nhiều kiến thức lĩnh vực công nghệ tế bào Tôi xin cảm ơn cô chủ nhiệm Nguyễn Thúy Hương quan tâm giải đáp thắc mắc để trình thực luận văn thuận lợi Xin cảm ơn ủng hộ gia đình giúp tơi có điều kiện học tập cách tốt Nếu khơng có hy sinh gia đình có lẽ tơi khơng thể tập trung cho việc học cách hiệu Cảm ơn bạn bè lớp cao học 2009 hợp tác, giúp đỡ tơi q trình học tập Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành chúc tất người sức khỏe, thành công may mắn Đỗ Thị Hồng Tuyến iii TĨM TẮT LUẬN VĂN Cây mầm ớt (Capsicum sp.) sử dụng làm nguyên liệu tạo mô sẹo phục vụ cho mục đích nghiên cứu khả thu nhận capsaicin phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật Quá trình tạo sẹo khảo sát với ảnh hưởng yếu tố: nguồn gốc mẫu cấy (lá mầm, trụ mầm, rễ mầm), nguồn auxin ngoại sinh (NAA, 2,4-D), điều kiện chiếu sáng (sáng, tối) Mơ sẹo từ mầm hình thành điều kiện tối môi trường MS bổ sung 2,4-D 2.5 mg/l kinetin 0.5 mg/l tăng trưởng mạnh (sau tuần nuôi cấy mức độ tăng trưởng đạt 6.322 lần so với tuần thứ 4) có cấu trúc xốp nên phù hợp với mục đích tạo huyền phù tế bào Đối với sinh tổng hợp capsaicin, điều kiện chiếu sáng giúp mô sẹo tổng hợp capsaicin mạnh điều kiện tối, mơ sẹo từ rễ mầm có hàm lượng capsaicin cao (hàm lượng 0.712 mg/g trọng lượng tươi) Ba loại chất cảm ứng sử dụng methyl jasmonate, dịch chiết từ Aspergillus niger dịch chiết từ Trichoderma reesei có tác động kích thích sinh tổng hợp capsaicin mô sẹo Mô sẹo tuần tuổi có nguồn gốc từ mầm có khả tạo huyền phù tế bào tốt iv MỤC LỤC TÓM TẮT LUẬN VĂN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH ẢNH viii Phần 1: MỞ ĐẦU xii  Mục tiêu đề tài  Nội dung thực Phần 2: TỔNG QUAN 2.1 Sơ lược Capsicum sp 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Đặc điểm hình thái .4 2.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 2.2 Giới thiệu Capsaicin 2.2.1 Cấu trúc 2.2.2 Sự sinh tổng hợp capsaicin .7 2.2.3 Độ cay thang đo 2.2.4 Vai trò Capsaicin 12 2.3 Phương pháp thu nhận capsaicin in viro .14 2.3.1.Mô sẹo 14 2.3.2 Huyền phù tế bào 17 2.3.3 .Các phương pháp nâng cao sản lượng hợp chất thứ cấp nuôi cấy tế bào thực vật 18 2.3.4 Giới thiệu chất cảm ứng 20 2.4 Các nghiên cứu nước .26 2.4.1 Các nghiên cứu nước 26 2.4.2.Tình hình nghiên cứu nước 32 Phần 3: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 3.1 Vật liệu: 33 3.2 Phương pháp nghiên cứu .34 3.2.1 Tạo 35 3.2.2 Khảo sát môi trường tăng sinh sẹo 36 3.2.4 Khảo sát khả tổng hợp capsaicin mô sẹo 37 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng sinh tổng hợp capsaicin 38 3.2.6 Nuôi cấy huyền phù tế bào .40 v 3.2.7 Định lượng capsaicin .40 3.2.8 Phương pháp xử lý số liệu 42 Phần : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43 4.1 Kết .43 4.1.1 Tạo mầm in vitro 43 4.1.2 Khảo sát khả tạo mô sẹo mẫu cấy 44 4.1.3 Sự tăng trưởng mơ sẹo mơi trường có auxin nồng độ thay đổi 49 4.1.4 Khảo sát khả tạo capsaicin mô sẹo ảnh hưởng chất cảm ứng 68 4.1.5 Khảo sát khả tạo huyền phù tế bào từ mô sẹo 74 4.2 Bàn luận .75 4.2.1 Chế độ khử trùng tạo mầm in vitro 75 4.2.2 Ảnh hưởng vài yếu tố đến trình hình thành tăng trưởng mô sẹo 75 4.2.3 Khả tạo capsaicin mô sẹo ảnh hưởng chất cảm ứng sinh học 79 4.2.4 Khả tạo huyền phù tế bào từ mô sẹo 82 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84 5.1 Kết luận 84 5.2 Kiến nghị 85 Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 95 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Độ cay loại ớt Bảng 2.2 Độ cay hợp chất capsaicinoid Bảng 2.3 Thành phần amino acid có vách tế bào Aspergillus niger Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo môi trường bổ sung NAA kinetin 0.5mg/l ngày thứ q trình ni cấy điều kiện tối sáng Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu cấy tạo sẹo môi trường bổ sung 2,4-D kinetin 0.5mg/l ngày thứ q trình ni cấy điều kiện sáng tối Bảng 4.3 Số liệu lập đường chuẩn định lượng capsaicin theo phương pháp so màu Bảng 4.4 Hàm lượng capsaicin mô sẹo tuần tuổi môi trường MS bổ sung kinetin 0.5 mg/l 2,4-D nồng độ thay đổi Bảng 4.5 Ảnh hưởng nồng độ MeJA lên sinh tổng hợp capsaicin mức độ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo từ mầm môi trường MS bổ sung 0.5 mg/l kinetin 2.5 mg/l 2,4-D Bảng 4.6 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết A niger lên sinh tổng hợp capsaicin mức độ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo từ mầm môi trường MS bổ sung 0.5 mg/l kinetin 2.5 mg/l 2,4-D Bảng 4.7 Ảnh hưởng nồng độ dịch chiết T reesei lên sinh tổng hợp capsaicin mức độ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo từ mầm môi trường MS bổ sung 0.5 mg/l kinetin 2.5 mg/l 2,4-D vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Ảnh 2.1 Hình ảnh lồi thuộc chi Capsicum Hình 2.2 Cấu trúc hợp chất capsaicinoid Hình 2.3 Cấu trúc capsaicin hình mơ tả chiều Hình 2.4 Sinh tổng hợp capsaicinoid Hình 2.5 Cấu trúc phân tử methyl jasmonate (C13H20O3) Ảnh 2.6 Aspergillus niger Ảnh 2.7 Trichoderma reesei Hình 2.8 Cột phản ứng chứa tế bào C frutescens cố định để sản xuất capsaicin Ảnh 3.1 Bao bì hạt giống ớt thiên 27 Hình 3.2 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu chung Hình 3.3 Sơ đồ phương pháp khử trùng hạt giống Ảnh 3.4 Mẫu cấy từ mầm ớt Hình 3.5 Phương pháp thu nhận dịch chiết nấm mốc Ảnh 4.1 Cây mầm ớt 14 ngày tuổi Ảnh 4.2 Mô sẹo tuần tuổi từ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA 2.5 mg/l Ảnh 4.3 Mô sẹo tuần tuổi từ trụ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA mg/l Ảnh 4.4 Sự phát sinh rễ bất định từ mô sẹo tuần tuổi môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA mg/l điều kiện tối Ảnh 4.5 Mô sẹo tuần tuổi từ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l 2,4-D 2.5 mg/l Ảnh 4.6 Mô sẹo tuần tuổi từ trụ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l 2,4-D mg/l, viii Ảnh 4.7 Mô sẹo tuần tuổi từ mầm môi trường bổ sung 2,4-D 2.5 mg/l kinetin 0.5 mg/l quan sát kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần Hình 4.8 Mức độ gia tăng trọng lượng tươi mơ sẹo có nguồn gốc từ mầm tuần thứ tuần thứ so với tuần thứ môi trường MS bổ sung NAA kinetin 0.5 mg/l điều kiện sáng Ảnh 4.9 Mơ sẹo có nguồn gốc từ mầm hình thành mơi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA mg/l điều kiện sáng Hình 4.10 Mức độ gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo có nguồn gốc từ trụ mầm vào tuần thứ tuần thứ so với tuần thứ môi trường MS bổ sung NAA kinetin 0.5 mg/l điều kiện sáng Ảnh 4.11 Mô sẹo có nguồn gốc từ trụ mầm hình thành môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA mg/l điều kiện sáng Hình 4.12 Mức độ gia tăng trọng lượng tươi mơ sẹo có nguồn gốc từ rễ mầm tuần thứ tuần thứ so với tuần thứ môi trường MS bổ sung NAA kinetin 0.5 mg/l điều kiện sáng Ảnh 4.13 Mơ sẹo có nguồn gốc từ rễ mầm hình thành mơi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA 1.5 mg/l điều kiện sáng Hình 4.14 Mức độ gia tăng trọng lượng tươi mơ sẹo có nguồn gốc từ mầm tuần thứ tuần thứ so với tuần thứ môi trường MS bổ sung NAA kinetin 0.5 mg/l điều kiện tối Ảnh 4.15 Mô sẹo có nguồn gốc từ mầm hình thành mơi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA mg/l điều kiện tối Hình 4.16 Mức độ gia tăng trọng lượng tươi mơ sẹo có nguồn gốc từ trụ mầm tuần thứ tuần thứ so với tuần thứ môi trường MS bổ sung NAA kinetin 0.5 mg/l điều kiện tối Ảnh 4.17 Mơ sẹo có nguồn gốc từ trụ mầm hình thành mơi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA mg/l điều kiện tối ix Phần 6: Tài Liệu Tham Khảo [64] Weathers P J., Mohd Fadzillah N A., Cheetham R D (1992) Light inhibits the formation of capsaicin from Capsicum callus Planta Med 58: 278-279 [65] Yasuyuki Yamada, Fumihiko Sato (1978) The photoautotrophic culture of chlorophyllous cells Plant & Cell Physiol 19(4): 691-699 TÀI LIỆU INTERNET [66] http://cnx.org/content/m30247/latest/ [67] http://en.wikipedia.org/wiki/Chili_pepper [68] http://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_jasmonate [69] http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html [70] http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/san-xuat-cac-hop-chat-thu-cap-tu-nuoi-cay-te-baothuc-vat.181028.html [71] http://thuviensinhhoc.com [72] http://www.3dchem.com/molecules.asp?ID=105 [73] http://www.moldbacteria.com/newsletters/2005/dec2005.html 94 PHỤ LỤC Kết xử lý ANOVA đánh giá mức độ gia tăng trọng lượng mô sẹo từ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA  Điều kiện sáng Tuần thứ 6: Tuần thứ 8:  Điều kiện tối Tuần thứ 6: Tuần thứ Kết xử lý ANOVA đánh giá mức độ gia tăng trọng lượng mô sẹo từ trụ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA  Điều kiện sáng Tuần thứ Tuần thứ  Điều kiện tối Tuần thứ Tuần thứ Kết xử lý ANOVA đánh giá mức độ gia tăng trọng lượng mô sẹo từ rễ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l NAA  Điều kiện sáng Tuần thứ 6: Tuần thứ 8:  Điều kiện tối Tuần thứ Tuần thứ Kết xử lý ANOVA đánh giá mức độ gia tăng trọng lượng mô sẹo từ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l 2,4-D  Điều kiện sáng Tuần thứ Tuần thứ  Điều kiện tối Tuần thứ Tuần thứ Kết xử lý ANOVA đánh giá mức độ gia tăng trọng lượng mô sẹo từ trụ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l 2,4-D  Điều kiện sáng Tuần thứ Tuần thứ  Điều kiện tối Tuần thứ Tuần thứ Kết xử lý ANOVA đánh giá mức độ gia tăng trọng lượng mô sẹo từ rễ mầm môi trường bổ sung kinetin 0.5 mg/l 2,4-D  Điều kiện sáng Tuần thứ Tuần thứ  Điều kiện tối Tuần thứ Tuần thứ Kết xử lý ANOVA đánh giá trọng lượng mô sẹo từ mầm môi trường bổ sung 2,4-D 2.5 mg/l kinetin Tuần thứ Tuần thứ 8 Khả tạo capsaicin mô sẹo  Từ mầm 2,4-D (mg/l) Điều kiện sáng ΔODtb Msẹo [capsaicin] (mg/g) 1.5 2.5 S 0.0165 0.2049 T 0.0205 0.3022 S 0.0125 0.1076 T 0.0115 0.1656 S 0.0115 0.116 T 0.0205 0.3777 S 0.0125 0.1329 T 0.0365 0.5751 S 0.0125 0.14 T 0.0325 0.6597 0.272 0.228 0.393 0.236 0.336 0.183 0.319 0.213 0.302 0.165 T S T S  Từ trụ mầm 2,4-D (mg/l) Điều kiện S 1.5 T S 2.5 T S T sáng ΔODtb Msẹo [capsaicin] (mg/g) 0.0175 0.1004 0.0265 0.3382 0.0175 0.1023 0.0125 0.1393 0.0165 0.1011 0.0265 0.3308 0.0155 0.1045 0.0205 0.2828 0.0145 0.1061 0.0185 0.2448 0.587 0.263 0.576 0.303 0.550 0.269 0.500 0.243 0.461 0.254  Từ rễ mầm 2,4-D (mg/l) Điều kiện sáng ΔODtb Msẹo [capsaicin ] (mg/g) 1.5 S 0.021 0.101 T 0.018 0.110 S 0.0205 0.712 0.566 S 0.019 0.0175 0.1074 T 0.017 0.107 0.101 0.642 0.547 0.650 9.Ảnh hưởng chất cảm ứng  MeJA MeJA (mg/l) ΔODtb Msẹo [capsaicin] (mg/g) 0.048 0.3000 0.018 0.1060 0.027 0.1032 0.018 0.1160 0.458 0.571 0.879 0.523  Dịch chiết nấm mốc A niger Dịch chiết (mg/l) ΔODtb Msẹo [capsaicin] (mg/g) 0.048 0.3000 10 0.027 0.1160 20 0.031 0.1140 30 0.027 0.1050 0.458 0.785 0.916 0.863  Dịch chiết nấm mốc T reesei Dịch chiết (mg/l) ΔODtb Msẹo [capsaicin] (mg/g) 2.5 0.048 0.3000 10 0.019 0.1150 20 0.016 0.0990 30 0.023 0.0910 0.458 0.556 0.600 0.849 T 0.1035 S 0.018 0.107 T 0.016 0.110 S 0.018 0.101 T 0.016 0.103 0.570 0.579 0.505 0.614 0.536 ... ni cấy mơ sinh trưởng phân hóa (ni cấy rễ tơ, nuôi cấy phôi…) Phương pháp nuôi cấy callus nuôi cấy dịch huyền phù tế bào hai phương pháp phổ biến sử dụng để thu nhận hợp chất thứ cấp Nuôi cấy. .. 2.3 Phương pháp thu nhận capsaicin in viro Hiện có nhiều kỹ thu? ??t nuôi cấy tế bào thực vật chia làm loại ni cấy mơ sinh trưởng khơng phân hóa (bao gồm ni cấy callus, dịch huyền phù tế bào, tế bào. .. LUẬN VĂN Cây mầm ớt (Capsicum sp.) sử dụng làm nguyên liệu tạo mô sẹo phục vụ cho mục đích nghiên cứu khả thu nhận capsaicin phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật Quá trình tạo sẹo khảo sát với