Khảo sát khả năng kháng khuẩn của enzyme lysozyme, thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo

-I- Lời Cám Ơn Xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc PGS.TS Nguyễn Đức Lượng, người thầy hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em thực luận văn Xin cảm Ba mẹ gia đình ni dưỡng tạo điều kiện cho học tập thực luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn Nguyễn Thị Thùy Dương tận tình truyền đạt kiến thức kinh, kinh nghiệm trình làm luận văn Xin chân thành biết ơn Cô môn Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thời gian làm luận văn Xin cảm ơn người bạn tơi học tập, trao đổi, động viên có giúp đỡ quý báu thời gian làm luận văn Cuối xin cám ơn chồng tôi, người động viên bên giúp vượt qua giai đoạn khăn thời gian thực luận văn Chu Thị Hà - II - LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu trình bày phần kết luận văn thân tơi thực hiện, không chép người khác Chu Thị Hà - III MỤC LỤC LỚI CÁM ƠN I LỜI CAM ĐOAN……………………………………………………………………………………… II DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC ĐỒ THỊ VI DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .VIII TÓM TẮT NỘI DUNG IX ABSTRACT .X Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 2.1 Kiểm soát khả kháng khuẩn 2.1.1 Tác nhân vật lý hóa học ảnh hưởng đến việc kiểm soát phát triển vi khuẩn 2.1.2 Các ảnh hưởng vi khuẩn 2.2 Enzyme lysozyme 2.2.1 Cấu trúc enzyme lysozyme 10 2.2.2 Tính chất hóa học enzyme lysozyme 12 2.2.3 Lysozyme ức chế vi khuẩn 12 2.2.4 Hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm lysozyme 14 2.2.5 Tăng khả kháng khuẩn lysozyme cách kết hợp với số chất kháng khuẩn 15 2.2.6 Ứng Dụng lysozyme lãnh vực khác giới 21 2.2.7 Những nghiên cứu ứng dụng lysozyme Việt Nam 25 2.3 Bảo quản thịt heo 26 2.3.1 Các biến đổi thịt sau giết mổ 26 2.3.2 Các dạng hư hỏng thịt 27 2.3.3 Một số loại vi sinh vật ảnh hưởng đến chất lượng thịt 28 2.3.3 Các phương pháp bảo quản thịt 30 Chương MỤC TIÊU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Nội dung đề tài 31 3.2 Phương pháp nghiên cứu 31 3.2.1.Nguyên liệu, giống vi sinh vật, hố chất, dụng cụ thiết bị thí nghiệm 31 3.2.2 Phương pháp phân tích 35 3.2.3 Xử lý số liệu 36 - IV 3.2.4 Các phương pháp nghiên cứu cụ thể 37 Chương KẾT QUẢ – THẢO LUẬN 44 4.1 Tương quan nồng độ lysozyme khả kháng E coli, Listeria monocytogens 44 4.2 Tương quan nồng độ nisin khả kháng E coli, Listeria monocytogens 45 4.3 Tương quan nồng độ EDTA khả kháng E coli, Listeria monocytogens 46 4.4 Khả khả kháng E Coli, Listeria monocytogenes hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE) 46 4.5 Ảnh hưởng loại màng khác đến lượng vi sinh vật mặt thịt trình bảo quản 49 4.6 Tác dụng kháng vi sinh vật tác nhân kháng khuẩn gắn lên màng gelatin tuần 51 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 5.1 Kết luận 55 5.2 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 -V- DANH MỤC BẢNG Bảng Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo thành tế bào vi khuẩn……………… … Bảng 2.2 Tác dụng lysozyme lên vi sinh vật khác từ nguồn thực phẩm khác nhau……………………………… Trang 23 Bảng 3.1 Phương pháp pha dung dịch lysozyme có nồng độ cần khảo sát………… 38 Bảng 3.2 Phương pháp pha dung dịch nisin có nồng độ cần khảo sát……………… 39 Bảng 3.3 Phương pháp pha dung dịch EDTA có nồng độ cần khảo sát…………… 39 Bảng 3.4 Phương pháp pha hỗn hợp dung dịch kháng Listeria monocytogenes có nồng độ cần khảo sát…………………………………………………… 40 Bảng 3.5 Phương pháp pha hỗn hợp dung dịch kháng E.coli có nồng độ cần khảo sát…… 41 Bảng 3.6 Thành phần chất có màng kháng Listeria monocytogenes………… 42 Bảng 3.7 Thành phần chất có màng kháng E.coli…………………………… 43 Bảng 4.1 Tương quan giữa nồng độ lysozyme hiệu suất kháng E coli, Listeria monocytogens…………………………………………………… 44 Bảng 4.2 Tương quan nồng độ nisin hiệu suất kháng E coli, Listeria monocytogens 45 Bảng 4.3 Tương quan nồng độ EDTA hiệu suất kháng E coli, Listeria monocytogens…………………………………………………………… Bảng 4.4 Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ chất hỗn hợp LNE E.coli ………………………………………………………… Bảng 4.4 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes bề mặt thịt màng gelatin có gắn tác nhân kháng khuẩn tuần …………………… Bảng 4.5 Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ chất hỗn hợp LNE Listeria monocytogenes ………………………………………… Bảng 4.6 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes bề mặt thịt màng gelatin có gắn tác nhân kháng khuẩn tuần …………………… Bảng 4.7 Tác dụng kháng E.coli bề mặt thịt màng gelatin có gắn tác nhân kháng khuẩn tuần ………………………………………… 46 47 48 51 51 53 - VI - DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị Đồ thị 4.1 Bề mặt đáp ứng hiệu suất kháng Listeria monocytogenes nhân tố kháng khuẩn……………………………………………… Đồ thị 4.2 Ảnh hưởng màng kháng khuẩn khác lên lương Listeria monocytogenes bề mặt thịt………………………………………… Đồ thị 4.3 Ảnh hưởng màng kháng khuẩn khác lên lương E Coli bề mặt thịt………………………………………………………… Đồ thị 4.4 Khả khả kháng E Coli, Listeria monocytogenes hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE)……………… Đồ thị 4.5 Tác dụng kháng Listeria monocytogenes bề mặt thịt màng gelatin có gắn tác nhân kháng khuẩn tuần………………… Đồ thị 4.6 Tác dụng kháng E.coli bề mặt thịt màng gelatin có gắn tác nhân kháng khuẩn tuần……………………………………… Trang 47 49 50 52 52 53 - VII - DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 2.1 Cấu tạo lớp peptidoglican…………………………………………… Hình 2.2 Cấu trúc thành tế bào vi khuẩn G+, G_……………………………… Hình 2.3 Các cách tác động chất kháng khuẩn lên vi khuẩn……………… Hình 2.4 Cấu trúc bậc lysozyme……………………………………… 10 Hình 2.5 Cấu trúc bậc lysozyme………………………………………… 11 Hình 2.6 Cơ chế phân cắt chất lysozyme ……………………………… 14 Hình 2.7 Cấu tạo Nisin…………………………………………………… 15 Hình 2.8 Phân tử EDTA……………………………………………………… 16 - VIII - DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ đầy đủ Từ viết tắt Escherichia coli E coli Ethylenediaminetetraacetic EDTA Gram âm G- Gram dương G+ Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme - nisin NE Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme - EDTA LE Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin LN Hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin - EDTA Màng kháng khuẩn gelatin Màng kháng khuẩn gelatin có gắn EDTA Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – EDTA Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin - EDTA Màng kháng khuẩn gelatin có gắn hỗn hợp kháng khuẩn nisin - EDTA LNE G GE GLE GLN GLNE GNE Màng kháng khuẩn gelatin có gắn lysozyme GL Màng kháng khuẩn gelatin có gắn nisin GN Mẫu trắng C Môi trường lỏng dinh dưỡng nutrient broth NB Môi trường rắn dinh dưỡng nutrient agar NA N-acetylglucosamine NAG N-acetylmuramic NAM Peptidoglican PG - IX - TÓM TẮT NỘI DUNG Khảo sát khả kháng khuẩn enzyme lysozyme thử nghiệm sử dụng lysozyme lên màng bao kháng khuẩn để bảo quản thịt heo Lysozyme enzyme tìm thầy nhiều lịng trắng trứng, nước mắt, sữa, nước bọt số loại rau, củ, Enzyme có hoạt tính làm tan thành tế bào vi khuẩn cách thủy phân liên kết 1,4 acit N-acetyl muramic, N-acetyl glucosamine mucopolysacharit peptidoglucan thành tế bào vi khuẩn Lysozyme Fleming phát năm 1922 từ đến có nhiều nghiên cứu nhiều tính chất, ứng dụng Nghiên cứu khảo sát khả kháng khuẩn (G+, G-) lysozyme, tăng cường khả cách kết hợp với tác nhân kháng khuẩn khác, bước đầu tiến hành thử nghiệm bảo quản thịt heo cách tạo màng kháng khuẩn Sử dụng hai loại vi sinh vật thị E Coli, listeria monocytogenes để khảo sát khả kháng khuẩn lysozyme, hỗn hợp chứa lysozyme thu kết sau: Lysozyme có hiệu chống lại Listeria monocytogenes bị hạn chế E coli Với nồng độ 500 µg/ml diệt 99,99 % Listeria monocytogenes, 48.917% E.coli Khi kết hợp với EDTA, nisin khả kháng khuẩn lysozyme tăng cường o Để ức chế 99,99 Listeria monocytogenes, lysozyme kết hợp với nisin theo tỷ lệ: 150:125 o Để ức chế 99,012 , lysozyme kết hợp với nisin EDTA theo tỷ lệ lysozyme:nisin:EDTA: 500:500:125 Màng gelatin (7%) có gắn hỗn hợp lysozyme : nisin: 150:125 để phủ lên miếng thịt nạc 1g nhiễm Listeria monocytogenes lượng Listeria monocytogenes sau 24h nhiệt độ C giảm nhiều so với tác nhân gắn lên màng Màng gelatin (7%) có gắn hỗn hợp lysozyme : nisin: EDTA để phủ lên miếng thịt nạc 1g nhiễm E.coli lượng sau 24h nhiệt độ 40C giảm nhiều so với tác nhân gắn lên màng E.coli Đối với thịt cho nhiễm vi sinh vật nhân tạo để môi trường lạnh màng GLN có tác dụng ức chế Listeria monocytogenes ngày, sau hoạt tính giảm dần theo thời gian Đối với thit cho nhiễm vi sinh vật nhân tạo để môi trường lạnh màng GLNE có tác dụng ức chế E.coli 35 ngày -X- ABSTRACT Survey the antiviral ability of lysozyme, initiating experiment sticking enzyme lysozyme the antimicrobial film to preserve pork Lysozyme is one kind of enzyme found mostly in egg white, tear , slaver and several kinds of vegetable This enzyme has the ability to dissolve bacterium’s cell wall by hydrolysising the link 1-4 between acit N-acetyl muramic, N-acetyl glucosamine of mucopolysacharit in peptidoglucan of bacterium’s cell wall Lysozyme was found by Fleming in 1922 and have been attracting many researches and applications since then This research survey the antiviral ability (G+, G-) of lysozyme, strengthening this ability by combining with others agent that have antiviral ability This also initially experiment preserving pork by creating the antiviral membrane Using two kinds of micro-organism as indicators: E.coli and listeria monocytogenes to screen antiviral ability of lysozyme, and the compound that contain lysozyme, we obtain result as follow: Lysozyme has effectiveness when it resists Listeria monocytogenes, but restricts to E coli With the concentration of 500 µg/ml, Lysozyme can kill 99,99 % Listeria monocytogenes, 48.917% E.coli Antiviral ability of lysozyme will be strengthened when combine with EDTA, nisin Combination of 150 µg/ml lysozyme and 125 µg/ml nisin treatments inhibit 99,99% Listeria monocytogenes Combination of 500 µg/ml lysozyme and 500 µg/ml nisin, 125 EDTA treatments inhibit 99,012% E.coli Stick agents of antiviral ability on to the gelatin film (7%) that contain lysozyme, nisin, mixture of lysozyme – nisin respectively , then use it to cover a piece of 1gram pork which is inoculated Listeria monocytogenes in environment of degree Celcius, 24 hours The result is that the quatity of Listeria monocytogenes most decreased when we use the film containing lysozyme – nisin Stick agents of antiviral ability on to the gelatin film (7%) that contain lysozyme, nisin, mixture of lysozyme – nisin respectively , then use it to cover a piece of 1gram pork which is inoculated E.coli in environment of degree Celcius, 24 hours The result is that the quatity of E.coli most decreased when we use the membrane containing lysozyme – nisin – EDTA For the pork contaiminated artificial micro-organism in environment of degree Celcius, Lysozyme only inhibit Listeria monocytogenes in days, after that, its active ability decrease gradually For the pork contaiminated artificial micro-organism in environment of degree Celcius, Lysozyme only inhibit E.coli in 35 days - 45 - Qua bảng cho thấy hiệu suất kháng khuẩn lysozyme tỷ lệ thuận với nồng độ lysozyme Hiệu suất kháng khuẩn lysozyme Listeria monocytogenes cao so với E coli khác biệt có ý nghĩa P>0.5 Kết phù hợp với nghiên cứu Alexander Ogilvie Gill Điều giải thích thành tế bào Listeria monocytogenes có lớp peptidoglican chất để enzyme lysozyme phân giải Thành tế bào E Coli chịu tác động lysozyme thấp có lớp polisacharit phía ngồi bảo vệ chất peptidoglican Tuy nhiên lysozyme tác động đến vi khuẩn E.Coli nhờ cấu trúc xoắn ốc tác động đến lớp màng thành tế bào E.Coli 4.2 Tương quan nồng độ nisin khả kháng E coli, Listeria monocytogens Sử dụng nồng độ nisin khác ức chế E coli, Listeria monocytogens, thu hiệu suất kháng khuẩn khác Kết thể bảng 4.2 Bảng 4.2 Tương quan nồng độ nisin hiệu suất kháng E coli, Listeria monocytogens Hiệu suất kháng Listeria monocytogenes E.coli nisin (H%) Nồng độ nisin ( µg/ml) Hiêu suất kháng khuẩn Nisin Listeria monocytogenes E coli 2000 85.34 1000 78.924 500 99.43 48.917 250 78.209 29.679 125 71.765 17.627 Số liệu thể trung bình lần lặp, p ≤ 0,05 Qua bảng cho ta thấy hiệu suất kháng khuẩn nisin tỷ lệ thuận với nồng độ nisin Hiệu suất kháng khuẩn nisin Listeria monocytogenes cao so với E coli Kết phù hợp với nghiên cứu Fang Lin Với nồng độ nisin 500 µg/ml ức chế tới 99,43% Listeria monocytogenes 48.9 µg/ml E Coli Vi khuẩn Gram + Listeria monocytogenes bị ức chế nisin cấu tạo thành tế bào mỏng có nhiều lỗ hổng để nisin công vào Đối với E Coli, loại Gram – có thành tế bào dày nên khả công vào lỗ hổng thấp - 46 - 4.3 Tương quan nồng độ EDTA khả kháng E coli, Listeria monocytogens Sử dụng nồng độ EDTA khác ức chế E coli, Listeria monocytogens, thu hiệu suất kháng khuẩn khác Kết qủa thể bảng 4.3 Bảng 4.3 Tương quan nồng độ EDTA hiệu suất kháng E coli, Listeria monocytogens Hiệu suất kháng Listeria monocytogenes E.coli EDTA (H%) Nồng độ EDTA ( µg/ml) Hiêu suất kháng khuẩn EDTA Listeria monocytogenes E coli 2000 79.32 72.42 1000 62.34 47.31 500 52.42 46.4 250 19.31 14.42 125 12.3 7.31 Số liệu thể trung bình lần lặp, p ≤ 0,05 Qua bảng cho ta thấy hiệu suất kháng khuẩn EDTA tỷ lệ thuận với nồng độ Hiệu suất kháng khuẩn EDTA E coli cao so với Listeria monocytogenes 4.4 Khả kháng E Coli, Listeria monocytogenes hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE) Khả kháng Listeria monocytogenes hỗn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE) Sử dụng phần mềm Statgraphic để dị tìm quan hệ tối ưu khả kháng khuẩn hỗn hợp nhân tố lysozyme, nisin EDTA Listeria monocytogenes Phương trình hồi qui ban đầu thu được: H = -66.5671 + 0.136725*EDTA + 0.527841*lysozyme + 0.469941*nisin (I) Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ tác nhân lysozyme, nisin, EDTA hỗn hợp LNE Listeria monocytogenes , thể bảng 4.4 - 47 - Bảng 4.4 Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ chất hỗn hợp LNE Listeria monocytogenes Source Sum of Squares Mean Square F-Ratio P-Value EDTA 427.911 427.911 7.05 0.0566 lysozyme 1388.34 1388.34 22.89 0.0087 nisin 1100.47 1100.47 18.14 0.0131 Residual 242.624 60.656 Total (corrected) 3000.23 Dựa vào bảng 4.4 thấy ảnh hưởng EDTA hỗn hợp LNE hiệu suất kháng Listeria monocytogenes không đáng kể (P=0.0566>0.05) Loại EDTA khỏi hỗn hợp Phương trình hồi qui đánh giá mức độ ảnh hưởng tác nhân lysozyme, nisin đến khả kháng Listeria monocytogenes hỗn hợp LN: H = -36.2313 + 0.51075*lysozyme + 0.45285*nisin (II) Từ phương trình hổi qui (II), xây dựng bề mặt đáp ứng hiệu suất kháng Listeria monocytogenes nhân tố kháng khuẩn: Hiêu suât kháng khuân cua L-N -36.2313 + 0.51075*X + 0.45285*Y 86 76 66 56 46 36 75 85 95 105 Nong nisin 115 125 Function 36.0-41.0 41.0-46.0 46.0-51.0 51.0-56.0 56.0-61.0 61.0-66.0 66.0-71.0 71.0-76.0 125 76.0-81.0 115 105 81.0-86.0 95 85 86.0-91.0 75 nong lysozyme Đồ thị 4.1 Bề mặt đáp ứng hiệu suất kháng Listeria monocytogenes nhân tố kháng khuẩn Bằng phương pháp chồng đồ thị, để đạt hiệu suất kháng Listeria monocytogenes 99 ±10%, Công thức Lysozyme : nisin : 150:125 chọn tiến - 48 - hành thí nghiệm X với độ lặp lần có giá trị trung bình: 99 ± 3.22 so với giá trị trung bình tính theo mơ hình 99.012 Giá trị tính thực nghiệm cơng thức Lysozyme : nisin : 150:125 có giá trị trung bình gần giống với giá trị tính tốn theo mơ hình có giá trị trung bình gần giống với giá trị tính tốn theo mơ hình nên chọn toán tối ưu Khả kháng E.Coli hỗn hỗn hợp kháng khuẩn lysozyme – nisin – EDTA (LNE) Sử dụng phần mềm Statgraphic để dị tìm quan hệ tối ưu khả kháng khuẩn hỗn hợp nhân tố lysozyme, nisin EDTA E Coli Phương trình hồi qui ban đầu thu được: H = -43.67 + 0.11385*EDTA + 0.1367*lysozyme + 0.1421*nisin (III) Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ tác nhân lysozyme, nisin, EDTA hỗn hợp LNE E Coli , thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết thống kê ảnh hưởng nồng độ chất hỗn hợp LNE E.coli Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value EDTA 1620.23 1620.23 28.18 0.0061 lysozyme 631.013 583.965 10.16 0.0333 631.013 10.97 0.0296 16.44 0.0103 nisin Residual 2835.21 945.069 Total (corrected) 230.005 57.5011 Dựa vào bảng 4.4 thấy ảnh hưởng nhân tố hỗn hợp LNE ảnh hưởng đến hiệu suất kháng E Coli đáng kể (P