Khảo sát khả năng ức chế trực khuẩn mủ xanh và tụ cầu vàng của bacillus subtilis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN MẠNH HÙNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH VÀ TỤ CẦU VÀNG CỦA BACILLUS SUBTILIS CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 09 NĂM 2012 i MỤC LỤC CHƯƠNG – MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học 1.3.2 Ý nghĩa thực tế CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CÁC ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT 2.1.1 Pseudomonas aeruginosa 2.1.2 Staphylococcus aureus 2.1.3 Bacillus subtilis 2.2 TÍNH CHẤT GÂY BỆNH, XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG VÀ ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH VÀ TỤ CẦU VÀNG 2.2.1 Nhiễm khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa 2.2.1.1 Tính chất gây bệnh 2.2.1.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 2.2.1.3 Điều trị nhiễm khuẩn mủ xanh 2.2.2 Nhiễm khuẩn mủ vàng Staphylococcus aureus 2.2.2.1 Tính chất gây bệnh 2.2.2.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 2.2.2.3 Điều trị nhiễm khuẩn mủ vàng 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ NHIỄM KHUẨN 2.3.1 Điều trị kháng sinh 2.3.1.1 Phân loại thuốc kháng sinh 10 2.3.1.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh vi khuẩn 11 2.3.2 Điều trị vaccine huyết 12 2.3.2.1 Vaccine 12 2.3.2.2 Auto-vaccine 13 2.3.2.3 Huyết (kháng huyết thanh) 14 2.3.3 Phương pháp dùng vi sinh vật ức chế 14 2.3.3.1 Tác động kháng khuẩn 14 2.3.3.2 Tác động miễn dịch 15 2.3.3.3 Tác động đến vi khuẩn đường ruột 15 ii 2.3.3.4 Tác động khả hấp thụ thức ăn 15 2.3.3.5 Tác động lên biểu mô 15 2.4 TÍNH CHẤT ƯU VIỆT CỦA BACILLUS SUBTILIS 16 2.4.1 Khả ức chế cạnh tranh 16 2.4.2 Khả tổng hợp hợp chất kháng khuẩn 18 2.4.2.1 Lantibiotic 19 2.4.2.2 Lipopeptide 20 2.4.2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác 21 2.5 NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI 22 CHƯƠNG – NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 24 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.3 ĐỊA ĐIỂM VÀ TRANG THIẾT BỊ PHỤC VỤ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 24 3.3.1 Địa điểm thực đề tài nghiên cứu 24 3.3.2 Trang thiết bị phục vụ công tác nghiên cứu 24 3.4 THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM NỘI DUNG 25 3.4.1 Chuẩn bị giống gốc chủng 26 3.4.2 Hoạt hóa, tăng sinh khảo sát đặc điểm sinh lý lưu giữ chủng giống 26 3.4.3 Thử nghiệm khả ức chế 26 3.4.4 Xác định điều kiện tối ưu cho trình ức chế 27 3.4.4.1 Tỷ lệ đối kháng 27 3.4.4.2 Lựa chọn thời điểm thích hợp để kết thúc trình ức chế 28 3.4.4.3 Xác định pH tối ưu 28 3.4.4.4 Xác định nhiệt độ tối ưu 28 3.5 THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM NỘI DUNG 29 3.5.1 Thu thập tăng sinh mẫu 29 3.5.2.1 Thu thập mẫu 29 3.5.2.1 Tăng sinh mẫu 29 3.5.2 Thử kháng sinh đồ phương pháp đĩa kháng sinh 30 3.5.3 Thử nghiệm khả ức chế trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng 30 3.5.3.1 Chuẩn bị đĩa giấy lọc tẩm Bacillus subtilis 30 3.5.3.2 Thử nghiệm ức chế bệnh phẩm 30 CHƯƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 31 4.1 ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ CỦA CÁC CHỦNG GIỐNG NGHIÊN CỨU 31 4.1.1 Bacillus subtilis BK (Ký hiệu BS1) 31 4.1.2 Bacillus subtilis BK (Ký hiệu BS2) 33 iii 4.1.3 Bacillus subtilis BK (Ký hiệu BS3) 34 4.1.4 Bacillus subtilis VTCC 254 (Ký hiệu BS4) 35 4.1.5 Bacillus subtilis AS 162 (Ký hiệu BS5) 36 4.1.6 Staphylococcus aureus HV (Ký hiệu SA1) 37 4.1.7 Pseudomonas aeruginosa BD (Ký hiệu PA1) 38 4.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG BACCILUS SUBTILIS TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ỨC CHẾ 39 4.2.1 Ức chế tụ cầu vàng 39 4.2.2 Ức chế trực khuẩn mủ xanh 40 4.2.3 Đối tượng tuyển chọn 41 4.3 CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ỨC CHẾ TỤ CẦU VÀNG 42 4.3.1 Xác định tỷ lệ đối kháng BS4:SA1 42 4.3.2 Xác định thời điểm kết thúc trình ức chế 43 4.3.3 Xác định pH tối ưu cho trình ức chế tụ cầu vàng 44 4.3.4 Xác định nhiệt độ tối ưu cho trình ức chế tụ cầu vàng 45 4.3.5 Nhận xét chung điều kiện tối ưu ức chế tụ cầu vàng 46 4.4 CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH 47 4.4.1 Xác định tỷ lệ đối kháng BS4:PA1 47 4.4.2 Xác định thời điểm kết thúc trình ức chế trực khuẩn mủ xanh 48 4.4.3 Xác định pH tối ưu cho trình ức chế trực khuẩn mủ xanh 49 4.4.4 Xác định nhiệt độ tối ưu cho trình ức chế trực khuẩn mủ xanh 50 4.4.5 Nhận xét chung điều kiện thích hợp ức chế trực khuẩn mủ xanh 51 4.5 KẾT QUẢ KHÁNG SINH ĐỒ VÀ THỬ NGHIỆM ỨC CHẾ 52 4.5.1 Kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 52 4.5.2 Kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 53 4.5.3 Nhận xét kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế 55 CHƯƠNG – KẾT LUẬN 56 5.1 NHỮNG KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 56 5.2 NHỮNG MẶT HẠN CHẾ VÀ ĐỀ NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO vii PHỤ LỤC x PHỤ LỤC xviii PHỤ LỤC xxiii iv DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các hợp chất kháng khuẩn tổng hợp Ribosome [24] 19 Bảng 2.2 Các hợp chất kháng khuẩn không tổng hợp Ribosome [15] 20 Bảng 2.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác [20] 21 Bảng 4.1 Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) chủng B subtilis tụ cầu vàng 39 Bảng 4.2 Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) chủng B subtilis trực khuẩn mủ xanh 40 Bảng 4.3 Tỷ lệ đối kháng BS4:SA1 42 Bảng 4.4 Thời gian ức chế tụ cầu vàng 44 Bảng 4.5 pH ức chế tụ cầu vàng 45 Bảng 4.6 Nhiệt độ ức chế tụ cầu vàng 46 Bảng 4.7 Tỷ lệ đối kháng BS4:PA1 48 Bảng 4.8 Thời gian ức chế trực khuẩn mủ xanh 49 Bảng 4.9 pH ức chế trực khuẩn mủ xanh 49 Bảng 4.10 Nhiệt độ ức chế trực khuẩn mủ xanh 50 Bảng 4.11 Kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 52 Bảng 4.12 Kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 54 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh vi thể Pseudomonas aeruginosa [29] Hình 2.2 Hình ảnh vi thể Staphylococcus aureus [30] Hình 2.3 Hình ảnh vi thể Bacillus subtilis [28] v Hình 2.4 Probiotic cạnh tranh vị trí bám nhu mơ ruột với đối tượng vi sinh vật gây bệnh [13] 15 Hình 2.5 Màng sinh học B subtilis NCBI 3610 (trái), B subtilis 168 (phải) 17 Hình 2.6 Sự hình thành nội bào tử tế bào Bacillus subtilis [21] 18 Hình 3.1 Sơ đồ thực nghiệm nội dung 25 Hình 3.2 Sơ đồ thiết kế thực nghiệm nội dung 29 Hình 4.1 B subtilis BK 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 31 Hình 4.2 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BK 32 Hình 4.3 B subtilis BK 2: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 33 Hình 4.4 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BK 33 Hình 4.5 B subtilis BK 3: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 34 Hình 4.6 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BK 34 Hình 4.7 B subtilis VTCC 254: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 35 Hình 4.8 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis VTCC 254 35 Hình 4.9 B subtilis AS 162: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 36 Hình 4.10 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng Bacillus subtilis AS 162 36 Hình 4.11 Staphylococcus aureus HV 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 37 Hình 4.12 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng S aureus HV 37 Hình 4.13 Pseudomonas aeruginosa BD 1: (1) vi thể , (2) đại thể, (3) canh khuẩn 38 Hình 4.14 Đồ thị đường cong sinh trưởng chủng P aeruginosa BD 38 Hình 4.15 Đường kính vịng vơ khuẩn chủng B subtilis tụ cầu vàng 40 Hình 4.16 Đường kính vịng vơ khuẩn chủng B subtilis vi khuẩn mủ xanh 41 Hình 4.17 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đối kháng BS4:SA1 42 Hình 4.18 Đồ thị biểu diễn thời gian ức chế tụ cầu vàng 43 Hình 4.19 Đồ thị biểu diễn pH ức chế tụ cầu vàng 44 Hình 4.20 Đồ thị biểu diễn nhiệt độ ức chế tụ cầu vàng 45 Hình 4.21 Một số hình ảnh ức chế tụ cầu vàng 46 Hình 4.22 Đồ thị biểu diễn tỷ lệ đối kháng BS4:PA1 47 vi Hình 4.23 Đồ thị biểu diễn thời gian ức chế trực khuẩn mủ xanh 48 Hình 4.24 Đồ thị biểu diễn pH ức chế trực khuẩn mủ xanh 49 Hình 4.25 Đồ thị biểu diễn nhiệt độ ức chế trực khuẩn mủ xanh 49 Hình 4.26 Một số hình ảnh ức chế trực khuẩn mủ xanh 51 Hình 4.27 Đồ thị biểu diễn kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế tụ cầu vàng 53 Hình 4.28 Đồ thị biểu diễn kết kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế trực khuẩn mủ xanh 54 Hình 4.29 Đĩa kháng sinh đồ thử nghiệm ức chế: (1) tụ cầu vàng, (2) trực khuẩn mủ xanh 55 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CFU/ml : đơn vị tế bào vi sinh vật ml BS1 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis BK BS2 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis BK BS3 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis BK BS4 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis VTCC 254 BS5 : ký hiệu chủng Bacillus subtilis AS 162 SA1 : ký hiệu chủng Staphylococcus aureus HV PA1 : ký hiệu chủng Pseudomonas aeruginosa BD MRSA : Methicillin – resistant Staphylococcus aureus MSSA : Methicillin – sensitive Staphylococcus aureus CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute CHƯƠNG – MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nước nhiệt đới gió mùa, thuận lợi cho đối tượng vi sinh vật gây bệnh tồn tại, phát triển Mặt khác, việc kiểm soát nhiễm khuẩn Việt Nam lỏng lẻo, chưa đồng cộng với tập quán sử dụng kháng sinh thiếu hiểu biết người dân tạo chủng vi khuẩn đột biến, đa kháng thuốc Trong đó, hai điển hình vi sinh vật đa kháng thuốc nguy hiểm trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) Hai chủng vi khuẩn khơng có bào tử có khả tồn thích ứng cao với điều kiện khắc nghiệt môi trường Do đó, việc sử dụng kháng sinh phổ kháng khuẩn rộng thiếu kiểm sốt làm cho chúng biến chủng có khả đề kháng với hầu hết kháng sinh họ β–lactamins Cephalosporins hệ I II Thêm vào đó, cơng tác chống nhiễm khuẩn bệnh viện không thực tốt giúp cho đối tượng tồn điều kiện cực đoan ngày độc với tên “vi trùng bệnh viện”; nỗi ám ảnh bệnh nhân có thời gian điều trị nội trú dài tháng Việc điều trị nhiễm trùng mủ xanh tụ cầu vàng khó khăn tốn Hầu hết bệnh nhân có kết xét nghiệm dương tính với Pseudomonas aeruginosa điều trị tích cực kết hợp kháng sinh họ Penicillin kháng sinh họ Aminoglycoside Đối với tụ cầu vàng kháng Methicillin (Methicillin resistant Staphylococcus aureus, gọi tắt MRSA) trị liệu Vancomycin liều cao từ đầu lựa chọn cần thiết Tuy nhiên, việc điều trị lúc thành công Một số trường hợp bệnh nhân tử vong ba nguyên nhân sau: thứ nhất, việc điều trị khơng tích cực từ đầu làm cho vi khuẩn biến dị đa kháng thuốc; thứ hai, đường xâm nhập vi khuẩn (nhiễm trùng máu hay viêm màng não); thứ ba, sức đề kháng bệnh nhân yếu dẫn đến nhiễm trùng hội Ở nguyên nhân thứ nhất, vi khuẩn biến dị thành nhiều type tồn song song truyền khả kháng thuốc qua lại lẫn dẫn đến việc điều trị vào bế tắc tính mạng bệnh nhân bị đe dọa Ngoài phương pháp điều trị bệnh nhiễm chất kháng sinh, có phương pháp khác ứng dụng vi sinh vật ức chế cạnh tranh lẫn để loại bỏ đối tượng vi sinh vật gây bệnh Trong điều kiện định, vi sinh vật muốn tồn phát triển phải có chế ức chế (sản xuất chất kháng khuẩn, chất nhày, sản phẩm trao đổi chất bậc hai) chế lấn át (cạnh tranh vị trí bám, khả tăng trưởng, khả chuyển hóa hấp thụ chất dinh dưỡng) đối tượng vi sinh vật khác Các nghiên cứu lý thuyết ức chế cạnh tranh vi sinh vật tạo tiền đề cho đề tài Trong luận văn, dừng lại giai đoạn “Khảo sát khả ức chế trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng Bacillus subtilis”, làm tiền đề khả ứng dụng phương pháp điều trị vào lâm sàng 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Có hai mục tiêu chính: - Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có hoạt lực ức chế trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng điều kiện tối ưu invitro Từ lựa chọn chủng có ưu - Bước đầu thử nghiệm bệnh phẩm thu thập số liệu 1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Ý nghĩa khoa học - Áp dụng lý thuyết vi sinh vật ức chế vi sinh vật điều kiện định để khảo sát khả ức chế hai đối tượng gây bệnh cho người trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng Bacillus subtilis - Xác định điều kiện tối ưu cho trình ức chế - Dự đốn tính khả thi q trình ức chế tiền thử nghiệm cận lâm sàng 1.3.2 Ý nghĩa thực tế Đề tài có quy mơ nhỏ nhân lực điều kiện thực nghiệm; nhiên phạm vi ứng dụng đề tài lớn (không đề cập đến ứng dụng probiotic Bacillus subtilis): - Mở hướng điều trị bệnh nhiễm không dùng kháng sinh bị bỏ ngỏ từ thập niên 1950 đến - Khả ứng dụng vào sản phẩm y tế: băng gạc (medical gauze) có tẩm sản phẩm trao đổi chất Bacillus subtilis điều trị vết thương da, điều trị mụn CHƯƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CÁC ĐỐI TƯỢNG VI SINH VẬT 2.1.1 Pseudomonas aeruginosa Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Bộ: Pseudomonadales Họ: Pseudomonadaceae Chi: Pseudomonas Loài: Pseudomonas aeruginosa Hình 2.1 Hình ảnh vi thể Pseudomonas aeruginosa [29] Pseudomonas aeruginosa gây bệnh cho người trực khuẩn Gram âm, thường sống nơi ẩm ướt đất, nước, cối, … kể bệnh viện Trên thể người, vi khuẩn thường sống vùng da ẩm, số cộng sinh đường tiêu hóa (được phân lập khoảng 1/10 phân người bình thường) Ngồi ra, cịn tìm thấy dung dịch nhỏ mắt, mỹ phẩm, dung dịch Phenol loãng, Benzalkinium chloride, xà nước Hexachlorophene, kem, nước cắm hoa, bồn tắm, máy hút ẩm, máy thơng khí, vật dụng vải bệnh viện, túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn ngân hàng máu, … [29] 2.1.1.1 Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa trực khuẩn Gram âm, thẳng hay cong; có khả di động nhờ hay hai tiên mao đầu Kích thước 0,6x2,0 μm; nhiên, hình dạng kích thước vi khuẩn thay đổi lứa cấy già [27] xviii PHỤ LỤC 1.1 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO B SUBTILIS BK (BS1) TG (h) D CFU/ml Log(CFU/ml) OD (600 nm) 2 4,126,529,894 9.616 0.03 10,316,324,736 10.014 0.03 10,965,287,029 10.040 0.1 10 21,740,273,332 10.337 0.09 10 50 106,358,573,616 11.027 0.065 12 50 193,216,853,014 11.286 0.75 14 100 202,761,268,705 11.307 0.01 16 100 203,469,351,079 11.308 0.014 18 100 203,469,351,079 11.308 0.014 20 100 203,469,351,079 11.308 0.014 22 100 205,967,169,144 11.314 0.028 24 100 206,146,753,638 11.314 0.029 26 100 206,686,447,155 11.315 0.032 28 100 207,227,553,593 11.316 0.035 30 100 206,506,392,507 11.315 0.031 32 100 207,408,237,027 11.317 0.036 34 100 207,227,553,593 11.316 0.035 36 100 207,589,078,000 11.317 0.037 38 100 207,227,553,593 11.316 0.035 40 100 207,408,237,027 11.317 0.036 42 100 207,047,027,561 11.316 0.034 44 100 205,967,169,144 11.314 0.028 46 100 205,250,394,252 11.312 0.024 48 100 204,892,942,753 11.312 0.022 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: y = 0.3785x + 9.3032 1.2 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO B SUBTILIS BK (BS2) TG (h) 10 12 14 D 5 10 50 50 100 CFU/ml 3,426,064,980 8,321,361,790 8,321,361,790 18,374,807,585 85,651,624,494 103,123,490,463 167,806,044,350 Log(CFU/ml) 9.535 9.920 9.920 10.264 10.933 11.013 11.225 OD (600 nm) 0.032 0.018 0.018 0.066 0.032 0.122 0.022 xix 16 100 167,115,218,070 11.223 0.02 18 100 167,806,044,350 11.225 0.022 20 100 167,806,044,350 11.225 0.022 22 100 168,499,726,390 11.227 0.024 24 100 168,847,642,007 11.227 0.025 26 100 169,545,629,837 11.229 0.027 28 100 169,895,705,020 11.230 0.028 30 100 168,152,527,663 11.226 0.023 32 100 168,847,642,007 11.227 0.025 34 100 168,152,527,663 11.226 0.023 36 100 168,847,642,007 11.227 0.025 38 100 169,895,705,020 11.230 0.028 40 100 168,847,642,007 11.227 0.025 42 100 167,115,218,070 11.223 0.02 44 100 165,742,085,811 11.219 0.016 46 100 166,084,307,495 11.220 0.017 48 100 164,719,645,899 11.217 0.013 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: Y = 0.8958x + 9.2051 1.3 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO B SUBTILIS BK (BS3) TG (h) 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 D 5 10 50 50 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 CFU/ml 2,964,838,187 7,501,235,570 8,254,052,071 13,853,222,194 72,081,996,047 91,550,939,273 139,640,694,467 139,640,694,467 139,640,694,467 139,640,694,467 140,198,252,369 141,884,318,983 138,532,221,942 141,884,318,983 142,450,835,238 141,884,318,983 139,640,694,467 143,019,613,481 141,884,318,983 Log(CFU/ml) 9.472 9.875 9.917 10.142 10.858 10.962 11.145 11.145 11.145 11.145 11.147 11.152 11.142 11.152 11.154 11.152 11.145 11.155 11.152 OD (600 nm) 0.035 0.038 0.062 0.018 0.028 0.088 0.02 0.02 0.02 0.02 0.021 0.024 0.018 0.024 0.025 0.024 0.02 0.026 0.024 xx 40 100 141,884,318,983 11.152 0.024 42 100 137,432,548,509 11.138 0.016 44 100 135,259,320,084 11.131 0.012 46 100 135,799,384,017 11.133 0.013 48 100 134,185,627,055 11.128 0.01 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: Y = 1.7306x + 9.1104 1.4 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO B SUBTILIS BK (BS4) TG (h) D CFU/ml Log(CFU/ml) OD (600 nm) 2 3,163,419,560 9.500 0.013 7,812,787,360 9.893 0.01 10,899,867,141 10.037 0.092 10 19,615,419,478 10.293 0.066 10 50 88,969,511,155 10.949 0.042 12 50 144,834,893,503 11.161 0.162 14 100 158,170,978,017 11.199 0.013 16 100 158,170,978,017 11.199 0.013 18 100 158,170,978,017 11.199 0.013 20 100 156,255,747,208 11.194 0.01 22 100 161,415,338,054 11.208 0.018 24 100 162,072,152,471 11.210 0.019 26 100 164,058,675,112 11.215 0.022 28 100 164,058,675,112 11.215 0.022 30 100 166,745,299,450 11.222 0.026 32 100 165,396,532,337 11.219 0.024 34 100 166,745,299,450 11.222 0.026 36 100 164,058,675,112 11.215 0.022 38 100 167,423,801,989 11.224 0.027 40 100 164,058,675,112 11.215 0.022 42 100 162,731,639,529 11.211 0.02 44 100 162,731,639,529 11.211 0.02 46 100 158,814,590,824 11.201 0.014 48 100 157,529,973,519 11.197 0.012 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: Y = 0.7636x + 9.1762 1.5 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO B SUBTILIS BK (BS5) TG (h) D CFU/ml 3,624,679,367 7,614,545,820 Log(CFU/ml) 9.559 9.882 OD (600 nm) 0.054 0.01 xxi 8,990,312,840 9.954 0.052 10 15,350,014,851 10.186 0.012 10 10 20,325,638,631 10.308 0.083 12 50 87,103,499,623 10.940 0.044 14 50 102,435,149,200 11.010 0.085 16 100 155,947,493,911 11.193 0.016 18 100 155,947,493,911 11.193 0.016 20 100 155,947,493,911 11.193 0.016 22 100 157,185,760,271 11.196 0.018 24 100 158,433,858,810 11.200 0.02 26 100 160,959,865,324 11.207 0.024 28 100 162,237,931,304 11.210 0.026 30 100 161,597,634,801 11.208 0.025 32 100 159,691,867,598 11.203 0.022 34 100 161,597,634,801 11.208 0.025 36 100 160,959,865,324 11.207 0.024 38 100 160,959,865,324 11.207 0.024 40 100 162,237,931,304 11.210 0.026 42 100 158,433,858,810 11.200 0.02 44 100 155,947,493,911 11.193 0.016 46 100 155,947,493,911 11.193 0.016 48 100 152,894,336,990 11.184 0.011 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: Y = 1.7174x + 9.1655 1.6 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO P AERUGINOSA BD 1(PA1) TG (h) 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 D 10 10 50 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 CFU/ml 3,657,109,766 8,931,565,757 20,065,325,072 37,086,957,306 65,824,535,026 80,320,573,364 82,480,635,793 84,698,788,814 85,830,135,866 89,315,657,572 92,942,724,686 100,644,720,935 101,989,062,571 101,989,062,571 Log(CFU/ml) 9.563 9.951 10.302 10.569 10.818 10.905 10.916 10.928 10.934 10.951 10.968 11.003 11.009 11.009 OD (600 nm) 0.08 0.026 0.087 0.012 0.003 0.018 0.02 0.022 0.023 0.026 0.029 0.035 0.036 0.036 xxii 30 100 101,989,062,571 11.009 0.036 32 100 101,989,062,571 11.009 0.036 34 100 101,989,062,571 11.009 0.036 36 100 101,989,062,571 11.009 0.036 38 100 89,315,657,572 10.951 0.026 40 100 89,315,657,572 10.951 0.026 42 100 81,393,439,283 10.911 0.019 44 100 74,173,914,612 10.870 0.012 46 100 74,173,914,612 10.870 0.012 48 100 68,497,638,631 10.836 0.006 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: Y = 5.7626x + 8.8011 1.7 BẢNG BIẾN THIÊN MẬT ĐỘ TẾ BÀO S AUREUS HV 1(SA1) TG (h) D CFU/ml Log(CFU/ml) OD (600 nm) 2 3,551,517,800 9.550 0.045 3,693,533,103 9.567 0.06 9,258,000,595 9.967 0.061 10 19,974,135,881 10.300 0.09 10 50 81,450,246,752 10.911 0.012 12 50 101,981,079,393 11.009 0.098 14 100 160,365,595,016 11.205 0.006 16 100 166,342,797,104 11.221 0.02 18 100 168,091,131,254 11.226 0.024 20 100 168,091,131,254 11.226 0.024 22 100 168,091,131,254 11.226 0.024 24 100 168,091,131,254 11.226 0.024 26 100 168,531,078,491 11.227 0.025 28 100 167,214,679,203 11.223 0.022 30 100 169,857,841,146 11.230 0.028 32 100 169,857,841,146 11.230 0.028 34 100 169,414,430,419 11.229 0.027 36 100 168,531,078,491 11.227 0.025 38 100 166,342,797,104 11.221 0.02 40 100 167,214,679,203 11.223 0.022 42 100 163,754,332,846 11.214 0.014 44 100 165,475,461,127 11.219 0.018 46 100 162,051,106,208 11.210 0.01 48 100 161,628,074,818 11.209 0.009 * Log(CFU/ml) tính từ phương trình đường chuẩn mối quan hệ độ đục môi trường OD600nm mật độ tế bào: Y = 1.1352x + 9.1983 xxiii PHỤ LỤC 3.1 XỬ LÝ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 4.2 4.2.1 HUYEN PHU Descriptives Duncan 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error Subset for alpha = 0.05 BS Lower Upper Bound Bound BS1 2.3333 33333 8991 3.7676 BS2 13.0000 1.52753 6.4276 19.5724 BS3 3333 33333 -1.1009 1.7676 BS4 17.3333 1.20185 12.1622 22.5045 BS5 12.0000 57735 9.5159 14.4841 Total 15 9.0000 1.78352 5.1747 12.8253 N BS3 3333 BS1 2.3333 BS5 12.0000 BS2 13.0000 BS4 17.3333 Sig .160 465 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 4.2.1 SINH KHOI Descriptives Duncan Subset for alpha = 0.05 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error BS Lower Upper Bound Bound BS1 6667 33333 -.7676 2.1009 BS2 8.3333 88192 4.5388 12.1279 BS3 3333 33333 -1.1009 1.7676 BS4 15.6667 1.20185 10.4955 20.8378 BS5 10.6667 88192 6.8721 14.4612 Total 15 7.1333 1.60910 3.6822 10.5845 N BS3 3333 BS1 6667 BS2 8.3333 BS5 10.6667 BS4 Sig 15.6667 775 067 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 1.000 xxiv 4.2.1 DICH NGOAI BAO Descriptives Duncan Subset for alpha = 0.05 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error BS Lower Upper Bound Bound BS1 3333 33333 -1.1009 1.7676 BS2 5.6667 88192 1.8721 9.4612 BS3 0000 00000 0000 0000 BS4 14.0000 1.00000 9.6973 18.3027 BS5 4.6667 66667 1.7982 7.5351 Total 15 4.9333 1.37829 1.9772 7.8895 Interval for Mean N Mean Std Error Lower Upper Bound Bound BS1 0000 00000 0000 0000 BS2 7.6667 33333 6.2324 9.1009 BS3 0000 00000 0000 0000 BS4 15.3333 66667 12.4649 18.2018 BS5 0000 00000 0000 0000 Total 15 4.6000 1.64404 1.0739 8.1261 3 0000 BS1 3333 BS5 4.6667 BS2 5.6667 BS4 Sig 14.0000 737 325 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Duncan 95% Confidence BS3 4.2.2 HUYEN PHU Descriptives N 1.000 Subset for alpha = 0.05 BS xxv N BS1 0000 BS3 0000 BS5 0000 BS2 4.2.2 SINH KHOI BS4 Descriptives Duncan Sig 7.6667 15.3333 1.000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error displayed BS Lower Upper Bound Bound BS1 0000 00000 0000 0000 BS2 7.0000 57735 4.5159 9.4841 BS3 0000 00000 0000 0000 BS4 14.0000 1.15470 9.0317 18.9683 BS5 0000 00000 0000 0000 Total 15 4.2000 1.51249 9560 7.4440 for Mean N Mean Std Error Lower Upper Bound Bound BS1 0000 00000 0000 0000 BS2 5.6667 88192 1.8721 9.4612 BS3 0000 00000 0000 0000 BS4 11.6667 88192 7.8721 15.4612 BS5 0000 00000 0000 0000 0000 BS3 0000 BS5 0000 BS2 BS4 Sig 7.0000 14.0000 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed Duncan 95% Confidence Interval N BS1 4.2.2 DICH NGOAI BAO Descriptives Subset for alpha = 0.05 1.000 xxvi Subset for alpha = 0.05 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error BS Lower Upper Bound Bound BS1 0000 00000 0000 0000 BS2 5.6667 88192 1.8721 9.4612 BS3 0000 00000 0000 0000 BS4 11.6667 88192 7.8721 15.4612 BS5 0000 00000 0000 0000 Total 15 3.4667 1.26064 7629 6.1705 N BS1 0000 BS3 0000 BS5 0000 BS2 BS4 3 5.6667 11.6667 Sig 1.000 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 3.2 XỬ LÝ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 4.3 4.3.1 TY LE DOI KHANG BS4:SA1 Descriptives Duncan 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error Upper Bound Bound 3:1 8767 01202 8250 9284 2:1 8900 00577 8652 9148 1:1 8567 00333 8423 8710 1:2 5867 02404 4832 6901 12 8025 03820 7184 8866 Total 4.3.2 THOI DIEM KET THUC QUA TRINH UC CHE Subset for alpha = 0.05 TLDK Lower 1.000 N 1:2 1:1 8567 3:1 8767 2:1 8900 Sig .5867 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed .141 xxvii Descriptives Duncan 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error TDKT Lower Upper Bound Bound 12 5133 01856 4335 5932 16 7333 00882 6954 7713 20 8767 01856 7968 9565 24 8567 02028 7694 9439 28 8733 01764 7974 9492 15 7707 03775 6897 8516 Total Subset for alpha = 0.05 N 12 5133 16 24 8567 28 8733 20 8767 7333 Sig 1.000 1.000 452 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 4.3.3 pH TOI UU Descriptives Duncan Subset for alpha = 0.05 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error pH Lower Upper Bound Bound N 5.5 7433 7.5 8233 8633 5.5 7433 00882 7054 7813 8800 01000 8370 9230 8800 6.5 8867 01453 8242 9492 6.5 8867 8633 01453 8008 9258 Sig 7.5 8233 01453 7608 8858 Means for groups in homogeneous subsets are 15 8393 01491 8074 8713 displayed Total 1.000 4.3.4 NHIET DO TOI UU Descriptives Duncan 051 8633 244 xxviii 95% Confidence Interval Subset for alpha = 0.05 for Mean N Mean Std Error toC Lower Upper Bound Bound 32 7533 00333 7390 7677 37 8667 02028 7794 9539 40 8667 00882 8287 9046 42 8800 01155 8303 9297 45 8900 01155 8403 9397 15 8513 01410 8211 8816 Total N 32 7533 37 8667 40 8667 42 8800 45 8900 Sig 1.000 242 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 3.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM 4.4 4.4.1 TY LE DOI KHANG BS4:PA1 Descriptives Duncan 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error Subset for alpha = 0.05 TLDK Lower Upper Bound Bound 25:1 3767 02848 2541 4992 30:1 6400 01155 5903 6897 35:1 7833 02333 6829 8837 40:1 7867 01764 7108 8626 Total 12 6467 05108 5342 7591 25:1 30:1 35:1 7833 40:1 7867 Sig .3767 6400 1.000 1.000 914 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 4.4.2 THOI DIEM KET THUC QUA TRINH UC CHE Descriptives N Duncan xxix Subset for alpha = 0.05 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error TDKT Lower Upper Bound Bound 12 3467 01764 2708 4226 16 5933 02404 4899 6968 20 7933 01453 7308 8558 24 7767 01453 7142 8392 28 7867 01453 7242 8492 15 6593 04677 5590 7596 Total N 12 3467 16 24 7767 28 7867 20 7933 5933 Sig 1.000 1.000 534 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 4.4.3 pH TOI UU Descriptives Duncan Subset for alpha = 0.05 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Error pH Lower Upper Bound Bound 5.5 6667 01764 5908 7426 7567 01856 6768 8365 6.5 7967 01202 7450 8484 7667 02028 6794 8539 7.5 3733 02906 2483 4984 15 6720 04226 5814 7626 Total 4.4.4 NHIET DO TOI UU N 7.5 5.5 7567 7667 6.5 7967 Sig .3733 6667 1.000 1.000 212 Means for groups in homogeneous subsets are displayed xxx Descriptives N Duncan Mean Std Error 95% Confidence Interval Subset for alpha for Mean = 0.05 Lower Upper Bound Bound 32 7533 00882 7154 7913 37 7767 01856 6968 8565 40 7733 02333 6729 8737 42 7833 01202 7316 8350 45 7367 02404 6332 8401 15 7647 00833 7468 7825 Total toC N 45 7367 32 7533 40 7733 37 7767 42 7833 Sig .130 Means for groups in homogeneous subsets are displayed 3.4 KÉT QUẢ THÍ NGHIỆM 4.5 KẾT QUẢ ỨC CHẾ TỤ CẦU VÀNG MẪU BỆNH PHẨM SA SA SA SA SA SA SA SA SA SA 10 SA 11 SA 12 LOẠI KHÁNG SINH/CHẤT ỨC CHẾ Cz S S R R S R S R R S I I Cm S S S R S S S R R S S S Ak S S S S S S S S R S S S Tb S I S S S S S S R S S S Ci I S S S R R S S R S S R PT S S S S S S R R S S S S Tc S I S S S S R S S S S R Va S S S S S S S S S S S S IPM S S S S S S S S S S S S Ox R S R S S S R R R S S S *BS4 17 16.5 16 16 17 17 15.5 16 16 17 18 16 xxxi SA 13 SA 14 SA 15 SA 16 SA 17 SA 18 SA 19 SA 20 SA 21 SA 22 SA 23 SA 24 SA 25 S S S S S R R R I R R R I S S R S S R S S S R R R S S S R S R S R R S S R S S R R S S S S R R S R R R R I I R R S S S R R R R R R S S S R R S S S S S S R R R R R S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S S R S S S R R S S S S S S R R R R 15 17 17.5 16.5 17 15 15 16 18 15 12 17 16 * Kết quả: S (Sensitive - Nhạy), I (Intermediate - Trung gian), R (Resistance - Kháng) Trị số tham chiếu theo CLSIs * BS4: Tên chế phẩm ức chế Bacillus subtilis VTCC 254 Ghi kết đường kính vịng vơ khuẩn (mm) KẾT QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH MẪU BỆNH PHẨM PA PA PA PA PA PA PA PA PA PA 10 PA 11 PA 12 PA 13 PA 14 PA 15 PA 16 LOẠI KHÁNG SINH/CHẤT ỨC CHẾ Cz S S S S R S S S R R R S S S S R Cm S S S S S S S S S R S S S S S R Ak S S S S R S S S R S S S S S R S Tb I S I S S S R R S S S R R S R R Ci R S S S I R S S I R S S R S I R PT S I S I S S S S S S S I R R S S Tc S S S R S R S S S S R S R S S S IPM S S S S R S S S R S R S S R S S *BS4 14 12 15 13.5 13 13.5 13.5 12 14 15 13 16 12 xxxii PA 17 PA 18 PA 19 PA 20 PA 21 PA 22 PA 23 PA 24 PA 25 R I R S S R R R R S S S S S R S S S S S R R S S S S S S S S R R S S S R S S I R R R R R R S S S R R S S S R R R S S S S R S R R S S S S S S S S 12.5 15.5 14 8.5 14 13 12.5 6.5 * Kết quả: S (Sensitive - Nhạy), I (Intermediate - Trung gian), R (Resistance - Kháng) Trị số tham chiếu theo CLSIs * BS4: Tên chế phẩm ức chế Bacillus subtilis VTCC 254 Ghi kết đường kính vịng vơ khuẩn (mm) ... vật ức chế vi sinh vật điều trị nhiễm khuẩn; khảo sát khả ức chế trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng Bacillus subtilis Trong điều kiện định, chúng tơi tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả ức chế. .. gian ức chế tụ cầu vàng 44 Cho tới thời điểm 16 trình ức chế tụ cầu vàng chưa đạt kết tối ưu Từ thời điểm 20 – 28 giờ, hiệu ức chế đạt 86 – 88% Chúng khảo sát thời điểm sau 32 ức chế, hiệu ức chế. .. sinh vật ức chế vi sinh vật điều kiện định để khảo sát khả ức chế hai đối tượng gây bệnh cho người trực khuẩn mủ xanh tụ cầu vàng Bacillus subtilis - Xác định điều kiện tối ưu cho trình ức chế -