Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)_2

TÓM TẮT NỘI DUNG Kháng sinh tổng hợp được sử dụng trong điều trị bệnh trứng cá hiện nay thường dẫn đến khả năng đề kháng thuốc.. Kết quả thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tất cả

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

SINH VIÊN THỰC HIỆN

LÊ PHƯỢNG HIỆP MSSV: 12D720401113 LỚP: ĐH DƯỢC 7B CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ths DƯƠNG THỊ BÍCH

và làm việc tại trường

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Ths Đỗ Văn Mãi, Thầy Nguyễn Văn Hiền, Cô Quách Thị Thu Hằng, Cô Nghị Ngô Lan Vi đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý và truyền đạt những kinh nghiệm quý giá để em thực hiện tốt bài khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Hội đồng chấm khóa luận tốt nghiệp gồm Thầy PGS TS Trần Công Luận, Thầy PGS TS Nguyễn Văn Bá, Thầy Ths Đỗ Văn Mãi đã nhận xét và đưa ra ý kiến giúp em hoàn thiện bài khóa luận

Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cha mẹ và những người thân yêu đã động viên, tiếp sức em trong suốt quá trình học tập

Cảm ơn các bạn trong tập thể lớp ĐH Dược 7B và tất cả mọi người đã giúp đỡ

và đóng góp ý kiến cho mình trong suốt quá trình học tập

Cuối lời, xin kính chúc quý Thầy, Cô, Cha, Mẹ, Anh, Chị và các bạn luôn khoẻ mạnh và thành công trong cuộc sống

Chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 7 tháng 7 năm 2017

Lê Phượng Hiệp

LỜI CAM KẾT

Em xin cam đoan đây là nghiên cứu của bản thân tôi Các số liệu, kết quả trình bày trong bài khóa luận này là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ khóa luận nào trước đây

Ngày 14 tháng 6 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Lê Phượng Hiệp

TÓM TẮT NỘI DUNG

Kháng sinh tổng hợp được sử dụng trong điều trị bệnh trứng cá hiện nay thường dẫn

đến khả năng đề kháng thuốc Trong những năm gần đây, cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng

kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hoá cao Vì vậy với mục tiêu đề tài là đánh giá và

so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes từ các bộ phận cây Trứng cá rất cần thiết Lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.) được chiết

xuất bằng hệ thống đun hồi lưu với dung môi ethanol 96 % thu được bốn loại cao chiết Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ cây Trứng cá được khảo sát bằng phương pháp khuếch

tán trên giếng thạch trên dòng vi khuẩn P acnes 134N lưu trũ tại phòng thí nghiệm Vi sinh

trường Đại học Tây Đô Kết quả thí nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy tất cả các loại

cao chiết từ bộ phận cây Trứng cá đều có hoạt tính ức chế dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 134N Qua so sánh kích thước khoảng vô khuẩn, cao chiết từ lá Trứng cá có khả năng

ức chế dòng vi khuẩn P acnes 134N cao nhất trong bốn loại cao khảo sát, ở nồng độ 200

mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml lần lượt là 23 ± 1,732 mm; 19 ± 0,000 mm; 16,33 ± 2,082

mm Giá trị MIC của cao chiết từ lá Trứng cá đối với dòng vi khuẩn P acnes 134N là 10

mg/ml Đồng thời tiến hành định tính các hợp chất sinh học trong cao chiết từ lá Trứng cá, kết quả thu được cao chiết ethanol từ lá Trứng cá có chứa hợp chất sinh học như flavonoid, saponin, tanin Từ kết quả đề tài cho thấy, cao chiết ethanol từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non Trứng cá là một nguồn nguyên liệu tự nhiên, tiềm năng cho những nghiên cứu sâu hơn trong điều trị bệnh trứng cá, đặc biệt là nguyên nguyên liệu từ lá Trứng cá

Từ khóa: cây Trứng cá, Propionibacterium acnes, tính kháng khuẩn

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM KẾT ii

TÓM TẮT NỘI DUNG iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH TRỨNG CÁ 3

2.1.1 Phân loại bệnh trứng cá 3

2.1.2 Cơ chế gây bệnh trứng cá 4

2.1.3 Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay 5

2.2 VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES 9

2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes 9

2.2.2 Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes 10

2.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ 12

2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá 12

2.3.2 Phân loại cây trứng cá 13

2.3.3 Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá 13

2.3.4 Tác dụng dược lý cây Trứng cá 15

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 18

2.4.1 Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới 18

2.4.2 Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 20

3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20

3.2.1 Nguyên vật liệu 20

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 20

3.2.3 Hóa chất và môi trường 20

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.3.1 Thiết kế nghiên cứu 21

3.3.2 Cỡ mẫu 21

3.3.3 Phương pháp chọn mẫu 21

3.3.4 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 31

3.5 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 31

3.6 VẤN ĐỀ Y ĐỨC Error! Bookmark not defined. 3.7 BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC SAI SỐ 31

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 KẾT QUẢ 32

4.1.1 Chiết cao 32

4.1.2 Nuôi cấy và định danh vi khuẩn Propionibacterium acnes 32

4.1.3 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá .36

4.1.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá cây Trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes 38

4.1.5 Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết từ lá Trứng cá 40

4.2 THẢO LUẬN 41

4.2.1 Chiết cao 41

4.2.2.Phân lập và định danh vi khuẩn 41

4.2.3 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây trứng cá 42

4.2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao lá trứng cá trên vi khuẩn Propionibacterium acnes 43

4.2.5 Định tính một số hợp chất thiên nhiên trong cao chiết ethanol lá Trứng cá 44

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 KẾT LUẬN 46

5.2 ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 56

Phụ lục 1: Tổng hợp số liệu thí nghiệm 56

Phụ lục 2: Kết quả phân tích thống kê 57

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá 9

Bảng 2.2 Sản phẩm ngoại bào P acnes 11

Bảng 2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá 14

Bảng 3.1: Công thức môi trường TYEG agar 21

Bảng 3.2 Định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol cao chiết trứng cá 30

Bảng 4.1 Kết quả độ ẩm cao cây Trứng cá 32

Bảng 4.2 Kết quả hiệu suất chiết cao từ cây Trứng cá 32

Bảng 4.3 Khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của các loại cao ethanol cây trứng cá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch .36

Bảng 4.4 Kết quả nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu (MIC) của cao chiết lá Trứng cá đối với vi khuẩn P acnes .39

Bảng 4.5 Kết quả định tính một số hợp chất trong dịch chiết ethanol của lá Trứng cá .40

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 2.1 Nang tuyến bã nhờn .5

Hình 2.2 Vi khuẩn P acnes 10

Hình 2.3 Cây trứng cá 12

Hình 2.4 Quả non và quả chín cây Trứng cá 13

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá 23

Hình 3.2 Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ .26

Hình 3.3 Sơ đồ khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết 29

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí tổng quát thí nghiệm 31

Hình 4.1 Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường TYEG agar có bổ sung 0,002 % bromocresol purple .33

Hình 4.2 Hình thái tế bào vi khuẩn P acnes dưới kính hiển vi 33

Hình 4.3 Thử nghiệm catalase trên dòng vi khuẩn 134N 34

Hình 4.4 Kiểm tra khả năng sinh indol trên dòng vi khuẩn 134N 34

Hình 4.5 Kiểm tra khả năng phản nitrat hóa trên dòng vi khuẩn 134N 35

Hình 4.6 Kiểm tra khả năng làm dịch hóa gelatin trên dòng vi khuẩn 134N 35

Hình 4.7 Khả năng ức chế vi khuẩn P acnes của cao chiết ethanol các bộ phân cây Trứng cá ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml; và 50 mg/ml .37

Hình 4.8 Vòng vô khuẩn của cao chiết ethanol lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P acnes ở nồng độ 200 mg/ml; 100 mg/ml và 50 mg/ml 38

Hình 4.9 Giá trị MIC của cao chiết lá Trứng cá ức chế vi khuẩn P acnes 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

M calabura Muntingia calabura L

MBC Minimum bactericidal concentration

P acnes Proipionibacterium acnes

TYEG Tryticase-Yeast extract-Heart extract-Glycerol

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Bệnh trứng cá là bệnh lý về da thường gặp ở lứa tuổi thanh thiếu niên, đặc biệt

là giai đoạn dậy thì, có khoảng 80 % thanh niên Việt Nam bị bệnh trứng cá với mức độ nặng nhẹ khác nhau (Phạm Văn Hiển, 1997) Bệnh trứng cá thường xuất hiện vùng da mặt, lưng và ngực Tuy ít ảnh hưởng sức khoẻ nhưng ảnh hưởng khá lớn đến tâm lý, thẩm mỹ và giao tiếp xã hội của bệnh nhân Nghiên cứu ở thanh thiếu niên bị bệnh trứng cá cho thấy mức độ lo lắng, ngại giao tiếp cao hơn so với người bệnh động kinh

hay hen suyễn (Mallon et al., 1999) Có nhiều nguyên nhân gây bệnh trứng cá như mất

cân bằng nội tiết tố, nhiễm khuẩn, do căng thẳng, chế độ dinh dưỡng hay mỹ phẩm

(Park et al., 2004) Vi khuẩn P acnes được xem là một trong các nguyên nhân chính

gây bệnh trứng cá (Jappe, 2002) Tại bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh khảo sát 87 trường hợp bệnh nhân trứng cá có 42 trường hợp (chiếm 48,3 %) phân lập được

vi khuẩn P acnes (Nguyễn Thanh Hùng, 2013)

Kháng sinh, retinoid và một số chất khác như benzoyl peroxid, acid salicylic, acid azelaic và anpha-hydroxy cho tác dụng điều trị bệnh trứng cá thông thường (Leyden, 2003) Tuy nhiên các thuốc này kèm theo các tác dụng phụ như kích ứng da,

lột da, sạm da (Kennedy et al., 1995) và thời gian điều trị kéo dài dẫn đến hiện tượng

kháng thuốc kháng sinh và thuốc trị mụn (Leyden, 2003) Vì vậy việc tiếp cận các liệu pháp điều trị có nguồn gốc thực vật, đặc biệt là những dược liệu sử dụng phổ biến trong dân gian điều trị bệnh trứng cá đang được nhiều nước trên Thế giới và Việt Nam quan tâm Mục đích nhằm tìm những thuốc mới có hiệu quả, không gây tác dụng phụ

so với các thuốc có nguồn gốc hóa dược và góp phần tận dụng nguồn dược liệu có sẵn

là rất cần thiết

Cây Trứng cá hay còn gọi là Mật sâm trong những năm gần đây được các nhà khoa học quan tâm do chứa nhiều hợp chất sinh học có khả năng kháng khuẩn, kháng viêm và chống oxy hóa cao Lá, vỏ thân, quả và rễ sử dụng như một phương thuốc dân gian điều trị sốt, cảm lạnh, bệnh tiêu hoá, thuốc kháng khuẩn ở khu vực Đông Nam Á Các nghiên cứu đã chứng minh những hợp chất có nguồn gốc từ dược liệu có khả năng kháng vi sinh vật, kháng oxy hoá bao gồm tanin, flavonoid, phenolic (Chenwitheesuk

et al., 2005) Theo các nghiên cứu một số hợp chất phân lập từ cây Trứng cá như

flavonoid, tanin, phenolic (Keneda (1991), Su (2003), Chen (2005)) có khả năng chống các tế bào ung thư và kháng khuẩn Mặt khác cây Trứng cá là loại cây ven đường được trồng khá phổ biến tại các nước Nam Mỹ và khu vực Đông Nam Á (Chin, 1989), dễ thu hái và rẻ tiền là nguồn nguyên liệu sẵn có dễ tìm

Với những lí do trên đề tài “Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh mụn

trứng cá Propionibacterium acnes của cao chiết từ cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)” đã được thực hiện với mục đích cụ thể sau:

1) Xác định và so sánh khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết từ lá, vỏ thân, quả chín và quả non cây Trứng cá (Muntingia calabura L.)

2) Định tính một số hợp chất thiên nhiên có trong cao chiết từ Cây Trứng cá cho hoạt tính kháng khuẩn cao nhất

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

bằng mắt thường (Plewig và Kligman, 2000)

2.1.1 Phân loại bệnh trứng cá

Theo Phạm Hoàng Khâm (2011) bệnh trứng cá được chia thành 2 dạng là tổn thương không viêm như mụn đầu trắng (whitehead) và mụn đầu đen (blackhead) và dạng viêm bao gồm sẩn, mụn mủ, mụn bọc, mụn nang

- Mụn đầu đen hình thành do chất bã bài tiết và tế bào chết làm tắc lỗ nang lông nhưng

bề mặt da hở nên nhân mụn bị không khí oxy hoá tạo màu đen Nhìn vào nang lông thấy màu đen nên gọi là mụn đầu đen hay mụn có cấu trúc mở

- Mụn đầu trắng hình thành khi có quá nhiều chất dầu và tế bào chết gây bít tắc lỗ nang lông và không hở ra da, nên gọi là “nhân đóng”

Theo Hayashi et al., 2008 sử dụng hình thái và số lượng tổn thương phân chia

Theo Tutakne (2003) phân loại bệnh theo bốn cấp độ:

- Cấp 1: mụn trứng cá (comedones, mụn đầu trắng, mụn đầu đen), sẩn (Papules)

- Cấp 2: mụn trứng cá, vài mụn mủ (pustule)

- Cấp 3: mụn mủ, nốt sần (nodules), áp xe (abscess)

- Cấp 4: các u nang (cyst), áp xe, sẹo (scar)

2.1.2 Cơ chế gây bệnh trứng cá

Những yếu tố chính gây bệnh trứng cá là nội tiết tố kích thích tiết bã nhờn, sự sừng hoá (Keratin hoá) bất thường của phễu nang lông, tăng số lượng vi sinh vật trên

da và phản ứng viêm của tế bào chủ Trong đó sự tăng tiết bã nhờn được coi là điều

kiện cần, phản ứng viêm được xem là yếu tố then chốt, còn vi khuẩn P acnes đóng vai trò quan trọng gây ra bệnh trứng cá (Loveckova el al., 2002) Ngoài ra còn các yếu tố

khác như yếu tố di truyền, chế độ dinh dưỡng, môi trường làm việc, khí hậu, lạm dụng

mỹ phẩm cũng có liên qua đến tình trạng bệnh trứng cá (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013)

2.1.2.1 Sự tăng sinh tiết bã nhờn

Bã nhờn được sản xuất bởi tuyến nhờn, chúng có ở mọi nơi trên cơ thể đặc biệt

ở trán, cằm và lưng, có rất ít ở tay hoặc chân, không có ở lòng bàn tay và lòng bàn chân Có hai quá trình liên quan đến sự tổng hợp chất béo của bã nhờn: quá trình tổng hợp triglycerid, acid béo tự do, wax ester, sterol ester và quá trình tổng hợp squalen và

cholesterol (Downie et al., 2004) Hầu hết các tuyến bã nhờn đổ vào nang lông trên bề

mặt da để giữ ẩm cho làn da Những người bị bệnh trứng cá thường có tuyến bã nhờn tiết nhiều chất nhờn trên mức cần thiết Chất nhờn sẽ tích tụ trong lỗ chân lông dẫn đến tắc lỗ chân lông hình thành nhân trứng cá Thành phần chất nhờn trên da bệnh nhân bệnh trứng cá thường có squalen và wax ester cao hơn bình thường và các acid béo tự do (như linoleic) thấp hơn bình thường Sự thiếu hụt acid linileic là yếu tố quan

trọng gây mụn trứng cá (Downie et al., 2004) Acid linoleic điều khiển quá trình tiết

của interleukin (IL-8), gây ra phản ứng viêm (Zouboulis, 2001)

2.1.2.2 Rối loạn bong sừng (sự sừng hoá bất thường ở lỗ chân lông)

Rối loạn bong sừng là hiện tượng lớp tế bào chết ngoài cùng khu vực gần miệng lỗ chân lông kết chặt với nhau và không bong ra, dần dần tạo thành nhiều lớp tế bào chết xếp chồng lên nhau Lớp tế bào chết này sẽ gây hẹp lỗ chân lông dẫn đến bít tắc lỗ chân lông tạo nên môi trường kỵ khí với nhiều chất nhờn thuận lợi cho vi khuẩn

phát triển gây ra mụn (Thiboutot et al., 2009)

2.1.2.3 Vi khuẩn gây bệnh trứng cá:

Các chủng vi khuẩn Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium avidum, Propionibacterium acnes đã được chứng minh hệ vi sinh vật tham gia vào sự phát triển của bệnh trứng cá, trong đó P acnes

được xem là tác nhân gây bệnh trứng cá chính (Hamnerius, 1996)

Propionibacterium acnes thuộc chủng vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, khuẩn lạc màu

vàng nhạt hoặc vàng đậm (do khả năng sinh acid propionic) trên môi trường TYEG agar (có bổ sung bromocresol purple), tế bào hình que, dương tính với catalase Trong

dòng vi khuẩn thuộc giống Propionibacterium thì P granulosum và P avidum không

có khả năng sinh tryptophan, trong khi P acnes cho kết quả dương tính Đây là một trong những đặc điểm quan trọng giúp phân lập được các dòng P acnes (Kishishita et

al., 1980)

2.1.2.4 Phản ứng viêm

Tại các tuyến bã nhờn P acnes tiết ra lipase phân giải triglyceride thành các

acid béo tự do và glycerol Các acid béo tự do khuyếch tán qua thành nang lông, thu hút bạch cầu trung tính đa nhân, chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các

enzym thuỷ phân lysosom, gây ra phản ứng viêm ở lớp hạ bì (Weeks et al., 1977; Pawin et al., 1998)

Hình 2.1 Nang tuyến bã nhờn (Degitiz et al., 2007)

A Nang tuyến bã nhờn bình thường B Nhân mụn C Nang bị vỡ do viêm

2.1.3 Những phương pháp điều trị bệnh trứng cá hiện nay

Bệnh trứng cá liên quan đến nhiều yếu tố gây bệnh nên điều trị phức tạp việc điều trị phải dựa trên từng cá thể bệnh mức độ trầm trọng của bệnh, nguyên nhân gây bệnh mà sử dụng thuốc tại chổ hay toàn thân hoặc kết hợp cả hai để đạt hiệu quả cao Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị bệnh trứng cá mang lại kết quả đáng kể nhưng thời gian điều trị kéo dài và kèm theo tác dụng phụ không mong muốn

2.1.3.1 Sử dụng kháng sinh

Theo một số phác đồ điều trị kháng sinh thường sử dụng là clindamycin, erythromycin, tetracylin

- Dung dịch clindamycin 1 % có hiệu quả trong việc làm giảm vi khuẩn P.acnes

(thường gặp ở vùng da nhờn), có tác dụng tốt đối với mụn mủ, sẩn mủ, nhưng với nang mụn và nhân mụn thì thuốc ít có hiệu quả

- Dung dịch erythromycin 4 % có tác dụng giống clindamycin Sau khi dùng khoảng

12 tuần, khoảng 2/3 bệnh nhân có kết quả tốt

- Khi điều trị kháng sinh tại chỗ thất bại (6 - 8 tuần), nên phối hợp kháng sinh toàn thân cùng với kháng sinh tại chỗ như: tetracyclin: 500mg x 2 lần/ngày; erythromycin

500 mg x 2 lần/ngày; roxithromycin 150 mg x 2 lần/ngày; levofloxacin 500 mg x 2 lần/ngày

Các loại kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn P acnes làm giảm viêm

nhưng tác dụng trong điều trị bị giảm do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn

(Shimonart và Dramaix, 2005) Kháng sinh trong điều trị vi khuẩn mụn trứng cá P acnes đã có nhiều tác giả nghiên cứu Năm 1976, Leyden chưa phát hiện sự kháng kháng sinh của vi khuẩn P acnes (Leyden, 1976) Năm 1979, Crawford cùng cộng sự

đã công bố kháng sinh kháng vi khuẩn P acnes là erythromycin và clindamycin với tỷ

lệ mức 20 % Tỷ lệ kháng kháng sinh 20 % năm 1978 và lên 68 % năm 1996 Theo

một số điều tra gần đây, các nước Địa Trung Hải có tỷ lệ đề kháng của P acnes cao

nhất với erythromycin và clindamycin Ở Tây Ban Nha tỷ lệ kháng với hai loại kháng

sinh này lần lượt là 91 % và 92,4 % Ở Hy Lạp, tỷ lệ P acnes đề kháng cả hai loại erythromycin và clindamycin là 75,3 % và ở Italia là 59,5 % (Ross et al., 2002) Theo Dreno et al., 2001 công bố tỷ lệ dòng vi khuẩn P acnes phân lập từ bệnh nhân chủ yếu

là bị tổn thương kèm theo viêm, kháng lại erthromycin 52 % Những loại kháng sinh điều trị bệnh trứng như ampicilin, erythromycin, roxithromycin, clindamycin được khuyến cáo không sử dụng điều trị dài hạn (quá 3 tháng) (Nishijima, 2000) Khả năng kháng thuốc của vi khuẩn gây mụn không chỉ lây lan giữa các dòng vi khuẩn trên da người bệnh mà còn lây truyền qua người thân và những người mà họ tiếp xúc (Sheafer

et al., 2001) Khả năng đề kháng thuốc kháng sinh của P.acnes có liên quan đến đột

biến gen trên 16S và 23S-rRNA, được phân lập ở các nước Nhật Bản, Úc, Hoa Kỳ và

Châu Âu (Ross et al., 2002) Đột biến gen 23-rRNA kháng lại kháng sinh thuộc nhóm

macrolid- lincosamidestreptogramin B, đặc biệt là erythromycin và clindamycin (Ross

et al, 2002) Tại Việt Nam, khảo sát 87 bệnh nhân tham gia nghiên cứu tạo phòng

khám bệnh viện Da Liễu thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ đề kháng kháng sinh như sau lindamycin 88,1 %; azthromycin 16,7 %; tetracyclin 0 %, doxycylin 0 %; minocyclin

0 %; trimethroprim/sulfamethoxazol 95,2 % (Nguyễn Thanh Hùng và Nguyễn Tất Thắng, 2013) Bên cạnh khả năng kháng kháng sinh trong điều trị bệnh trứng cá, các loại kháng sinh thường gây một số tác dụng không mong muốn như kích ứng da, mẫn ngứa, khô da, da mẫn cảm với ánh sáng (Nguyễn Hữu Sáu, 2010) Vì vậy việc lựa chọn thuốc phải phù hợp với từng bệnh nhân, từng thể bệnh và tuân thủ theo điều trị của thầy thuốc mới đạt kết quả mong muốn

2.1.3.2 Các Peroxid

Là loại thuốc sát khuẩn có tác dụng chống vi khuẩn gây mụn, kháng viêm,

benzoyl peroxid làm giảm nhanh số lượng P acnes tại vùng thương tổn đồng thời

thuốc làm giảm lượng acid béo trên bề mặt da và ức chế tạo nhân trứng cá Benzoyl peroxid có tác dụng tốt đối với trứng cá có viêm ở mức độ nhẹ hay trung bình Nên dùng thuốc có nồng độ từ 2,5 - 5 % bôi vùng mặt, vùng lưng có thể dùng thuốc với nồng độ cao hơn từ 5 - 10 %, khởi đầu có thể bôi ngày 2 lần, khi bệnh giảm tuần bôi 1

- 2 lần Nên sử dụng công thức có chất nền là nước (water-basedformulation) vì ít kích ứng da hơn loại cồn Thuốc này thường gây kích thích da và lột da Cần tránh nắng trong thời gian sử dụng thuốc vì ánh nắng làm cho da cháy đỏ, đen sạm (Simonart và

Dramaix, 2005) Nếu dùng đồng thời với kem chống nắng có chứa acid

paraaminobenzoic sẽ làm da sậm màu một thời gian (Lê Kim Duệ, 2000)

2.1.3.3 Dẫn chất vitamin A acid (tretionid, isoteinoin)

Trước đây vitamin A được xem là yếu tố dinh dưỡng thuần tuý Ngày nay được dùng như một liệu pháp điều trị các trường hợp bệnh trứng cá nặng hoặc trứng cá đề kháng trị liệu thông thường Thuốc bôi retinoid: tretionin, adapalene và isotretinoin là

loại thuốc có hiệu quả Thuốc có tác dụng mềm da, ức chế sự phát triển vi khuẩn P acnes và tạo điều kiện cho các thuốc kháng khuẩn tại chỗ phát huy tác dụng tốt hơn

Một số tác dụng không mong muốn của thuốc:

- Khả năng gây quái thai là tác dụng không mong muốn cần lưu ý nhất Thuốc có thể gây dị dạng trên hệ thống thần kinh trung ương, cơ quan thính giác, tuyến

ức và hệ thống tim mạch thai nhi (Nguyễn Hữu Sáu, 2010) Các thuốc retinoid chống chỉ định cho phụ nữ mang thai và phụ nữ trong độ tuổi sinh sản (Yentzer

et al., 2009)

- Khô da và niêm mạc, làm da và niêm mạc dễ bị tổn thương và kích ứng, bệnh nhân cảm giác bỏng rát da trở nên đỏ, bong vẩy

- Mụn mủ có thể xuất hiện sau khi bôi thuốc 1 đến 2 tuần do thuốc làm tăng sự

thẩm thấu các chất trung gian hoá học gây viêm do P acnes tiết ra và tạo điều

kiện cho tụ cầu phát triển (Nguyễn Hữu Sáu, 2010)

2.1.3.4 Các phương pháp khác

- Acid azelic có tác dụng giống benzyol peroxid gây ức chế sự tổng hợp tế bào sừng,

có hoạt tính chống lại bệnh trứng cá Tác dụng không mong muốn là gia tăng sắc tố da sau viêm (Roebuck, 2006), dễ gây kích ứng da ngứa và có cảm giác bỏng tại chỗ

(Layton, 2006)

- Điều trị bằng công nghệ ánh sáng tia laser: sử dụng liệu pháp quang, ánh sáng phổ rộng Tia laser cho thấy kết quả giảm mụn trong thời gian ngắn nhưng cần có thêm

nhiều nghiên cứu lâu dài và so sánh liệu pháp cũ (Sakamoto et al., 2010)

- Bên cạnh đó thảo dược được dùng điều trị mụn trứng cá không chỉ có khả năng như một chất tiêu diệt vi sinh vật mà còn là những chất có khả năng ức chế sản sinh sản

phẩm ngoại bào của P acnes Thảo dược dùng điều trị mụn trứng cá cho thấy tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxy hoá và ức chế hormon androgen (Sasiing et al., 2012) Một số nghiên cứu về hoạt chất từ thảo dược có tác dụng ức chế vi khuẩn P

acnes:

+ Nghiên cứu kem trị bệnh trứng cá có chứa 2 % flavonoid chiết từ vỏ cây

Terminalia arjuna (họ Trâm Bầu) thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn P acnes (đường

đính vòng kháng > 17 mm) (Vijaylakshmi et al., 2011)

+ Theo Luangnarcumitchai (2007) khảo sát 19 loại tinh dầu cho kết quả có khả

năng ức chế vi khuẩn P acnes, trong đó tinh dầu xả có hoạt chất kháng khuẩn cao

+ Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, dịch chiết ethanol của lá cây Liễu

đỏ Excoecaria cochinchinensis Lour và lá cây Xô thơm Salvia officinalis Lour (Họ hoa môi) nồng độ 5 % ức chế P acnes với đường kính vòng vô khuẩn lần lượt là 20,5

mm và 20,83 mm MIC lần lượt là 1,56 mg/ml và 6,25 mg/ml (Brovelli et al., 2005)

Tác dụng của các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá được trình bày ở bảng 2.1

như sau:

Bảng 2.1 Tác dụng các chất sử dụng trong điều trị mụn trứng cá

Bài tiết chấtnhờn

Sừng hoá phễu nang lông

dụng yếu, (-) không tác dụng (Hywel et al., 2011)

2.2 VI KHUẨN PROPIONIBACTERIUM ACNES

2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium acnes

Theo Douglas và Gunter (1946) vi khuẩn Propionibacterium acnes gây bệnh trứng cá

phân loại như sau:

P acnes là một trong những vi khuẩn thuộc hệ vi sinh vật tự nhiên của da,

chiếm khoảng 105 - 106 tế bào/cm2 ở những vùng có nhiều bã nhờn như: mặt, đầu, lưng

và khoảng 102 tế bào/cm2 ở các vùng khác trên cơ thể (Leyden et al., 1998) Chúng

sinh trưởng sâu bên dưới da, nhiều nhất trong các nang lông, nơi có nồng độ oxy thấp

Vi khuẩn P acnes phát triển chậm, khuẩn lạc xuất hiện sau 5 - 7 ngày trên môi

trường nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp 37 oC, pH từ 5 - 8, trong điều kiện kỵ khí Khuẩn

lạc P acnes mô cao màu vàng đục trên môi trường TYEG agar có bổ sung

bromocresol purple Khuẩn lạc có kích thước khoảng 0,5 - 4 mm tuỳ thuộc vào thời

gian và môi trường nuôi cấy (Kishishita, 1980)

P acnes thuộc vi khuẩn Gram dương, hình que, không sinh bào tử, các tế bào

có đường kính 0,5 - 0,8 m và dài 3 - 4 m, có khả năng sản xuất acid propionic,

nitrat, catalase và indol dương tính, dịch hoá gelatin P acnes được trữ trong môi

trường BHI có bổ sung 20 % glycerol, ở nhiệt độ -40 oC (Jappe et al., 2002)

Hình 2.2 Vi khuẩn P acnes

( Jappe et al., 2002)

(a) Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử; (b) Hình chụp dưới kính hiển vi quang học

P acnes có nhiều dạng khác nhau Dựa vào quá trình lên men, sử dụng đường ribose, erythritol và sorbitol, quan sát được 5 type P acnes khác nhau Dựa trên xét nghiệm huyết thanh và phân tích thành phần đường trên thành tế bào, chia P acnes

thành hai dạng: type I (đường glactose tham gia cấu tạo thành tế bào) và type II (chỉ có đường manose trong cấu tạo thành tế bào) (Johnson và Cummins, 1972) Theo

McDowel (2005) P acnes được chia thành hai type I và II dựa vào khác biệt về kiểu

gen dựa trên biến thể về kiểu gen (reca, hly) Gần đây, một dạng mới được mô tả là type III trên da người dị ứng

2.2.2 Cơ chế gây bệnh trứng cá vi khuẩn Propionibacterium acnes

P acnes là một trong những thành phần của hệ vi sinh vật bình thường trên da (Holdeman et al., 1977) Ở những người bệnh trứng cá, vi khuẩn này phát triển rất

mạnh do sự bít tắc lỗ chân lông tạo môi trường yếm khí, tạo điều kiện thuận lợi cho vi

sinh vật này tăng nhanh mật số Vi khuẩn P acnes sản xuất các enzym ngoại bào và

các sản phẩm có hoạt tính sinh học khác được xem là yếu tố quyết định độc lực và tương tác với hệ miễn dịch gây ra phản ứng viêm tạo nhân mụn (Webster, 1995)

Theo Funke (1997) và Leyden (1998) P acnes là nhân tố quan trọng gây bệnh

trứng cá đây là chủng vi khuẩn phổ biến nhất trên da bệnh nhân trứng cá Tại các

tuyến bã nhờn P acnes tiết ra lipase để tiêu hoá chất nhờn trong các nang lông sản sinh ra các acid béo tự do và acid propionic Vi khuẩn P acnes tồn tại trên mô và có

thể gây huỷ mô do các các sản phẩm chuyển hoá (acetat, propionat, indol, porphyrin), enzym và các sản phẩm thoái dưỡng của glucose và fructose Histamin, tryptamin và

những chuỗi acid béo ngắn được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy P acnes, các chất này có thể gây ra tình trạng viêm (Csukas et al., 2004) Các enzym ngoại bào và các sản phẩm có hoạt tính sinh học là hai yếu tố quyết định động lực của P acnes

Số lượng P acnes bên trong nang lông tăng mạnh quá trình biến dưỡng diễn ra

sản sinh nhiều acid béo tự do, các chất này khuếch tán qua thành nang lông kích thích hoạt động của hệ thống miễn dịch tự nhiên và chuỗi phản ứng viêm kích hoạt (Loveckova và Halikova, 2002) Ngoài ra chúng có khả năng phá vỡ các nang lông bởi các enzym thuỷ phân lysosom gây ra phản ứng viêm hạ bì

Vi khuẩn P acnes có khả năng chống lại thực bào và có thể tồn tại trong đại

thực bào một thời gian dài do cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn này có thể tồn tại thời gian dài trong mô, kích thích phản ứng viêm miễn dịch liên tục và lâu dài, gây viêm

(Wester et al., 1985) Coates et al., 2002 cho rằng thành tế bào P.acnes chúng được bảo vệ bởi kháng sinh và hệ thống miễn dịch tế bào chủ (Coates et al., 2002)

Bảng 2.2 Sản phẩm ngoại bào P acnes

Lipase Triglyceride Dinh dưỡng, sản xuất acid

béo tự do, tăng kết dính với

tế bào Phospholipase C Phospholipid Gây rối loạn chức năng

mang tế bào Proteases Collagen, keratin Dinh dưỡng, tăng hoạt tính,

sản sinh chemotaxins, phân huỷ protein, xâm lấn mô lân cận

Hyaluronidase,

neruaminidase

Mucopolysaccharides Xâm lấn mô lân cận, xuất

huyết dưới da Acid phosphatase Đường phosphat Dinh dưỡng

Bacteriocins Kháng vi khuẩn khác

Histamin, tryptamin Gây viêm cấp tính

Eady et al., 1994

2.3 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRỨNG CÁ

2.3.1 Nguồn gốc cây Trứng cá

Trứng cá có tên khoa học Muntingia calabura L., thuộc họ Trứng cá

(Muntingiaceae) Tên gọi Trứng cá được đặt dựa trên các hạt li ti như trứng cá bên trong quả Tại Việt Nam cây có nhiều tên gọi như: Trứng cá, cây Trứng cá, Mật sâm Tuỳ theo từng quốc gia, cây Trứng cá có nhiều tên gọi khác nhau Tên khác: capolin, palman, bersilana, jonote, puan (Mexico); capulin blanco (Costa Rica); chitató, maguito, chiriador, acuruco, tapabotija, nigua (Venezuela) Cây Trứng cá có nguồn gốc từ miền nam Mexico, Caribe, Trung Mỹ, miền tây Nam Mỹ về phía nam của Peru

và Bolivia và khu vực châu Á (Chin, 1989) Cây Trứng cá có thể phát triển tốt trên vùng đất nghèo dinh dưỡng có khả năng chịu các điều kiện chua mặn và khô hạn Được trồng rộng rãi phổ biến là loại cây ven đường tại Việt Nam, Malaysia, Phillipines Hạt của cây được các loài chim và dơi ăn quả phát tán, giúp cải thiện các điều kiện đất và góp phần giúp các loài thực vật khác có thể sinh sống được ở vùng đất nghèo dinh dưỡng Tuy nhiên, cây cũng có thể bị coi là loài xâm hại nguy hiểm do cây Trứng cá có thể cạnh tranh với các loài cây bản địa khác

Hình 2.3 Cây Trứng cá

2.3.2 Mô tả cây Trứng cá

Cây Trứng cá là loại cây thân gỗ nhỏ, cao khoảng 7 - 12 m, phân cành lớn mọc ngang, các cành xếp chồng lên nhau và hơi rũ xuống Vỏ thân hơi nhẵn, những cành non có lông màu xanh sậm, cành già màu nâu đen Lá hình trái xoan, phiến lá không đều dài 7 - 12 cm, rộng 2 - 4 cm, đầu lá nhọn, mép kía răng cưa, hai mặt có lông, màu trắng nhạt mặt dưới, gân gốc 4, cuống lá dài 3 - 5 cm, có lông; lá kèm hình kim, gấp khúc Hoa mọc đơn độc, tụ họp thành 2 - 3 cái ở kẽ lá, cuống hoa dài hơn cuống lá, cánh hoa hình xoan màu trắng, đài có 5 răng có lông dày ở hai mặt, tràng 5 cánh hình bầu dục, thắt lại ở móng; nhị nhiều đính trên trụ đĩa bao quanh bầu, chỉ nhị mảnh; bầu

hình trứng có lông tuyến, 5 - 7 ô chứa nhiều noãn Quả nạc tròn nhẵn, đường kính khoảng 1 - 1,5 cm, khi còn non màu xanh chuyển vàng rồi ứng đỏ và bóng láng khi chín, vị ngọt và mọng nước có mùi thơm đặc trưng, bên trong chứa nhiều hạt nhỏ (0,5 mm) màu vàng trong như trứng cá (Võ Văn Chi, 2004)

Hình 2.4 Quả non và quả chín cây Trứng cá

2.3.2 Phân loại cây Trứng cá

Trứng cá là loài duy nhất trong chi Muntingia, thực vật có hoa Theo Vijayanand (2015) cây Trứng cá được phân loại như sau:

Giới (kingdom): Plantae

Bộ (order): Mavales

Họ (family): Muntingiaceae

Chi (genus): Muntingia L

Loài (species): M calabura

2.3.3 Thành phần hoá học và các hợp chất tiêu biểu của cây Trứng cá

2.3.3.1 Lá

Qua các tài liệu đã công bố từ năm 1997 cho tới nay về thành phần hoá học, các

nhà hoá học phân lập được rất nhiều các hợp chất từ dịch chiết lá Muntingia calbura

L như sau:

Các hợp chất Flavonoid: Catechin, epigallocatechin gallate, acid gallic, acid

protocatechuic, acid ferulic, quercitrin-2’’-O-gallate, pentagalloyl-hexoside II, kaempferol-3-O-galactoside, myricetin, acid isoferulic, quercetin, pinocembrin,

rhamnetin, kaempferol, chyrsin I, chyrsin II, kaempferide, ermanin I, pinostrobin, (2R,3R)-3,5,7-trihydroxyflavanone, 7-hydroxyflavone, isokaemferide, 3,3’-dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavone, 3,8-dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavone, 7-hydroxyisoflavon, 7,3’,4’-trimethoxyisoflavone, (2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-

tetramethoxyflanvan (Mahmood et al., 2013)

Các hợp chất khác: acid 3,4,5-trihydrobenzoic, lupenon, acid

2,3-dihydroxy-olean-12en-28oic, -sitostenone, -sitosterol, -stimasterol, methy-4hydrobenzoat, acid

isovanillic, p-nitrophenol, trans-methyl-p-coumarate, -anyremone (Mahmood et al., 2013)

Theo nghiên cứu Aruna (2014) hàm lượng phenolic và flavonoid chiếm tỷ lệ

cao trong dịch lá Trứng cá Làm gia tăng khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa từ

lá Trứng cá

2.3.3.2 Quả

Quả Trứng cá rất được trẻ em ưa thích có thể ăn quả ngay khi hái hoặc làm mứt với mùi thơm đặc trưng

Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần các chất có chứa trong quả Trứng cá theo nghiên

cứu của Vijayanand (2015) được thể hiện bảng 2.3

Bảng 2.3 Khảo sát sơ bộ thành phần các hợp chất có chứa trong quả Trứng cá

Dung môi

Terpeoid - - - + Flavonoid + + - +

Theo Gomathi (2013) dịch chiết quả Trứng cá định lượng bằng phương pháp quang phổ cho kết quả chứa một lượng đáng kể vitamin C (33,6 AAE/g dịch chiết), vitamin

E (14,7 mg TE/g dịch chiết), anthocyanin (82,4 mg CGE/g dịch chiết), flavonoid

(173,2 mg RE/g dịch chiết) Ngoài ra một số chất khác như phytol (26,26 %), acid

n-hexanacetic (11,97 %), acid cyclopropaneotanoic (10,26 %), γ-sitosterol (11,15 %), stigmasterol (7,20 %) và campesterol (4,47 %) là thành phần chính trong chiết

xuất Kết quả cho thấy quả Trứng cá là nguồn bổ sung chất dinh dưỡng có tiềm năng

kháng viêm và chống oxy hoá

2.3.3.3 Vỏ thân

Qua các tài liệu đã công bố về thành phần hoá học các nhà khoa học phân lập được

rất nhiều các hợp chất từ dịch chiết vỏ thân Muntingia calbura L như sau:

Flavonoid: 8-hydroxy-7’,3’,4’,5’-tetramethoxyflavon; trimethoxyflavon; 6,7-dimethoxy-5-hydroxyflavon; 5,7-dimethoxyflavon; 3,5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavan; (2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan Hợp chất khác: -sitistenon; 6--gydroxystigmast-4-en-3-one, -sitosterol; acid syringic; acid vanillic, 3-hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl)propan-1-on,

8,4’-dihydroxy-7,3’,5’-tetracosyl ferulate; hexacosanol (Mahmood et al., 2013)

2.3.4 Tác dụng dược lý cây Trứng cá

Trong suốt nhiều thập kỉ qua các nhà khoa học trên khắp thế giới cố gắn khám phá

và nghiên cứu nhiều tác dụng dược lí mà cây Trứng cá mang lại cho con người Cây Trứng cá đã cho thấy nhiều tiềm năng dược phẩm mới trong tươi lai Theo kinh nghiệm dân gian người dân Peru dùng lá sắc với nước sử dụng giảm đau dạ dày, sưng tuyến tiền liệt và hạ sốt giảm đau đầu (Morton (1987), Zakaria (2007b) Vỏ thân sử dụng như thuốc giảm sưng viêm (Zakaria, 2006) Tại Colombia hoa sử dụng như loại thuốc an thần, chống co giật, trầm cảm Ở Mexico, cây trồng sử dụng điều trị bệnh sởi, nhọt miệng và đau dạ dày

2.3.4.1 Độc tính cấp

Độc tính cấp của M calabura được nghiên cứu năm 2011 theo Sridhar (2011), dịch

chiết methanol lá với liều 300 mg/kg, 500 mg/kg và 2000 mg/kg dùng theo đường uống của chuột Quan sát hiện tượng trong 2 - 3 giờ đầu, tỷ lệ tử vong bắt đầu ghi nhận

từ 24 giờ đến 14 ngày Kết quả thu được không thấy có dấu hiệu độc tính cấp và tỷ lệ

tử vong liều 2000 mg/kg dịch chiết là 0 % Nghiên cứu khác về độc tính cấp của lá M calabura thu hái tại Selangor, Malaysia thực hiện bởi Irahim (2012) Dịch chiết

ethanol lá liều thử nghiệm 2000 và 5000 mg/kg dùng đường uống ở chuột Tỷ lệ tử vong ghi nhận đến ngày 14 sau khi uống dịch chiết là 0 %, không nhìn thấy dấu hiệu lâm sàng về sự suy yếu của động vật, quan sát cấp độ tế bào về mô học, sinh hoá máu, công thức máu cho thấy không có sự bất thường nào ở chuột Những phát hiện này cho

thấy dịch chiết lá M calabura không gây ra ngộ độc cấp tính dù ở liều cao (5000

mg/kg)

Karthyaini và Suresh (2012) nghiên cứu độc tính cấp của quả M calabura liều thử

nghiệm giới hạn 1000 mg/kg và 2000 mg/kg không có dấu hiệu độc tính cấp hoặc tử vong ghi nhận cả hai mức liều

2.3.4.2 Hoạt tính gây độc tế bào

Những năm gần đây Chen et al., 2004 nghiên cứu độc tính tế bào của M calabura,

trong đó 15 hợp chất phân lập từ dịch chiết methanol vỏ thân đã được kiểm tra bằng các thí nghiệm gây độc tế bào Hoạt động chống lại tế bào P-388, A549, và HT-29 Trong số các hợp chất phân lập, các hợp chất 8-hydroxy-7,3’,4’,5’-tetramethoxyflavane; 8,4’-dihydroxy-7,8’,5’-trimethoxyflanane; 5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone; -sitostenone; acid vanillic; 3-hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) propran-1-on; tetracolsyl ferulate có hoạt tính chống lại tế bào P-388 với ED50 ghi nhận lần lượt là 3,56 g/ml; 3,71 g/ml; 9,39 g/ml; 6,28 g/ml; 10,72

g/ml; 15,62 g/ml và 3,27 g/ml đối chứng mithramycin (ED50 = 0,06 g/ml )

được hai loại cao chiết methanol lá và methanol quả là trên hai dòng vi khuẩn

Ercherichia coli, Staphylococcus aureus lần lượt là 512/1024 μg/ml và 128/256 μg/ml

Một nghiên cứu khác của Zakaria (2006) về hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá Trứng cá với các dung môi methanol, nước và chloroform Cao chiết pha loãng các nồng độ khác nhau (10000, 40000, 70000 và 100000 ppm) thử nghiệm

chống lại Corneybacterium, S Aureus, Bacillus cereus, Proteus vulgaris, Staphylococcus epidermidis, Kosuria rhizophila, Shigella fleneri, E Coli, Aermonashydrophila và Salmonella typhi bằng phương pháp khuyếch tán đĩa thạch in

vitro Kết quả cho thấy cao chiết chloroform ít hiệu quả hơn so với cao chiết nước và

methanol Ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, dịch chiết nước ức chế sự phát triển của S aureus và K rhizophila trong khi dịch chiết methanol kháng lại vi khuẩn S flexneri, B cereus, S aureus, P vulgaris, A hydrophila và K rhizophila Ở nồng độ 40000 ppm trở lên, dịch chiết nước hoạt tính kháng khuẩn tác động đối với vi khuẩn C diphtheriae, P vulgaris, S epidermidis và A hydrophila

Một nghiên cứu khác thực hiện bởi Zakaria et al., 2007a khảo sát khả năng kháng dòng vi khuẩn Staphyloccocus aureus của 3 loại cao chiết từ lá trứng cá với các

dung môi nước, chloroform, methanol Kết quả cho thấy cả 3 loại cao chiết từ lá Trứng

cá có hoạt tính kháng khuẩn các dòng S aureus 29213, S aureus 33591, S aureus

700699 Giá trị MIC ứng với 3 loại cao chiết nước, chloroform, methanol lần lược là 5

μg/ml ; 1,25 μg/ml và 2,5 μg/ml Năm 2010, Zakaria tiếp tục các nghiên cứu 3 loại

dịch chiết Trứng cá khảo sát khả năng kháng các chủng vi khuẩn khác như S aureus

ATCC 25923 [nhạy cảm methicilin], S aureus ATCC 33591 [kháng methicilin], E coli ATCC 10536, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC

10231, và Microsporum canis ATCC 36299 bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết quả thu được chỉ cao chiết methanol ức chế sự phát triển của S aureus ATCC

25923 và S aureus ATCC 33591 với giá trị MIC là 1250 μg/ml và MBC là 2500 μg/ml Cao chiết nước và chloroform không ức chế các chủng vi khuẩn C albicans,

M canis, P aeruginosa và E coli Cao chiết methanol lắc phân đoạn với các dung

môi từ không phân cực đến phân cực (ether, ethylacetat, nước) khảo sát khả năng

kháng khuẩn S aureus ATCC 25923 và S aureus ATCC 33591 các phân đoạn Phân

đoạn ethylacetat cho thấy khả năng kháng hai dòng vi khuẩn này với giá trị MIC và MBC ghi nhận được là 156 μg/ml và 313 μg/ml

2.3.4.4 Hoạt tính chống oxy hoá

Gốc tự do là một sản phẩm tất yếu của các quá trình sinh lý sinh hoá trong cơ thể Trong cơ thể luôn có sự cân bằng mật độ gốc tự do Khi nồng độ gốc tự do tăng quá cao gây mất cân bằng, dẫn tới những tổn thương tế bào, phá huỷ protein, DNA đẩy

nhanh quá trình lão hoá và gây ung thư Để xác định tiềm năng chống oxy hoá của M calabura được thực hiện bởi Zakaria et al., 2007b Những lá Trứng cá thu hái từ

Selangor, Malaysia phơi khô và chiết với dung môi nước Tiến hành thử nghiệm bằng phương pháp DPPH và superoxid anion kết quả cho thấy dịch chiết nước có khoảng 94,8  1,14 % và 83,70  2,05 % khả năng chống oxy hoá khi đo bằng 2 phép thử Một nghiên cứu khác của Siddiqua (2010), dịch chiết methanol lá Trứng cá cho thấy khả năng chống oxy hoá bằng phương pháp DPPH với nồng độ ức chế IC50 = 22

g/ml cao hơn so với acid ascorbic có giá trị IC50 = 12 g/ml

2.3.4.6 Hoạt tính bảo vệ tim mạch

Báo cáo khả năng bảo vệ tim mạch lá trứng cá thực hiện bởi Nivethetha (2009) Dịch chiết lá Trứng cá với dung môi là nước có khả năng bảo vệ tim bằng cách làm giảm nguyên nhân gây nhồi máu cơ tim (AST, ALT, LDH, CK, acid uric) ở chuột Hoạt tính một số enzym giảm khi sử dụng dịch chiết nước lá Trứng cá ở nồng độ 200

và 300 mg/kg

2.3.4.7 Hoạt tính chống bệnh đái tháo đường

Theo Sirdhar (2011) cao chiết methanol lá Trứng cá có khả năng chống lại bệnh đái tháo đường với liều 300 mg/kg và 500 mg/kg Liều 500 mg/kg cao methanol làm giảm lượng đường huyết từ 83,19 mg/dl (lúc 0 giờ) xuống 62,62 mg/dl (cuối 6 giờ) Hiệu quả đối với khả năng dung nạp glucose đường uống cũng được khảo sát Kết quả cho thấy liều 500 mg/kg làm giảm lượng đường huyết trong 1 giờ (116,46  6,94 mg/dl) trong khi nhóm chỉ sự dụng kẹo cao su (144,73  7,86 mg/dl) Nghiên cứu khác về khả năng tăng đường huyết sau khi sử dụng Alloxan Với liều 500 mg/kg cho thấy khả năng giảm đường huyết 37 % so với thuốc đối chứng glipizide 5 mg/kg

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CAO CHIẾT TỪ CÂY

TRỨNG CÁ TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.4.1 Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá trên thế giới

Theo Zakaria (2006) tiến hành thử nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ lá Trứng cá lần bằng 3 dung môi khác nhau nước, methanol, chloroform bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch Kết quả thu được dịch chiết nước có khả

năng chống lại Staphylococcus aureus, Kosuria rhizophila, dịch chiết methanol có khả năng chống lại Shigella flexneri, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Aeromonas hydrophila, Kosuria rhizophila; các khả năng kháng khuẩn này

không tìm thấy ở dịch chiết chloroform

Theo Zakaria (2011), tiến hành thử nghiệm các hoạt động chống oxy hoá và tăng sinh tế bào từ dịch chiết lá Trứng cá bằng 3 dung môi nước, chloroform, methanol được thực hiện trong nghiên cứu này Đánh giá bằng phương pháp thử MTT ((2,4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolim) Dịch chiết nước và methanol cho kết quả ức chế sự phát triển các tế bào ung thư MCF-7, HeLa, HT-29, HL-60 và K-562 trong khi dịch chiết chloroform chỉ ức chế phát triển tế bào ung thư MCF-7, HeLa, HL-60 và K-562 Bên cạnh đó tất cả dịch chiết từ các dung môi không ức chế

sự gia tăng các tế bào bình thường 3T3, cho thấy sự an toàn khi sử dụng Tất cả các dịch chiết ở nồng độ (20 g/ml, 100 g/ml, 500 g/ml) đều có hoạt tính chống oxy hoá, trong đó dịch chiết nước và methanol có hoạt tính chống oxy hoá cao hơn dịch chiết chloroform Tổng hàm lượng phenolic trong 3 dung môi nước, methanol,

chloroform lần lượt là 2970,4  6,6; 1279  6,1; 2978,1  4,3 mg/100g acid gallic

Theo Zakaria (2010) nghiên cứu xác định hoạt tính kháng khuẩn invitro của dịch chiết toàn phần và phân đoạn của lá Trứng cá Lá trứng cá được chiết với 3 loại dung môi là nước, chloroform và methanol với tỷ lệ 1:20 (w/v) trong 72 giờ với quy

trình lặp lại ba lần Các dòng vi khuẩn khảo sát là Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Cadida albicans và Microsporum canis Dịch chiết methanol ức chế Staphylococus aureus (MIC = 1250 g/ml, MBC = 1250 g/ml) và được xem là dịch hiệu quả nhất trong cả ba loại dung môi Tiến hành chiết phân đoạn

ethyl acetat hoạt tính kháng khuẩn Staphylococcus aureus đạt giá trị MIC 156 g/ml

2.4.2 Tình hình nghiên cúu và ứng dụng cao chiết từ cây Trứng cá ở Việt Nam

Trong nước, cây Trứng cá chủ yếu nghiên cứu về sinh thái, khả năng chống chịu và thực trạng cây ven đường Còn các nghiên cứu về hóa học và tác dụng sinh dược học của các hợp chất polyphenol khai thác từ cây trứng cá với mục đích phục vụ lĩnh vực y dược còn rất ít Các công bố nghiên cứu chủ yếu dựa vào thế giới và ứng dụng dân gian Thực tế cho thấy tìm năng điều trị bệnh tim mạch, tiểu đường, gout và chống oxy hóa của các chất chiết từ cây Trứng cá là vô cùng phong phú nhưng vẫn chưa khai thác mạnh mẽ trong nước Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu đặc tính dược liệu của chiết từ cây Trứng cá có ý nghĩa to lớn trong phòng và điều trị một số bệnh hiện nay là rất cần thiết

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM

Thời gian : Thí nghiệm được thực hiện từ 12/2016 đến 4/2017 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh, phòng thí nghiệm Dược liệu Khoa Dược- Điều Dưỡng trường Đại học Tây Đô

3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nguyên vật liệu

- Mẫu vi khuẩn: Dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes 134N từ nghiên cứu “Khảo sát tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây mụn trứng cá Propionibacterium acnes tại thành phố Cần Thơ” của Phạm Thị Tường Vy (2017) được lưu trữ tại phòng

thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Tây Đô

- Lá, vỏ thân, quả non, quả chín cây Trứng cá thu hái tại phường Thường Thạnh, quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ vào tháng 12 năm 2016 Lá và vỏ thân Trứng cá rửa sạch, sấy khô, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong túi nylon được xay nhỏ trước khi sử dụng cho nghiên cứu Quả non, quả chín được rửa sạch, nhặt bỏ cuống, để ráo nước xay nhuyễn trước khi sử dụng cho nghiên cứu

3.2.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Sử dụng các trang thiết bị hiện có tại Phòng thí nghiệm Vi sinh - Trường Đại học Tây Đô, Phòng thí nghiệm Dược liệu - Trường Đại học Tây Đô

Các dụng cụ nuôi cấy vi khuẩn P acnes: đĩa Petri, que cấy, tủ cấy vi sinh vật,

nồi hấp khử trùng, cân điện tử Ohaus (Mỹ), tủ sấy, tủ ủ vi sinh vật, tủ đông giữa mẫu Hitachi (Nhật Bản), bộ micropipet, bếp điện, máy ly tâm, ống Eppendorf, bình hút ẩm

Các dụng cụ thiết bị chiết mẫu: bếp điện, bình cầu, hệ thống sinh hàn, bếp đun cách thủy, cân phân tích Shimidzu (Nhật Bản), phễu hủy tinh, đũa thủy tinh, tủ lạnh bảo quản cao chiết, tủ sấy, cân hồng ngoại xác định độ ẩm

Các thiết bị và dụng cụ khác: máy vi tính lưu trữ dữ liệu, máy chụp hình, kính hiển vi Olympus CX - 21 (Nhật Bản)…

3.2.3 Hóa chất và môi trường

3.2.3.1 Hóa chất

Ethanol 96 % (Trung Quốc), DMSO (Trung Quốc)

Hoá chất dùng nhuộm Gram vi khuẩn P acnes : crystal violet, lugol, alcohol 95 %,

safranine (Bộ nhuộm Gram công ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam)

Hoá chất kiểm tra catalase: dung dịch oxy già (H2O2, 3 %)

Thuốc thử Kovac’s dùng thử khả năng sinh indol (Mecrk)

Đĩa kháng sinh levofloxacin 5 g/ml (Công ty TNHH Nam Khoa, Việt Nam)

Hoá chất cần thiết khác

3.2.3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn P acnes được nuôi cấy trong môi trường Trypticase - Yeast Extract -

Heart Extract - Glycerol Agar (Kishisita, 1980)

Bảng 3.1 Công thức môi trường TYEG agar (Kishisita, 1980)

- Môi trường Trypticase soyar broth dùng để kiểm tra khả năng sinh indol

- Môi trường Trypticase soyar broth agar dùng để khảo sát hoạt tính kháng khuẩn

và nồng độ ức chế tối thiểu

- Môi trường pepton dùng để thử khả năng làm dịch hóa gelatin và khả năng phản nitrat hóa

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp thực nghiệm khoa học

3.3.2 Cỡ mẫu

Tổng số 4 mẫu thực vật từ các bộ phận Trứng cá (Muntingia calabura L.): lá, vỏ thân,

quả chín và quả non được sử dụng trong nghiên cứu

3.3.3 Phương pháp chọn mẫu

Thu hái các bộ phận cây Trứng cá

- Lá: chọn lá không quá già hay quá non, không bị sâu bệnh

- Vỏ thân: chọn thân to không sâu bệnh và dùng dụng cụ bóc vỏ thân

- Quả chín: chọn quả chín đỏ đều màu hái trực tiếp trên cây, không bị sâu bệnh

- Quả non: chọn quả non màu xanh lá hái trực tiếp trên cây, không bị sâu bệnh

3.3.4 Nội dung nghiên cứu

3.3.4.1 Phương pháp chiết

Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết và kỹ thuật chiết Một phương pháp chiết xuất thích hợp có thể được hoạch định một khi đã biết rõ thành phần hoá học của nguyên liệu, mỗi loại hợp chất có độ hoà tan khác nhau trong từng loại dung môi Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung áp dụng cho tất cả các hợp chất Lựa chọn phương pháp chiết xuất có được cao toàn phần

là công việc quan trọng để tránh phân huỷ hợp chất , tránh phản ứng phụ và các loại tạp sinh ra trong quá trình chiết

Trong quá trình chiết các tiểu phân chất rắn chịu tác động của dung môi trong điều kiện khác nhau Các chất tan hoà tan trong dung môi thành dung dịch và tạo nên dung dịch chiết, sự hoà tan này ít bị ảnh hưởng bởi các chất không tan Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (mô tế bào), các chất tan nằm bên trong các tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì thế các chất tan sau khi hoà tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào ra khỏi mô để đi vào dịch chiết Quá trình chiết các chất tan từ các tổ chức sinh học vì thế thường được gọi là quá trình “chiết xuất”.Nguyên liệu thực vật thường được chia nhỏ thành các tiểu phân có thể tiếp xúc với dung môi, trong khi các tế bào phía bên trong vẫn còn nguyên vẹn dung môi và chất tan phải đi qua vách tế bào Vì thế, trong chiết xuất có 3 quá trình quan trọng đồng thời xảy ra là:

- Sự hoà tan

- Sự khuếch tán

- Sự thẩm thấu qua vách tế bào

Các quá trình này thực hiện liên tục cho đến khi quá trình chiết kết thúc Nguyên liệu phải được xay nhỏ đến mức thích hợp để dung môi có điều kiện tiếp xúc trực tiếp với vách tế bào một cách dễ dàng, thúc đẩy quá trình chiết xuất nhanh chóng và nâng cao hiệu suất chiết (Nguyễn Trọng Tuân, 2007)

- Phương pháp chiết nóng đun hồi lưu

Là phương pháp ngâm được thực hiện ở nhiệt độ cao kết hợp bộ phận gia nhiệt

và hệ thống sinh hàn Do được chiết ở nhiệt độ cao nên khả năng hòa tan các chất tan

và dung môi thường là cao nhất và quá trình hòa tan xảy ra nhanh Đun hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường thông qua hệ thống ngưng tụ Thiết bị chiết đun hồi lưu gồm: Hệ thống sinh hàn, bình cầu, bếp điện

Ưu điểm: thiết bị đơn giản rẻ tiền, dễ thực hiện, phương pháp đơn giản Nhược điểm: không chiết được lượng lớn mẫu cây, nên chỉ thích hợp nghiên

cứu phòng thí nghiệm, trong suốt quá trình chiết mẫu cây luôn có nhiệt độ bằng nhiệt

độ sôi của dung môi nên không thích hợp cho các hợp chất kém bền nhiệt như carotenoid hoặc tạo các tạp chất trong quá trình chiết (Nguyễn Trọng Tuân, 2007)

- Tiến hành

Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá trình bày trong hình

Hình 3.1 Sơ đồ bố trí chiết cao từ các bộ phận cây Trứng cá

Lá, vỏ thân, quả non và quả chín cây trứng cá tươi thu hái về rửa sạch Sau đó

lá và vỏ thân cây trứng cá làm khô bằng cách sấy khô đến khối lượng không đổi trong

tủ sấy ở điều kiện 60 oC trong 6 giờ Xay nhỏ lá và vỏ thân trứng cá bằng máy nghiền

để tạo bột khô thu được ml, mt (g)

Quả chín và quả sống để ráo nước, sau đó cân xác định khối lượng tươi ms, mc (g), bảo quản tủ lạnh

Chiết lá và vỏ thân khô: cho mẫu bột vào thau nhỏ làm ẩm dược liệu với một lượng dung môi vừa đủ, để dược liệu trương nở trong 30 phút Dược liệu sau khi làm

Bộ phận cây trứng cá

Cắt nhỏ, sấy khô, xay nhuyễn, xác định độ ẩm

Dịch chiết lá

Dịch chiết quả non

Cao lá Cao vỏ thân Cao quả

chín

Cao quả non

ẩm cho vào bình cầu thủy tinh (được sấy khô), rót dung môi từ từ vào bình cầu tỉ lệ 1:20 (w/v) và lắp hệ thống sinh hàn Dung môi ethanol 96 % cách mặt dược liệu 2 - 3

cm Cho nước chảy liên tục trong ống sinh hàn Điều chỉnh nhiệt độ bếp điện tương đương 65 - 70 oC Sau khi thấy tim sôi trong bình cầu ta bắt đầu tính thời gian chiết 3 giờ Sau 3 giờ tắt bếp để dich chiết nguội, lọc dịch chiết qua bông Lặp lại 3 lần chiết, gộp các dịch chiết cô dung môi bằng bếp cách thủy thu mẫu cao xác định độ ẩm cao, khối lượng cao và hiệu suất chiết Cao chiết bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4 - 8 oC

Quả non và quả sống: cho mẫu vào máy xay, bổ sung dung môi lượng vừa đủ, xay nhỏ tốc độ (10000 vòng/phút) trong 5 phút Quả sau khi xay cho vào bình cầu thủy tinh (được sấy khô), rót dung môi từ từ vào bình cầu tỉ lệ 1:10 (w/v) và lắp hệ thống sinh hàn Dung môi ethanol 96 % cách mặt dược liệu 2 - 3 cm Cho nước chảy liên tục trong ống sinh hàn Điều chỉnh nhiệt độ bếp điện tương đương 65 - 70 oC Sau khi thấy tim sôi trong bình cầu ta bắt đầu tính thời gian chiết 3 giờ Sau 3 giờ tắt bếp để dich chiết nguội, lọc dịch chiết qua bông Lặp lại 3 lần chiết, gộp các dịch chiết cô dung môi bằng bếp cách thủy thu mẫu cao xác định độ ẩm cao, khối lượng cao và hiệu suất chiết Cao chiết bảo quản tủ lạnh nhiệt độ 4 - 8 oC

- Chỉ tiêu theo dõi: độ ẩm nguyên liệu và hiệu suất chiết

+ Độ ẩm nguyên liệu: độ ẩm là lượng nước tự do có trong nguyên liệu Biết

được độ ẩm là điều quan trọng trong công tác phân tích xác định chất lượng nguyên liệu Dược liệu thường quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là độ ẩm an toàn của dược liệu Ở độ ẩm này hay thấp hơn dược liệu có thể được an toàn trong quá trình lưu trữ Để xác định độ ẩm ta có thể sử dụng nhiều phương pháp theo Trần Hùng

(2010) như sấy, chưng cất

Nguyên tắc: dùng sức nóng làm bay hơi hết nước trong mẫu nguyên liệu ở những điều kiện nhiệt độ và áp suất nhất định Cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong mẫu nguyên liệu

Tiến hành xác định độ ẩm:

Phương pháp sấy Dùng tủ sấy: lấy một bình thủy tinh hình trụ có nắp mài, sấy đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 oC Cân vào bình một lượng chính xác khoảng 3 g dược liệu rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 105 oC trong 2 - 3 giờ Dùng kẹp lấy bình trụ ra, để vào bình hút ẩm, mở khóa hoặc hé mở nắp bình hút ẩm cho thông khí với bên ngoài trong 1 phút rồi đóng kín bình hút ẩm Để nguội trong bình hút ẩm 15 phút

Cân và ghi kết quả Tiếp tục sấy trong 1 giờ, để nguội và cân mẫu như trên cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 5 mg

Tính kết quả độ ẩm theo công thức:

X = 𝑎−𝑏

𝑎 𝑥100 % X: độ ẩm dược liệu, tính ra phần trăm a: khối lượng dược liệu khi chưa sấy (g) b: khối lượng dược liệu khi sấy đến khối lượng không đổi (g) Dùng cân xác định độ ẩm: trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền mịn lên dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng máy Đọc kết quả Sau khi kết thúc thí nghiệm, phải để máy nguội khoảng 10 phút rồi mới thực hiện mẫu kế tiếp

+ Hiệu suất chiết: hiệu suất chiết (H %) được xác định tỷ lệ % khối lượng giữa

lượng dịch chiết thu được sau khi đã làm khô so với khối lượng mẫu sử dụng

Công thức hiệu suất:

H = 𝑚1

𝑚2𝑥100 % Trong đó : H: hiệu suất chiết (%); m1: khối lượng bột dược liệu khô; m2: khối lượng cao chiết sau khi cô dung môi

3.3.4.2 Nuôi cấy và nhận diện dòng vi khuẩn Propionibacterium acnes

Sơ đồ thí nghiệm

Tube Eppendorf chứa vi khuẩn P acnes trữ ở nhiệt độ -40 oC

Nuôi cấy dòng vi khuẩn trong môi trường TYEG broth

Nuôi cấy và phân lập dòng vi khuẩn trên môi trường TYEG agar có bổ sung

bromocresol purple 0,002 %

Nuôi cấy và phân lập dòng vi khuẩn P acnes trên môi trường thạch nghiêng TYEG Hình 3.2 Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Proionibacterium acnes từ mẫu lưu trữ

- Tiến hành (Kishisita et al., 1980)

Ống nghiệm chứa môi trường TYEG borth hấp tiệt trùng ở 121 oC

Tube Eppendorf chứa vi khuẩn P acnes trữ ở nhiệt độ 40 oC được đặt nhiệt độ thường

15 phút sau đó cấy vào môi trường TYEG broth, ủ ở 37 oC từ 5 - 7 ngày

Hút 30 µl dòng vi khuẩn trong tube cho vào ống nghiệm chứa môi trường TYEG broth Tiến hành cấy ria vi khuẩn từ môi trường TYEG broth lên đĩa thạch môi trường TYEG agar có bổ sung bromocresol purple 0,002 % ủ kỵ khí ở 37 oC từ 5 - 7 ngày Chọn khuẩn lạc có màu vàng, đục, mô cao hoàn toàn trên môi trường và làm môi trường từ tím chuyển sang vàng (do khuẩn lạc thuộc giống vi khuẩn Propionibacterium phát triển sinh acid propionic làm giảm pH của môi trường) Tiến hành nuôi cấy trên trên môi trường thạch nghiêng TYEG, ủ ở 37 oC trong 48 giờ Sau đó vi khuẩn được định danh bằng các phản ứng sinh hóa

Nhận diện dòng vi khuẩn bằng một số thử nghiệm hoá sinh

Nhuộm Gram

Tiến hành nhuộm Gram theo hướng dẫn sử dụng bộ nhuộm Gram công ty TNHH Nam Khoa

- Chuẩn bị vết bôi: làm sạch kính mang vật bằng cồn 70 %, nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng vào giữ kính mang vật, dùng que cấy chuyển một ít vi khuẩn vào giọt nước tán nhẹ cho vi khuẩn hoà tan vào giọt nước, làm khô trong không khí

- Cố định mẫu: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần

- Nhuộm với dung dịch crystal violet, để 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ cồn 95 % giữ khoảng 30 giây hoặc cho cồn chảy qua vết bôi vi khuẩn liên tục đến khi nước cồn chảy không còn màu rửa lại nước và thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong không khí

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100X

Thử nghiệm catalase (Nguyễn Lân Dũng, 2009)

- Lấy sinh khối khuẩn lạc trên môi trường thạch TYEG sau 48 giờ ủ Hoà tan sinh khối vào giọt nước sẵn trên miếng lam

- Thêm vào một hoặc vài giọt H2O2 3 %

- Quan sát sự hình thành bọt khí và ghi nhận kết quả: Nếu dương tính thì có hình thành bọt khí, nếu kết quả âm tính thì không có sự hình thành bọt khí

Kiểm tra sự hình thành indol (John Harley and Lansing Prescott, 2002)

Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo indol từ việc phân giải acid amin trytophan bởi enzym tryptophanase Indol sinh ra kết hợp với andehyde có trong thuốc thử Kovac’s tạo vòng màu hồng/đỏ trên bề mặt môi trường

- Mỗi ống nghiệm cho 0,5 ml thuốc thử Kovac’s

- Đọc kết quả: Dương tính khi vòng Pellicle vàng của thuốc thử Kovac’s chuyển sang màu hồng/đỏ trên bề mặt môi trường Âm tính khi vòng Pellicle vàng của thuốc thử Kovac’s không bị biến đổi

Khả năng phản nitrat hoá (John Harley and Lansing Prescott, 2002)

Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá Dùng vaselin bịt kín nút để ngăn oxy, đặt ở nhiệt độ thích hợp trong 1 - 7 ngày và quan sát sự phát triển của vi khuẩn (tăng độ đục của dịch nuôi cấy, sinh khí NH3) Vi khuẩn có phát triển là phản ứng dương tính, không phát triển là phản ứng âm tính

Khả năng làm dịch hoá gelatin (John Harley and Lansing Prescott, 2002)

Quan sát khả năng làm dịch hoá gelatin tại nhiệt độ phòng từ 20 oC trở xuống Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng thái ổn định là phản ứng

âm tính (không sinh gelatinase); nếu một phần hay toàn bộ gelatin hoá lỏng là phản ứng dương tính

Vi khuẩn P acnes là vi khuẩn Gram dương, tế bào hình que, catalase dương tính, có

khả năng sinh indol, tạo phản ứng phản nitrat và dịch hóa gelatin

3.3.4.3 Khảo sát khả năng ức chế vi khuẩn Propionibacterium acnes của cao chiết cây Trứng cá

Phương pháp khuếch tán giếng thạch (agar well diffusion) tiến hành có những điểm biến đổi phù hợp điều kiện phòng thí nghiệm