Thiết lập chủng bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HOÀNG THỊ KIM THOA THIẾT LẬP CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ĐỐI CHIẾU SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM Chuyên ngành Công nghệ sinh học Mã số ngành: 604280 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2013 Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG – HCM Cán hướng dẫn khoa học : PGS TS Nguyễn Thúy Hương (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA………… ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Hoàng Thị Kim Thoa MSHV: 11310627 Ngày, tháng, năm sinh: 08/03/1988 Nơi sinh: Quảng Ngãi Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số : 604280 I TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng kiểm nghiệm dược phẩm II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu thuốc bị nhiễm, đất, không khí Định danh phương pháp sinh hóa (sử dụng kit) sinh học phân tử (PCR giải trình tự 16S rADN) Kiểm tra đặc tính sinh học chủng phân lập phù hợp với yêu cầu chủng đối chiếu kiểm nghiệm dược phẩm Khảo sát phương pháp bảo quản đơng khơ theo dõi tính ổn định di truyền sau bảo quản III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 02/07/2012 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 21/06/2013 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương Tp HCM, ngày 15 tháng 07 năm 2013 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO (Họ tên chữ ký) (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA….……… (Họ tên chữ ký) LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành luận văn nỗ lực lớn giúp đỡ nhiều người Người tơi muốn cám ơn ông xã – người bên cạnh chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt để em học tập làm việc Cám ơn ông xã gia đình bên yêu thương, chăm sóc giúp đỡ Một người thầy gần gũi người bạn hướng dẫn, động viên tạo cho niềm say mê nghiên cứu từ tơi cịn sinh viên chưa biết gì, Cơ Nguyễn Thúy Hương Em biết ơn ln kính trọng Hi vọng em cịn đồng hành cơ, nghe lời giáo huấn đầy tâm huyết cô Lời cám ơn muốn gửi tới đồng nghiệp phòng Khoa học Đào tạo, đặc biệt Tổ nghiên cứu Khoa Vi sinh – Viện kiểm nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh Cám ơn anh chị đồng hành, giúp đỡ quan tâm tới em ngày tháng khó khăn Cám ơn anh chị Phòng Vi sinh – Khoa dược TP Hồ Chí Minh giúp đỡ tận tình Cuối xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến tất người bạn, người thân thương sát cánh suốt chặng đường vừa qua TÓM TẮT Để thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng công tác kiểm nghiệm dược phẩm, tiến hành phân lập từ nhiều nguồn khác nhau: đất, khơng khí, mẫu dược phẩm bị nhiễm Sau trình sàng lọc, kiểm tra đặc tính sinh hóa, định danh kit API 50CHB, API 20E kit Vitek thu chủng Bacillus subtilis PL1, VT1 với mức độ tương đồng 97% 99.5% kit API 98%, 99% kit Vitek Tiến hành chạy PCR, giải trình tự đoạn 16S rADN, so sánh với trình tự ngân hàng liệu gen (NCBI), chương trình BLAST cho thấy chủng Bacillus VT1 tương đồng với chủng Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 chromosome, chủng Bacillus PL1 tương đồng với chủng Bacillus subtilis BSn5 chromosome với tỉ lệ tương đồng 99% Sau kiểm tra đặc tính sinh học đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm dược phẩm phương pháp kháng sinh đồ kiểm tra mẫu thuốc thực tế Viện kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh Kết cho thấy chủng VT1 PL1 nhạy cảm với loại kháng sinh Erythromycin, Vancomycin, Kanamycin monosulfat, Erythromycin estolat Spiramycin Các chủng sau kiểm tra đáp ứng yêu cầu tiến hành nghiên cứu khảo sát q trình bảo quản phương pháp đơng khô Đối với hai chủng VT1 PL1, môi trường bảo vệ tối ưu Skim milk 12% + Trehalose 7% + Na glutamate 5%, thời gian đông lạnh giờ, nhiệt độ đơng lạnh -80oC tỉ lệ sống khoảng 108 cfu/ml Sau đơng khơ -52oC, 36 đạt tỉ lệ sống tương ứng với chủng VT1 khoảng 107 cfu/ml khoảng 108 cfu/ml chủng PL1 ESTABLISH REFERENCE STRAIN OF BACILLUS SUBTILIS USING IN QUALITY CONTROL OF DRUGS ABSTRACT: To establish reference strain of Bacillus subtilis using in quality control of drugs, ten of Bacillus subtilis strains were isolated from soil, air and contaminated pharmaceutical products Identification of the bacteria was performed by biochemical tests and molecular techniques Two isolated strains were identified as Bacillus subtilis PL1, VT1 with identification 97%, 99.5% based on the results of physiological and biochemical tests using kit API 50CHB, API 20E and 98%, 99% when using Vitek kit PCR amplification and 16S rDNA sequence analysis were testing and compared with Bacillus subtilis ATCC 6633 Analysis of DNA sequences and homology was completed with the BLAST server of the National Center for Biotechnology Information This molecular analysis showed that: the strain of Bacillus VT1 is homogolous with Bacillus subtilis subsp subtilis str 168 chromosome, the strain of PL1 is homogolous with Bacillus subtilis BSn5 chromosome with identification 99% Then, test the sensitivity of the isolated strains to a variety of antibiotics with drugs at Institute of drug quality control Ho Chi Minh city The results that two isolated strains so sensitivity with Erythromycin, Vancomycin, Kanamycin monosulfat, Erythromycin estolat Spiramycin Then preservation of two strains by freeze drying With strains VT1 and PL1, media preservation optimize is Skim milk 12 % + Trehalose 7% + Na glutamate 5%, freeze hours at -80oC, survival rate 108 cfu/ml When drying at 52oC, 36 hours, survival rate is 107 cfu/ml with VT1 strain and 108 cfu/ml with PL1 strain LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn kết mà tự tay làm Nếu có chép kết tơi hồn tồn chịu trách nhiệm i MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC ĐỒ THỊ v PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1 Lịch sử phát triển 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm phân bố 1.1.4 Đặc điểm hình thái 1.1.5 Đặc điểm sinh hóa 1.2 Các phương pháp định danh vi sinh vật 1.2.1 Phương pháp truyền thống 1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 1.2.3 Phương pháp PCR – Giải trình tự gen 10 1.3 Một số phương pháp bảo quản vi sinh vật .14 1.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 14 1.3.2 Giữ giống lớp dầu khoáng 15 1.3.3 Giữ giống cát 15 1.3.4 Giữ giống silicagen 15 1.3.5 Giữ giống gelatin 15 1.3.6 Phương pháp đông khô 16 1.3.7 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 20 1.4 Các nghiên cứu nước hướng đề tài 21 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1 Vật liệu thí nghiệm 25 2.2 Nội dung nghiên cứu .26 2.3 Phương pháp thực đề tài 27 ii 2.3.1 Phân lập Bacillus subtilis 27 2.3.2 Định danh Bacillus subtilis phương pháp sinh hóa 28 2.3.3 Định danh Bacillus subtilis phương pháp sinh học phân tử 30 2.3.4 Kiểm tra đặc tính sinh học đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm dược phẩm……………………………………………………………………………… 33 2.3.4.1 Kiểm tra khả nhạy cảm với kháng sinh phương pháp kháng sinh đồ 34 2.3.4.2 Thử nghiệm số mẫu thuốc kháng sinh 35 2.3.5 Khảo sát phương pháp bảo quản đông khô 35 2.3.5.1 Khảo sát môi trường chất bảo vệ…………………………………….36 2.3.5.2 Khảo sát thời gian đông lạnh……………………………………… 36 2.3.5.3 Khảo sát q trình đơng khơ…………………………………………37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .38 3.1 Phân lập Bacillus subtilis 38 3.2 Định danh Bacillus subtilis phương pháp sinh hóa 39 3.3 Định danh Bacillus subtilis phương pháp sinh học phân tử 44 3.4 Kiểm tra đặc tính sinh học đáp ứng yêu cầu kiểm nghiệm dược phẩm……………………………………………………………………………… 49 3.4.1 Kiểm tra khả nhạy cảm với kháng sinh 49 3.4.2 Thử nghiệm số mẫu thuốc kháng sinh 51 3.5 Khảo sát phương pháp bảo quản đông khô 53 3.5.1 Xây dựng đường chuẩn đường cong sinh trưởng chủng phân lập 53 3.5.1.1 Đường cong sinh trưởng 53 3.5.1.2 Đường chuẩn 54 3.5.2 Khảo sát môi trường chất bảo vệ 55 3.5.3 Khảo sát thời gian đông lạnh 57 3.5.4 Khảo sát q trình đơng khơ 58 3.6 Khảo sát điều kiện bảo quản sản phẩm đông khô 59 3.7 Kiểm tra đặc tính chủng sau q trình đông khô 60 iii CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 7: Định lượng kháng sinh Erythromycin phương pháp vi sinh vật VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HỒ CHÍ MINH Phịng KH&ĐT PHIẾU PHÂN TÍCH Số: MT/WIVS/TS004 ĐỊNH LƯNG KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VẬT Số phân tích: 31L0204 Tài liệu thử : DĐVN BP Tên phép thử Chất chuẩn SKS Nơi sản xuất Hoạt lực giả định Khoảng liều thí nghiệm Vi sinh vật kiểm định Môi trường Điều kiện thử nghiệm Ngày thử nghiệm Lần thử nghiệm : : : : : : : : : : : TCCS/TCNSX USP Tieâu chuẩn khác: Định lượng kháng sinh phương pháp Vi sinh vật Erythromycin stearat 598,3 UI/ mg nguyên trạng, nước 2,13% QT 043 050411 VKN Thuốc TP HCM 250 UI/ mg 2.5:5:10 UI/ml Bacillus subtilis PL1 A11, pH Nhiệt độ: … oC RH: … % 24/09/2012 Lần Lần Cân pha dung dịch thử chất chuẩn: Cân: Cân xác khỏang 0,04179 g (# 25.000 IU) Khối lượng chất chuẩn + bì: 0,0420 Khối lượng bì: 0,0003 Khối lượng chất chuẩn cân: 0,0417 Pha loãng: Cân pha dung dịch thử mẫu cần định lượng: Cân: Cân xác khoảng 0,04630 g (# 25.000 IU) Khối lượng bột thuốc + bì: 0,0465 Khối lượng bì: 0,0002 Khối lượng bột thuốc cân: Pha loãng: 0,0463 XỬ LÝ SỐ LIỆU THƠ Đường kính vòng vô khuaån (mmx10): Plate No S1 S2 S3 U1 U2 U3 167 187 204 165 182 206 165 189 206 163 185 204 163 187 206 165 182 202 163 185 204 163 182 204 165 185 206 163 183 204 161 185 198 159 182 202 163 182 203 164 185 202 163 187 204 163 187 205 Range R* 0,222 Crictical R* 0,280 Group with largest range not contain an outlier Smallest G1 Largest G1 Critical G1 Smallest G2 0,500 0,600 0,750 0,667 0,000 0,000 Largest G2 0,500 0,500 0,000 0,500 0,400 0,500 Critical G2 0,780 Số liệu sau xử lý: Plate No S1 167 165 163 163 165 161 163 163 S2 187 189 187 185 185 185 182 187 S3 204 206 206 204 206 198 203 204 U1 165 163 165 163 163 159 164 163 U2 182 185 182 182 183 182 185 187 U3 206 204 202 204 204 202 202 205 TÍNH KẾT QUẢ Hoạt lực giả định Tỷ lệ hoạt lực : 250 UI/ mg : S3 = 10,0036 IU/ml T3 = 9,9900 IU/ml Đường kính vòng vô khuaån (mmx10): Plate No Dose Totals Means Dose of Standard S1 S2 S3 167 187 204 165 189 206 163 187 206 163 185 204 163 182 203 163 187 204 984 1.117 1.227 164,0 186,2 204,5 Dose of Unkown U1 U2 U3 165 182 206 163 185 204 165 182 202 163 182 204 164 185 202 163 187 205 983 1.103 1.223 163,8 183,8 203,8 Analysis of variance Source of Degree of Sums of Mean Variation Freedom Square Square Preparations 10,03 10,03 Regression 9.720,38 9.720,38 Non-parallelism 0,38 0,38 Quadratic 7,35 7,35 Difference of 7,35 7,35 quadratics Treatments 9.745,47 Blocks 24,14 4,83 Residual error 25 66,69 2,668 Total 35 9.836,31 Slope b = 29,0342 C = 1,001166 Ln potency ratio M' (before correction) -0,0364 Ln potency ratio M' (corrected) -0,0350 Ln potency M 5,4865 Assay weight W 2.837,6530 Fratio F(tab.) 3.644 0,1 2,8 2,75 7,77 4,24 4,24 4,24 1,8 3,85 Estimate Potency & its Fiducial Limits: Potency Upper limit of potency Lower limit of potency 241,4 250,9 232,2 UI/ mg UI/ mg UI/ mg 96,6 103,9 96,2 % % % Plate Totals 1.111 1.112 1.105 1.101 1.099 1.109 6.637 PHỤ LỤC 8: Định lượng kháng sinh Spiramycin phương pháp vi sinh vật VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HỒ CHÍ MINH Phịng KH&ĐT PHIẾU PHÂN TÍCH Số: MT/WIVS/TS004 ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VẬT Số phân tích: Tài liệu thử 31L0520 : DĐVN TCCS/TCNSX BP USP Tiêu chuẩn khác: Tên phép thử : Định lượng kháng sinh phương pháp Vi sinh vật Chất chuẩn : Spiramycin 332,7 IU/mg trạng SKS : QT 032 090812 Nơi sản xuất : Viện kiểm nghiệm Thuốc Tp.HCM Hoạt lực giả định : 500 000 IU/ viên Khoảng liều thí nghiệm : 25:50:100 IU/mg Vi sinh vật kiểm định : Bacillus subtilis VT1 Môi trường : A11, pH8 Điều kiện thử nghiệm : Nhiệt độ: … oC RH: … % Ngày thử nghiệm : 24/09/2012 Lần thử nghiệm : Lần Lần Cân pha dung dịch thử chất chuẩn: Cân: Cân xác khoảng 0,0577 g (# 250 000 IU) Khối lượng chất chuẩn + bì: 0,0579 g Khối lượng bì: 0,0005 g Khối lượng chất chuẩn cân: Pha loãng: Cân pha dung dịch thử mẫu cần định lượng: Tính khối lượng trung bình viên: Khối lượng 10 viên + bì : Khối lượng bì: 0,0574 g 5,0359 g 0,0000 g Khối lượng 10 viên : 5,0359 Khối lượng trung bình viên : 0,503590 Cân : Cân xác khoảng 0,0839 g (# 250 000 IU) Khối lượng bột thuốc + bì : 0,0844 Khối lượng bì : 0,0005 Khối lượng bột thuốc cân : 0,0839 g g g g g XỬ LÝ SỐ LIỆU THÔ Đường kính vòng vô khuẩn (mmx10) : Plate No Range R* Crictical R* Smallest G1 Largest G1 Critical G1 Smallest G2 Largest G2 Critical G2 S1 189 193 191 193 194 193 191 194 0,200 0,280 S2 211 215 217 215 215 215 213 215 S3 233 235 235 237 233 235 237 233 U1 191 194 193 193 193 191 189 193 U2 213 215 218 215 213 217 213 215 U3 232 236 237 235 235 236 234 235 Group with largest range not contain an outlier 0,400 0,333 0,780 1,000 0,500 0,000 0,500 0,500 0,333 0,000 0,600 0,750 0,333 S1 189 193 191 193 193 193 191 194 S2 211 215 217 215 215 215 213 215 S3 233 235 235 237 233 235 237 233 U1 191 194 193 193 193 191 189 193 U2 213 215 219 215 217 217 213 215 U3 232 237 237 239 235 239 232 235 Số liệu sau xử lý: Plate No TÍNH KẾT QUẢ Hoạt lực giả định Tỷ lệ hoạt lực : : = = S3 T3 500 000 99,4788 99,9623 IU/ viên IU/ml IU/ml Đường kính vòng vô khuẩn (mmx10) : Plate No Dose Totals Means Dose of Standard Dose of Unkown S1 S2 S3 U1 U2 U3 189 193 193 194 193 191 1.153 192,2 211 215 215 215 215 213 1.284 214,0 233 235 237 233 235 237 1.410 235,0 191 194 193 193 191 189 1.151 191,8 213 215 215 213 217 213 1.286 214,3 232 236 235 235 236 234 1.408 234,7 Fratio F(tab.) 6.938 0,0 2,8 0,56 7,77 4,24 4,24 4,24 6,1 3,85 Analysis of variance Source of Degree of Sums of Mean Variation Freedom Square Square Preparations 0,11 0,11 Regression 11.008,17 11.008,17 Non-parallelism 0,00 0,00 Quadratic 4,50 4,50 Difference of 0,89 0,89 quadratics Treatments 11.013,67 Blocks 48,67 9,73 Residual error 25 39,67 1,587 Total 35 11.102,00 Slope b = 30,8977 C = 1,000612 Ln potency ratio M' (before correction) -0,0036 Ln potency ratio M' (corrected) -0,0084 Ln potency M 14,2125 Assay weight W 5.411,7726 Estimate Potency & its Fiducial Limits : Potency Upper limit of potency Lower limit of potency 1.487.386,7 1.529.619,0 1.446.305,4 IU/ vieân IU/ vieân IU/ vieân 99,2 102,8 97,2 % % % Plate Totals 1.269 1.288 1.288 1.283 1.287 1.277 7.692 PHỤ LỤC 9: Định danh vi khuẩn VT1 sau đông khô kit Api 50 CHB 20 E PHỤ LỤC 10: Định danh vi khuẩn PL1 sau đông khô kit Api 50 CHB 20 E PHỤ LỤC 11: Định lượng kháng sinh Erythromycin phương pháp vi sinh vật với chủng VT1 sau đông khô Trang : 1/4 VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC PHIẾU PHÂN Số : MT/WITP HỒ CHÍ MINH TÍCH VS/TS004 Phịng KH&ĐT ĐỊNH LƯNG KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VẬT Số phân tích : 31G0864 Tài liệu thử : DĐVN BP Tên phép thử Chất chuẩn SKS Nơi sản xuất Hoạt lực giả định Khoảng liều thí nghiệm Vi sinh vật kiểm định Môi trường Điều kiện thử nghiệm Ngày thử nghiệm Lần thử nghiệm : : : : : : : : : : : TCCS/TCNSX USP Tiêu chuẩn khác : Định lượng kháng sinh phương pháp Vi sinh vật Erythromycin stearat 598,3 UI/ mg nguyên trạng, nước 2,13% QT 043 050411 VKN thuốc TP HCM 600 UI/ mg 2,5:5:10 UI/ml Bacillus subtilis VT1 A, pH Nhiệt độ : … oC RH : … % 20/02/2013 Lần Lần Cân pha dung dịch thử chất chuẩn : Cân : Cân xác khỏang 0,04179 g (# 25.000 IU) Khối lượng chất chuẩn + bì : 0.0425 Khối lượng bì : 0.0000 Khối lượng chất chuẩn cân : 0.0425 Cân pha dung dịch thử mẫu cần định lượng : Cân : Cân xác khoảng 0,04167 g (# 25.000 IU) Khối lượng bột thuốc + bì : 0.0421 Khối lượng bì : 0.0008 Khối lượng bột thuốc cân : Pha loãng : 0.0413 XỬ LÝ SỐ LIỆU THÔ Đường kính vòng vô khuẩn (mmx10) : Plate No Range R* Crictical R* Smallest G1 Largest G1 Critical G1 Smallest G2 Largest G2 Critical G2 S1 172 174 172 174 175 176 172 170 0.231 0.280 S2 191 196 193 198 194 196 189 193 S3 215 217 215 220 217 213 215 211 U1 163 167 165 170 169 167 167 165 U2 187 189 187 191 187 191 197 185 12 U3 206 209 202 211 210 209 206 206 Group with largest range not contain an outlier 0.400 0.500 0.780 0.571 0.286 0.667 0.429 0.333 0.600 0.333 0.600 0.500 0.400 S1 172 174 172 174 175 176 172 170 S2 191 196 193 198 194 196 189 193 S3 215 217 215 220 217 213 215 211 U1 163 167 165 170 169 167 167 165 U2 187 189 187 191 187 191 197 185 U3 206 209 202 211 210 209 206 206 Số liệu sau xử lyù: Plate No TÍNH KẾT QUẢ Hoạt lực giả định Tỷ lệ hoạt lực S3 T3 : : = = 600 10.1711 9.9120 UI/ mg IU/ml IU/ml Đường kính vòng vô khuaån (mmx10) : Dose of Standard Plate No Dose Totals Means Dose of Unkown S1 S2 S3 U1 U2 U3 172 174 172 174 175 176 1,043 173.8 191 196 193 198 194 196 1,168 194.7 215 217 215 220 217 213 1,297 216.2 164 167 165 170 169 167 1,002 167.0 187 189 187 191 187 191 1,132 188.7 206 209 202 211 210 209 1,247 207.8 Sums of Square Mean Square F-ratio F(tab.) 1 1 448.03 10,375.04 3.38 1.68 5.01 448.03 10,375.04 3.38 1.68 5.01 4,204 1.4 0.7 2.03 7.77 4.24 4.24 4.24 5 25 35 10,833.14 111.47 61.69 11,006.31 22.29 2.468 9.0 3.85 Analysis of variance Source of Variation Degree of Freedom Preparations Regression Non-parallelism Quadratic Difference of quadratics Treatments Blocks Residual error Total Slope b = C= 29.9960 1.001010 Ln potency ratio M' (before correction) -0.2352 Ln potency ratio M' (corrected) -0.2094 Ln potency M 6.1875 Assay weight W 3,142.2939 Estimate Potency & its Fiducial Limits : Potency 486.6 UI/ mg 81.1 % Upper limit of potency 504.7 UI/ mg 103.7 % Lower limit of potency 469.1 UI/ mg 96.4 % Plate Totals 1,135 1,152 1,134 1,164 1,152 1,152 6,889 PHỤ LỤC 12: Định lượng kháng sinh Spiramycin phương pháp vi sinh vật với chủng PL1 sau đơng khơ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HỒ CHÍ MINH Phịng KH&ĐT PHIẾU PHÂN TÍCH Trang : 1/4 Số : MT/WIVS/TS004 ĐỊNH LƯNG KHÁNG SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP VI SINH VẬT Số phân tích : 31L0579 Tài liệu thử : DĐVN BP TCNSX USP Tiêu chuẩn khác : Tên phép thử : Định lượng kháng sinh phương pháp Vi sinh vật Spiramycin 4332,7 IU/mg trạng Chất chuẩn : SKS : QT 032 090812 Nơi sản xuất : Viện kiểm nghiệm Thuốc Tp.HCM Hoạt lực giả định : 000 000 IU/ viên Khoảng liều thí nghiệm : 25:50:100 IU/mg Vi sinh vật kiểm định : Bacillus subtilis PL1 Môi trường : A, pH8 Điều kiện thử nghiệm : Nhiệt độ : … oC RH : … % Ngày thử nghiệm : 20/02/2013 Lần thử nghiệm : Lần Lần Cân pha dung dịch thử chất chuẩn : Cân : Cân xác khoảng 0,0577 g (# 250 000 IU) Khối lượng chất chuẩn + bì : 0.0579 g Khối lượng bì : 0.0005 g Khối lượng chất chuẩn cân : Cân pha dung dịch thử mẫu cần định lượng : Tính khối lượng trung bình viên : Khối lượng 10 viên + bì : Khối lượng bì : 0.0574 g 8.1836 g 0.0000 g Khối lượng 10 viên : 8.1836 g Khối lượng trung bình viên : 0.818360 g Cân : Cân xác khoảng 0,0682 g (# 250 000 IU) Khối lượng bột thuốc + bì : 0.0689 g Khối lượng bì : 0.0005 g Khối lượng bột thuốc cân : 0.0684 g XỬ LÝ SỐ LIỆU THÔ Đường kính vòng vô khuẩn (mmx10) : Plate No S1 198 191 191 191 193 193 Range R* 0.237 Crictical R* 0.300 Smallest G1 0.000 Largest G1 0.714 Critical G1 0.644 Smallest G2 Largest G2 Critical G2 Số liệu sau xử lyù: Plate No S1 198 191 191 191 193 193 S2 217 213 213 213 213 215 S3 239 233 232 241 235 232 U1 194 193 194 193 193 191 U2 215 215 211 217 215 213 U3 237 233 233 241 235 232 Group with largest range not contain an outlier 0.000 0.000 0.667 0.333 0.111 0.500 0.222 0.000 0.333 0.444 S2 217 213 213 213 213 215 S3 239 233 232 241 235 232 U1 194 193 194 193 193 191 U2 215 215 211 217 215 213 U3 237 233 233 241 235 232 TÍNH KẾT QUẢ Hoạt lực giả định Tỷ lệ hoạt lực S3 T3 : : = = 000 000 99.4788 100.2982 IU/ viên IU/ml IU/ml Đường kính vòng vô khuẩn (mmx10) : Plate No Dose Totals Means Dose of Standard Dose of Unkown S1 S2 S3 U1 U2 U3 198 191 191 191 193 193 1,157 192.8 217 213 213 213 213 215 1,284 214.0 239 233 232 241 235 232 1,412 235.3 194 193 194 193 193 191 1,158 193.0 215 215 211 217 215 213 1,286 214.3 237 233 233 241 235 232 1,411 235.2 Sums of Square Mean Square Fratio F(tab.) Analysis of variance Source of Variation Degree of Freedom Preparations Regression Nonparallelism Quadratic Difference of quadratics Treatments Blocks Residual error Total 1 0.11 10,752.67 0.11 10,752.67 2,471 7.77 1 0.17 0.06 0.22 0.17 0.06 0.22 0.0 0.0 0.05 4.24 4.24 4.24 5 10,753.22 99.56 19.91 4.6 3.85 25 35 108.78 10,961.56 Slope b = 4.351 30.5370 C = 1.001720 Ln potency ratio M' (before correction) Ln potency ratio M' (corrected) Ln potency M 0.0036 -0.0046 14.9096 Assay weight W 1,925.5086 Estimate Potency & its Fiducial Limits : Potency 2,986,338.4 IU/ vieân 99.5 % Upper limit of potency Lower limit of potency 3,129,852.4 2,849,360.1 IU/ vieân IU/ vieân 104.8 95.4 % % Plate Totals 1,300 1,278 1,274 1,296 1,284 1,276 7,708 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: Hồng Thị Kim Thoa Ngày, tháng, năm sinh: 08/03/1988 Nơi sinh: Quảng Ngãi Địa liên lạc: 128/16A Nguyễn Sơn, phường Phú Thọ Hòa, quận Tân Phú, Tp Hồ Chí Minh Q TRÌNH ĐÀO TẠO 09/ 2006 – 01/2011: học đại học trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh 09/2011 – nay: học cao học trường Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh Q TRÌNH CƠNG TÁC 06/2011 – 01/2012: làm việc Công ty Cổ phần SPM – Khu Công nghiệp Tân Tạo 02/2012 – nay: làm việc Viện kiểm nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh ... với đề tài ? ?Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng kiểm nghiệm dược phẩm? ?? 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương vi khuẩn Bacillus subtilis 1.1.1 Lịch sử phát triển Bacillus subtilis. .. thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng công tác kiểm nghiệm dược phẩm, tiến hành phân lập từ nhiều nguồn khác nhau: đất, khơng khí, mẫu dược phẩm bị nhiễm Sau q trình sàng lọc, kiểm. .. học Mã số : 604280 I TÊN ĐỀ TÀI: Thiết lập chủng Bacillus subtilis đối chiếu sử dụng kiểm nghiệm dược phẩm II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu thuốc bị nhiễm, đất,