Đề tài này được thực hiện với mục tiêu tinh chế và tiêu chuẩn hóa hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của meloxicam. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT 5-METHYLTHIAZOL-2-YLAMIN ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MELOXICAM Nguyễn Thị Tú Quyên*, Lưu Thảo Phúc Trường*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Đặt vấn đề – Mục tiêu nghiên cứu: Trong nghiên cứu sản xuất thuốc thành phẩm, tạp chất liên quan làm thay đổi hiệu lâm sàng đặc tính an toàn thuốc Một số chuẩn tạp chưa có có thường đắt tiền Trong đó, nhiều chuyên luận Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm tương ứng meloxicam, metformin, … Vì đề tài thực với mục tiêu tinh chế tiêu chuẩn hóa hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin để làm chất đối chiếu kiểm nghiệm tạp chất liên quan meloxicam Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Tinh chế hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B), xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tiêu chuẩn hóa chất Xây dựng quy trình định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam Kết quả: 5-methylthiazol-2-ylamin tinh chế phương pháp kết tinh lại methanol Độ tinh khiết tạp B sau tinh chế 99% Quy trình xác định độ tinh khiết tạp B phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký thích hợp xây dựng thẩm định, có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng độ xác cao Đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật 5-methylthiazol2-ylamin với tiêu: tính chất, định tính độ tinh khiết Quy trình định lượng tạp B meloxicam HPLC với điều kiện sắc ký giống quy trình xác định độ tinh khiết tạp B thẩm định theo hướng dẫn ICH Kết luận: 5-methylthiazol-2-ylamin tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng kiểm nghiệm tạp B meloxicam Quy trình định lượng tạp B ứng dụng để kiểm tra mẫu nguyên liệu chế phẩm meloxicam, cho kết đạt yêu cầu giới hạn tạp chất 5methylthiazol-2-ylamin theo quy định Dược điển Việt Nam IV Từ khóa: 5-methylthiazol-2-ylamin, tạp chất liên quan meloxicam, HPLC ABSTRACT STANDARDIZATION OF 5-METHYLTHIAZOL-2-YLAMINE AS REFERENCE SUBSTANCE FOR RELATED SUBSTANCE TEST OF MELOXICAM Nguyen Thi Tu Quyen, Luu Thao Phuc Truong, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 175 - 181 Objective: In pharmaceutical research and manufacture, the presence of related impurities may influence the efficacy and safety of the pharmaceutical products Some impurity standards are not available, the others are so expensive Many API and FP monographs such as meloxicam, merformin, etc in Vietnamese Pharmacopoeia IV require conducting impurities tests Therefore, the aim of this study was to purify and standardize 5methylthiazole-2-ylamine chemical as reference substance for related substance test of meloxicam Subjects and Methods: 5-methylthiazole-2-ylamine (impurity B) was purified, quantified, and * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Thị Tú Quyên ĐT: 0913799068 Chuyên Đề Dược Học Email: diemnhim@yahoo.com 175 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 standardized Then, a HPLC assay of impurity B in meloxicam raw materials and corresponding pharmaceuticals was developed and applied Results: 5-methylthiazole-2-ylamine was purified by recrystallization in methanol The resultant product‘s purity was over 99% A HPLC method for quantitation of impurity B was developed and validated according to ICH guidelines The method showed selective, wide linearity range, high precision and accuracy The impurity B was standardized on appearance, identification and purity Conclusion: 5-methylthiazole-2-ylamine was standardized as reference substance for impurity B test of meloxicam The validated HPLC method was successfully applied for impurity B test of meloxicam raw material and corresponding pharmaceuticals The results showed that both samples complied with requirements for monograph meloxicam of Vietnam Pharmacopoeia IV in related substance test Key words: 5-methylthiazole-2-ylamine, related substance of meloxicam, HPLC phẩm nguyên trạng Điều kiện bảo quản: 5°C ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nghiên cứu sản xuất thuốc thành phẩm, tạp chất liên quan làm thay đổi hiệu lâm sàng đặc tính an tồn thuốc Ngồi ra, việc sử dụng thuốc generic cho bệnh nhân để giảm chi phí điều trị đòi hỏi quan kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng hiệu thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt hàm lượng hoạt chất tạp chất phân hủy Hiện nay, việc điều chế tạp chất liên quan chưa quan tâm nhiều Việt Nam Một số chuẩn tạp chưa có có thường đắt tiền phải mua từ nước ngồi Trong đó, nhiều chuyên luận Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm tương ứng meloxicam, metformin, (1) Vì vậy, đề tài thực với mong muốn góp phần ứng dụng vào việc kiểm tra tạp chất liên quan nguyên liệu thành phẩm chứa meloxicam ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin, độ tinh khiết 98%, số lơ A0275029, lọ g, sản xuất công ty Acros organics (Bỉ) Hạn dùng: 07/2015 Chất chuẩn đối chiếu Meloxicam chuẩn viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM cung cấp Số kiểm sốt: QT 089060911 Hàm lượng 99,35% tính chế 176 Trang thiết bị, hóa chất dung mơi Trang thiết bị Bể siêu âm Elma T840DH (Đức) Cân phân tích điện tử KERN ABS 220-4 (Đức) Máy đo điểm chảy Stuart SMP10 (Anh) Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC (Nhật) Máy sắc ký lỏng hiệu cao Waters 2695, đầu dò PDA 2996 (Mỹ) Hóa chất, dung môi Methanol (MeOH), isopropanol dùng cho sắc ký lỏng (Merck) Triethylamin (TEA), natri hydroxyd, methanol, dicloromethan, n-hexan, aceton đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Phương pháp nghiên cứu Tinh chế 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B meloxicam) Áp dụng phương pháp kết tinh dung môi Sơ kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm kết tinh nhiệt độ nóng chảy sắc ký lớp mỏng Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp B Áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao, cột sắc ký pha đảo C18 Trong trình thực nghiệm, số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến khả tách độ chọn lọc khảo sát thành phần tỷ lệ dung môi pha động, tốc độ dòng, thêm base hữu vào pha động để cải thiện hệ số bất đối pic tạp B Điều kiện sắc ký thích hợp phải đáp ứng yêu cầu sau: pic tạp B Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 có hệ số bất đối AS nằm khoảng 0,8 – 1,5, tách hoàn toàn pic khác sắc ký đồ (kể meloxicam) đạt độ tinh khiết pic ≥ 99% Điều kiện thích hợp để định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam Tiêu chuẩn hóa tạp B Tạp B tiêu chuẩn hóa tiêu: tính chất, định tính độ tinh khiết Xây dựng quy trình định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam Áp dụng điều kiện sắc ký quy trình xác định độ tinh khiết tạp B Do giới hạn cho phép tạp B nguyên liệu meloxicam theo Dược điển Việt Nam IV 0,1%, mẫu giả lập chuẩn bị sau: thủy phân nguyên liệu meloxicam dung dịch natri hydroxyd 1M, sau điều chỉnh cách thêm chuẩn meloxicam để dung dịch có tỷ lệ nồng độ meloxicam tạp B 1000:1, lọc qua màng lọc 0,45 µm tiến hành sắc ký (3) Khảo sát nồng độ đo mức: meloxicam 500 µg/ml tạp B 0,5 µg/ml (dung dịch chuẩn I); meloxicam 1000 µg/ml tạp B µg/ml (dung dịch chuẩn II) Chọn nồng độ đo thích hợp diện tích pic tạp B đủ lớn để đảm bảo tính xác độ phương pháp, pic meloxicam không lớn để đảm bảo cột không bị tải Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn ICH ban hành tháng 11 năm 2005 (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ xác độ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tinh chế 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B meloxicam) Bốn gam 5-methylthiazol-2-ylamin kết tinh lại lượng tối thiểu methanol nóng, lọc nóng qua giấy lọc để nguội cho kết tinh, sau lọc áp suất giảm để thu tủa, sấy tủa 50oC giờ, thu g sản phẩm tinh chế Bảng hình minh Chuyên Đề Dược Học Nghiên cứu Y học họa kết kiểm tra độ tinh khiết sản phẩm tinh chế Bảng 1: Kết xác định nhiệt độ nóng chảy tạp B sau tinh chế Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn (°C) chảy (°C) 95 95 95 95 95 95 Nhận xét: khoảng nhiệt độ từ trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến tan chảy hoàn toàn tạp B chênh lệch không 1°C, sơ cho thấy tạp B tinh khiết (1) (2) Hình 1: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh khiết tạp B Sắc ký lớp mỏng: Bản mỏng silica gel 60 F254 (10 x 1,5 cm) Dung môi khai triển Dicloromethan – methanol (20:1) n-hexan – aceton (2:1) Phát hiện: soi đèn UV 254 nm Thể tích chấm mẫu: 10 µl Dung dịch thử: dung dịch tạp B 0,01 g/ml methanol Nhận xét: tiến hành sắc ký với hệ dung môi khai triển khác cho vết nhất, khơng có vết lạ, sơ cho thấy mẫu tạp B tinh khiết Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp B Hình minh họa sắc ký đồ mẫu tạp B (mẫu thử) với số điều kiện sắc ký khảo sát tiêu biểu 177 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 (1) (1) (a) (1) (d) (1) (c) (b) (1) (1) (f) (e) Hình 2: Sắc ký đồ mẫu tạp B với điều kiện sắc ký khảo sát Bước sóng phát hiện: 260 nm (bước sóng hấp thụ cực đại dựa vào phổ UV thời gian lưu pic tạp B) (1): tạp B.(a): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; µm), MeOH – nước (40:60), ml/phút, 20 µl (b): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; µm), MeOH - isopropanol (40:60), ml/phút, 20 µl (c): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; µm), MeOH – TEA mM/nước (pH 10,5) (50:50), ml/phút, 20 µl (d): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (50:50), 0,6 ml/phút, 10 µl (e): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (50:50), 0,8 ml/phút, 10 µl (f): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (45:55), 0,6 ml/phút, 10 µl phút, hệ số bất đối AS = 1,2; độ tinh khiết pic Nhận xét: Điều kiện (a - d): pic tạp B có hệ số tạp B ≥ 99% (kiểm tra với đầu dò PDA); Đồng đối xứng lớn 1,5 thời điều kiện cho pic tạp B tách hoàn Điều kiện (e): thời gian lưu tạp B 3,3 tồn pic meloxicam (hình 3) phút, trùng với pic meloxicam Điều kiện (f): thời gian lưu tạp B 5,07 Hình 3: Sắc ký đồ dung dịch meloxicam 1000 µg/ml tạp B µg/ml với điều kiện (f) 178 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Thẩm định phương pháp Bảng 2: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống dung dịch tạp B 100 µg/ml (n=6) Trung bình tR (phút) 5,072 S (µV x giây) 5578731 RSD 0,10% 0,38% AS RS N 1,2 8,5 32753 Nghiên cứu Y học Nhận xét: RSD thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đĩa lý thuyết (N) không 2%, hệ số bất đối (AS) nằm khoảng 0,8 – 1,5, độ phân giải (RS) lớn 1,5 Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống 1,53% Bảng 3: Kết khảo sát tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính độ xác Tính đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu pha động: không xuất pic thời gian lưu pic tạp B sắc ký đồ mẫu thử Sắc ký đồ mẫu thử: pic tạp B có pic lạ có thời gian lưu phổ UV giống pic xuất sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ pic lạ mẫu trắng Pic tạp B tinh khiết tách hoàn toàn pic khác Khoảng tuyến tính 20 – 200 ppm; y = 54638x; R = 0,9998 Độ lặp lại (RSD, n=6) 1,78% Độ xác trung gian 1,70% (RSD, n = 18) Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết tạp B phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng độ xác cao, áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết tạp B Bảng 4: Kết xác định độ tinh khiết tạp B (n=6) 99,90% Bảng 5: Tóm tắt tiêu đề nghị dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp B Chỉ tiêu Khoa Dược, Đại Viện Kiểm học Y Dược nghiệm thuốc TPHCM TPHCM Độ tinh khiết tạp B chế phẩm nguyên trạng xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Sau tiến hành tiêu chuẩn hóa tạp B, dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp B trình bày bảng Tính chất Mức chất lượng đề nghị Chất rắn, dạng bột vô định hình màu nâu, mùi hắc Tan methanol, cloroform Định tính 99,94% Tiêu chuẩn hóa tạp B Việc xây dựng phương pháp kiểm tra chất lượng tạp B tiến hành mẫu sản phẩm tinh chế với tiêu tham khảo theo Dược điển Việt Nam IV Độ tinh khiết tạp B Nhiệt độ nóng chảy Phổ hồng ngoại Độ tinh khiết 95°C ± 0,5°C Phải có số sóng nhóm –NH (3423 -1 -1 cm ), C=C (1510 cm ) Khơng 99,0% tính chế phẩm nguyên trạng xác định HPLC Xây dựng quy trình định lượng tạp B nguyên liệu meloxicam chế phẩm (a) (b) Hình 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn I (a) dung dịch chuẩn II (b) Chuyên Đề Dược Học 179 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Hình minh họa sắc ký đồ dung dịch chuẩn I II với điều kiện sắc ký tương tự quy trình xác định độ tinh khiết tạp B Cả dung dịch chuẩn I II có pic tạp B có hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải meloxicam pic tạp B lớn 1,5; số đĩa lý thuyết không bị giảm sau lần tiêm mẫu liên tiếp Điều chứng tỏ cột không bị tải Chiều cao pic tạp B sắc ký đồ dung dịch I II 0,002 AU 0,005 AU Để đảm bảo độ độ xác đánh giá quy trình, chọn dung dịch II tương ứng với nồng độ đo meloxicam 1000 µg/ml tạp B µg/ml Bảng 6: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống (n=6) Trung Mẫu bình chuẩn RSD Trung Mẫu giả bình lập RSD tR (phút) S AS RS N 5,054 53502 1,2 3,3 30073 0,19% 1,53% 5,040 53723 0,34% 1,85% 3,47% 1,2 3,4 31909 2,45% Nhận xét: RSD thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) số đĩa lý thuyết (N) không 2%, hệ số bất đối (AS) nằm khoảng 0,8 – 1,5 độ phân giải (RS) lớn 1,5 Vậy quy trình định lượng tạp B meloxicam đạt tính phù hợp hệ thống Thẩm định phương pháp Bảng 7: Kết khảo sát tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ xác độ Tính đặc hiệu Khoảng tuyến tính LOD LOQ Độ lặp lại (RSD, n=6) Độ xác trung gian (RSD, n = 18) Độ (tỷ lệ hồi phục, n = 9) Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng khơng có pic xuất thời gian lưu tương ứng pic tạp B mẫu chuẩn Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu giả lập, mẫu thử thêm chuẩn không xuất pic lạ trùng với pic tạp B, pic tạp B tinh khiết tách hoàn toàn với pic meloxicam Phổ UV thời gian lưu pic tạp B sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu giả lập, mẫu thử thêm chuẩn giống 0,8 – 1,2 ppm; y = 52180x; R = 0,9960 0,08 ppm 0,20 ppm 2,01% 3,05% 99,83% - 104,57% Nhận xét: Quy trình định lượng tạp B meloxicam phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, tuyến tính khoảng nồng độ đo, có giới hạn phát giới hạn định lượng thấp, độ xác độ đáp ứng yêu cầu đề ra(2) Do áp dụng quy trình để định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam Ứng dụng quy trình định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam Bảng 8: Kết định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam (n=6) Nơi cung cấp Nồng độ tạp B (ppm) Nguyên liệu Công ty cổ phần xuất nhập Y tế DOMESCO meloxicam Công ty cổ phần sản xuất – Không phát Chế phẩm thương mại Dược phẩm Zival Đông Nam 180 Nhận xét: nguyên liệu meloxicam viên nén Zival đạt yêu cầu giới hạn tạp chất B theo quy định Dược điển Việt Nam IV KẾT LUẬN 5-methylthiazol-2-ylamin tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng kiểm nghiệm tạp chất B meloxicam Quy trình định lượng tạp B xây dựng, thẩm định ứng dụng để kiểm tra mẫu nguyên liệu chế phẩm meloxicam, cho kết đạt yêu cầu giới hạn tạp B theo quy định Dược điển Việt Nam IV TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học, Hà Nội, 384-386, 390-392 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5 Ludwig H (2007), Validation and qualification in analytical laboratories – 2nd edition, Taylor & Francis Group, New York, Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 142-144, 146-148 Mezei T, Mesterházy N, Bakó T, Porcs-Makkay M, Simig G, Volk B (2009), Manufacture of high-purity meloxicam via its novel potassium salt monohydrate, Organic Process Research & Development, 13:567–572 Chuyên Đề Dược Học Ngày nhận báo: Nghiên cứu Y học 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 26.12.2013 Ngày báo đăng: 10.03.2014 181 ... giới hạn tạp chất B theo quy định Dược điển Việt Nam IV KẾT LUẬN 5-methylthiazol-2-ylamin tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng kiểm nghiệm tạp chất B meloxicam Quy trình định lượng tạp B... sắc ký đồ (kể meloxicam) đạt độ tinh khiết pic ≥ 99% Điều kiện thích hợp để định lượng tạp B nguyên liệu chế phẩm meloxicam Tiêu chuẩn hóa tạp B Tạp B tiêu chuẩn hóa tiêu: tính chất, định tính... đòi hỏi quan kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng hiệu thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt hàm lượng hoạt chất tạp chất phân hủy Hiện nay, việc điều chế tạp chất liên quan chưa quan tâm