Đề tài này được thực hiện với mục tiêu tinh chế và tiêu chuẩn hóa hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của meloxicam. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết.
Trang 1TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT 5-METHYLTHIAZOL-2-YLAMIN
ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM
TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MELOXICAM
Nguyễn Thị Tú Quyên*, Lưu Thảo Phúc Trường*, Nguyễn Đức Tuấn* *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề – Mục tiêu nghiên cứu: Trong nghiên cứu và sản xuất thuốc thành phẩm, các tạp chất liên
quan có thể làm thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc Một số chuẩn tạp vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền Trong khi đó, nhiều chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan trong cả nguyên liệu và thành phẩm tương ứng như meloxicam, metformin, … Vì vậy đề tài này được thực hiện với mục tiêu tinh chế và tiêu chuẩn hóa hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của meloxicam
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Tinh chế hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B), xây dựng quy
trình xác định độ tinh khiết và tiêu chuẩn hóa chất này Xây dựng quy trình định lượng tạp B trong nguyên liệu
và chế phẩm meloxicam
Kết quả: 5-methylthiazol-2-ylamin đã được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong
methanol Độ tinh khiết của tạp B sau khi tinh chế trên 99% Quy trình xác định độ tinh khiết tạp B bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký thích hợp đã được xây dựng và thẩm định, có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao Đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật 5-methylthiazol-2-ylamin với các chỉ tiêu: tính chất, định tính và độ tinh khiết Quy trình định lượng tạp B trong meloxicam bằng HPLC với điều kiện sắc ký giống như quy trình xác định độ tinh khiết tạp B và đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH
Kết luận: 5-methylthiazol-2-ylamin đã được tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng trong
kiểm nghiệm tạp B của meloxicam Quy trình định lượng tạp B đã được ứng dụng để kiểm tra mẫu nguyên liệu và chế phẩm meloxicam, đều cho kết quả đạt yêu cầu về giới hạn của tạp chất 5-methylthiazol-2-ylamin theo quy định của Dược điển Việt Nam IV
Từ khóa: 5-methylthiazol-2-ylamin, tạp chất liên quan của meloxicam, HPLC.
ABSTRACT
STANDARDIZATION OF 5-METHYLTHIAZOL-2-YLAMINE AS REFERENCE SUBSTANCE FOR
RELATED SUBSTANCE TEST OF MELOXICAM
Nguyen Thi Tu Quyen, Luu Thao Phuc Truong, Nguyen Duc Tuan
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 175 - 181
Objective: In pharmaceutical research and manufacture, the presence of related impurities may influence the
efficacy and safety of the pharmaceutical products Some impurity standards are not available, the others are so expensive Many API and FP monographs such as meloxicam, merformin, etc in Vietnamese Pharmacopoeia IV require conducting impurities tests Therefore, the aim of this study was to purify and standardize 5-methylthiazole-2-ylamine chemical as reference substance for related substance test of meloxicam.
Subjects and Methods: 5-methylthiazole-2-ylamine (impurity B) was purified, quantified, and
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Trang 2standardized Then, a HPLC assay of impurity B in meloxicam raw materials and corresponding pharmaceuticals was developed and applied
Results: 5-methylthiazole-2-ylamine was purified by recrystallization in methanol The resultant product‘s
purity was over 99% A HPLC method for quantitation of impurity B was developed and validated according to ICH guidelines The method showed selective, wide linearity range, high precision and accuracy The impurity B was standardized on appearance, identification and purity
Conclusion: 5-methylthiazole-2-ylamine was standardized as reference substance for impurity B test of
meloxicam The validated HPLC method was successfully applied for impurity B test of meloxicam raw material and corresponding pharmaceuticals The results showed that both samples complied with requirements for monograph meloxicam of Vietnam Pharmacopoeia IV in related substance test
Key words: 5-methylthiazole-2-ylamine, related substance of meloxicam, HPLC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nghiên cứu và sản xuất thuốc thành
phẩm, các tạp chất liên quan có thể làm thay đổi
hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc
Ngoài ra, việc sử dụng thuốc generic cho bệnh
nhân để giảm chi phí điều trị đòi hỏi các cơ quan
kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng
và hiệu quả của thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt
là hàm lượng hoạt chất và tạp chất phân hủy
Hiện nay, việc điều chế các tạp chất liên quan
chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam Một số
chuẩn tạp vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất
đắt tiền và phải mua từ nước ngoài Trong khi
đó, nhiều chuyên luận trong Dược điển Việt
Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan
trong cả nguyên liệu và thành phẩm tương ứng
như meloxicam, metformin, (1) Vì vậy, đề tài
này được thực hiện với mong muốn góp phần
ứng dụng vào việc kiểm tra tạp chất liên quan
của nguyên liệu và thành phẩm chứa
meloxicam
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin, độ tinh
khiết 98%, số lô A0275029, lọ 5 g, được sản xuất
bởi công ty Acros organics (Bỉ) Hạn dùng:
07/2015
Chất chuẩn đối chiếu
Meloxicam chuẩn do viện kiểm nghiệm
thuốc TP.HCM cung cấp Số kiểm soát: QT
089060911 Hàm lượng 99,35% tính trên chế
phẩm nguyên trạng Điều kiện bảo quản: 5°C
Trang thiết bị, hóa chất và dung môi
Trang thiết bị
Bể siêu âm Elma T840DH (Đức) Cân phân tích điện tử KERN ABS 220-4 (Đức) Máy đo điểm chảy Stuart SMP10 (Anh) Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC (Nhật) Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695, đầu dò PDA 2996 (Mỹ)
Hóa chất, dung môi
Methanol (MeOH), isopropanol dùng cho sắc ký lỏng (Merck) Triethylamin (TEA), natri hydroxyd, methanol, dicloromethan, n-hexan, aceton đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck)
Phương pháp nghiên cứu
Tinh chế 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B của meloxicam)
Áp dụng phương pháp kết tinh trong dung môi Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm kết tinh bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng
Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp
B
Áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, cột sắc ký pha đảo C18 Trong quá trình thực nghiệm, một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến khả năng tách và độ chọn lọc đã được khảo sát như thành phần và tỷ lệ dung môi pha động, tốc
độ dòng, thêm base hữu cơ vào pha động để cải thiện hệ số bất đối của pic tạp B Điều kiện sắc
ký thích hợp phải đáp ứng yêu cầu sau: pic tạp B
Trang 3có hệ số bất đối AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5,
tách hoàn toàn các pic khác trên sắc ký đồ (kể cả
meloxicam) và đạt độ tinh khiết pic ≥ 99% Điều
kiện này cũng thích hợp để định lượng tạp B
trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam
Tiêu chuẩn hóa tạp B
Tạp B đã được tiêu chuẩn hóa trên các chỉ
tiêu: tính chất, định tính và độ tinh khiết
Xây dựng quy trình định lượng tạp B trong
nguyên liệu và chế phẩm meloxicam
Áp dụng điều kiện sắc ký của quy trình xác
định độ tinh khiết tạp B Do giới hạn cho phép
của tạp B trong nguyên liệu meloxicam theo
Dược điển Việt Nam IV là 0,1%, một mẫu giả lập
đã được chuẩn bị như sau: thủy phân nguyên
liệu meloxicam trong dung dịch natri hydroxyd
1M, sau đó điều chỉnh bằng cách thêm chuẩn
meloxicam để được dung dịch có tỷ lệ nồng độ
của meloxicam và tạp B là 1000:1, lọc qua màng
lọc 0,45 µm và tiến hành sắc ký (3) Khảo sát
nồng độ đo ở 2 mức: meloxicam 500 µg/ml và
tạp B 0,5 µg/ml (dung dịch chuẩn I); meloxicam
1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml (dung dịch chuẩn
II) Chọn nồng độ đo thích hợp khi diện tích pic
tạp B đủ lớn để đảm bảo tính chính xác và độ
đúng của phương pháp, pic meloxicam không
quá lớn để đảm bảo cột không bị quá tải
Thẩm định phương pháp
Theo hướng dẫn của ICH ban hành tháng 11
năm 2005 (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của
hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới
hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng
(LOQ), độ chính xác và độ đúng.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Tinh chế 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B
của meloxicam)
Bốn gam 5-methylthiazol-2-ylamin được
kết tinh lại trong một lượng tối thiểu methanol
nóng, lọc nóng qua giấy lọc và để nguội cho
kết tinh, sau đó được lọc dưới áp suất giảm để
thu tủa, sấy tủa ở 50oC trong 6 giờ, thu được 3
g sản phẩm tinh chế Bảng 1 và hình 1 minh
họa kết quả kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế
Bảng 1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của tạp
B sau tinh chế
Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy (°C) Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn (°C)
Nhận xét: khoảng nhiệt độ từ khi trạng thái
rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn của tạp B chênh lệch không quá 1°C, sơ bộ cho thấy tạp B tinh khiết
Hình 1: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh khiết của
tạp B
Sắc ký lớp mỏng:
Bản mỏng silica gel 60 F254 (10 x 1,5 cm)
Dung môi khai triển
Dicloromethan – methanol (20:1) n-hexan – aceton (2:1)
Phát hiện: soi dưới đèn UV 254 nm
Thể tích chấm mẫu: 10 µl
Dung dịch thử: dung dịch tạp B 0,01 g/ml
methanol
Nhận xét: khi tiến hành sắc ký với 2 hệ dung
môi khai triển khác nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy mẫu tạp B tinh khiết
Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp B
Hình 2 minh họa sắc ký đồ của mẫu tạp B (mẫu thử) với một số điều kiện sắc ký khảo sát tiêu biểu
Trang 4(a) (b) (c)
Hình 2: Sắc ký đồ mẫu tạp B với các điều kiện sắc ký khảo sát Bước sóng phát hiện: 260 nm (bước sóng hấp thụ
cực đại dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp B) (1): tạp B.(a): cột Gemini C 18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – nước (40:60), 1 ml/phút, 20 µl (b): cột Gemini C 18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH - isopropanol (40:60),
1 ml/phút, 20 µl (c): cột Gemini C 18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 1 mM/nước (pH 10,5) (50:50), 1 ml/phút, 20 µl (d): cột Gemini-NX C 18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (50:50), 0,6 ml/phút, 10 µl (e): cột Gemini-NX C 18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (50:50), 0,8 ml/phút, 10 µl (f): cột Gemini-NX C 18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (45:55), 0,6 ml/phút, 10 µl
Nhận xét: Điều kiện (a - d): pic tạp B có hệ số
đối xứng lớn hơn 1,5
Điều kiện (e): thời gian lưu của tạp B là 3,3
phút, trùng với pic meloxicam
Điều kiện (f): thời gian lưu của tạp B là 5,07
phút, hệ số bất đối AS = 1,2; độ tinh khiết của pic tạp B ≥ 99% (kiểm tra với đầu dò PDA); Đồng thời điều kiện này cũng cho pic tạp B tách hoàn toàn pic meloxicam (hình 3)
Hình 3: Sắc ký đồ dung dịch meloxicam 1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml với điều kiện (f)
(1) (1)
(1)
Trang 5Thẩm định phương pháp
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống
trên dung dịch tạp B 100 µg/ml (n=6)
t R (phút) S (µV x giây) A S R S N
Nhận xét: RSD của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đĩa lý thuyết (N) đều không quá 2%,
hệ số bất đối (AS) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5 Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp của hệ thống
Bảng 3: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính và độ chính xác
Tính đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động: không xuất hiện pic tại thời gian lưu của pic tạp B trong sắc
ký đồ mẫu thử
Sắc ký đồ mẫu thử: ngoài pic tạp B chỉ có 2 pic lạ có thời gian lưu và phổ UV giống như 2 pic xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ 2 pic lạ này là của mẫu trắng Pic tạp B tinh khiết và tách hoàn toàn các pic khác
Độ chính xác trung gian
(RSD, n = 18)
1,70%
Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết
tạp B bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu,
khoảng tuyến tính rộng và độ chính xác cao, do
đó có thể áp dụng quy trình để tiến hành xác
định độ tinh khiết của tạp B
Bảng 4: Kết quả xác định độ tinh khiết của tạp B
(n=6)
Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM
Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM
Độ tinh khiết tạp B trên
Tiêu chuẩn hóa tạp B
Việc xây dựng phương pháp kiểm tra chất
lượng tạp B được tiến hành trên 3 mẫu sản
phẩm tinh chế với các chỉ tiêu được tham khảo
theo Dược điển Việt Nam IV Độ tinh khiết tạp B
sẽ được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Sau khi tiến hành tiêu chuẩn hóa tạp B, dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp B được trình bày trong bảng 5
Bảng 5: Tóm tắt các chỉ tiêu được đề nghị trong dự
thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp B
Tính chất
Chất rắn, dạng bột vô định hình màu
nâu, mùi hắc.
Tan trong methanol, cloroform Định tính
Nhiệt độ nóng chảy
95°C ± 0,5°C Phổ hồng
ngoại
Phải có số sóng của nhóm –NH (3423
cm-1), C=C (1510 cm-1)
Độ tinh khiết Không ít hơn 99,0% tính trên chế phẩm
nguyên trạng khi xác định bằng HPLC
Xây dựng quy trình định lượng tạp B trong nguyên liệu meloxicam và chế phẩm
Hình 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn I (a) và dung dịch chuẩn II (b)
Trang 6Hình 4 minh họa sắc ký đồ của dung dịch
chuẩn I và II với điều kiện sắc ký tương tự quy
trình xác định độ tinh khiết tạp B
Cả 2 dung dịch chuẩn I và II đều có pic tạp
B có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5;
độ phân giải giữa meloxicam và pic tạp B lớn
hơn 1,5; số đĩa lý thuyết không bị giảm sau các
lần tiêm mẫu liên tiếp Điều này chứng tỏ cột
không bị quá tải Chiều cao pic tạp B trên sắc
ký đồ của dung dịch I và II lần lượt là 0,002
AU và 0,005 AU Để đảm bảo độ đúng và độ
chính xác khi đánh giá quy trình, chọn dung
dịch II tương ứng với nồng độ đo meloxicam
1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml
Thẩm định phương pháp
Bảng 6: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống
(n=6)
Mẫu chuẩn
Trung
Mẫu giả lập
Trung
Nhận xét: RSD của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) và số đĩa lý thuyết (N) đều không quá 2%,
hệ số bất đối (AS) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và
độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5 Vậy quy trình định lượng tạp B trong meloxicam đạt tính phù hợp của hệ thống
Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác và độ đúng
tương ứng của pic tạp B trong mẫu chuẩn
Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu giả lập, mẫu thử thêm chuẩn không xuất hiện pic lạ trùng với pic tạp B, pic tạp B tinh khiết và tách hoàn toàn với pic meloxicam
Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp B trong sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu giả lập, mẫu thử thêm chuẩn giống nhau
Nhận xét: Quy trình định lượng tạp B trong
meloxicam bằng phương pháp HPLC có tính
đặc hiệu, tuyến tính tại khoảng nồng độ đo, có
giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp,
độ chính xác và độ đúng đáp ứng yêu cầu đề
ra(2) Do đó có thể áp dụng quy trình để định
lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm
meloxicam
Ứng dụng quy trình định lượng tạp B trong
nguyên liệu và chế phẩm meloxicam
Bảng 8: Kết quả định lượng tạp B trong nguyên liệu
và chế phẩm meloxicam (n=6)
(ppm)
Nguyên liệu
meloxicam
Công ty cổ phần xuất nhập
khẩu Y tế DOMESCO
Không phát hiện Chế phẩm
Zival
Công ty cổ phần sản xuất –
thương mại Dược phẩm
Đông Nam
Nhận xét: nguyên liệu meloxicam và viên nén Zival
đạt yêu cầu về giới hạn của tạp chất B theo quy định của Dược điển Việt Nam IV
KẾT LUẬN
5-methylthiazol-2-ylamin đã được tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm tạp chất B của meloxicam Quy trình định lượng tạp B đã được xây dựng, thẩm định và ứng dụng để kiểm tra mẫu nguyên liệu
và chế phẩm meloxicam, đều cho kết quả đạt yêu cầu về giới hạn của tạp B theo quy định của Dược điển Việt Nam IV
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà
Nội, 384-386, 390-392
2 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5
3 Ludwig H (2007), Validation and qualification in analytical laboratories – 2 nd edition, Taylor & Francis Group, New York,
Trang 7142-144, 146-148
4 Mezei T, Mesterházy N, Bakó T, Porcs-Makkay M, Simig G,
Volk B (2009), Manufacture of high-purity meloxicam via its
novel potassium salt monohydrate, Organic Process Research &
Development, 13:567–572
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26.12.2013