Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh- Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Mã số: 62.73.15.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ 2. TS. Nguyễn Văn Thị TP Hồ Chí Minh- Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Minh Hiển Hà Minh Hiển MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv Danh mục các bảng vii Danh mục các hình, biểu đồ, sơ đồ, đồ thị ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Sơ lược về cây Mù u 4 1.2. Sơ lược về hợp chất phenol 13 1.3. Tình hình nghiên cứu về hợp chất phenol từ quả Mù u 16 1.4. Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u 19 1.5. Một số khái niệm về chất chuẩn đối chiếu 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Đối tượng 26 2.2. Nguyên vật liệu 26 2.3. Dung môi, hóa chất và thiết bị thí nghiệm 27 2.4. Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41 3.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 41 3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44 3.3. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 45 3.4. Xác định cấu trúc các hợp chất phenol phân lập được 48 3.5. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 61 3.6. Xây dựng và thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid trong cao methanol chiết từ nhựa Mù u (Phương pháp 1) 76 3.7. Xây dựng và thẩm định phương pháp GC-MS xác định calophyllolid trong vỏ quả Mù u (Phương pháp 2) 83 3.8. Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC-DAD định lượng calophyllolid trong chế phẩm dầu Mù u Inopilo 89 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 96 4.1. Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 96 4.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 97 4.3. Phân lập hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 97 4.4. Xác định cấu trúc hợp chất phenol phân lập được bằng phương pháp phổ nghiệm 98 4.5. Xác định thành phần hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 102 4.6. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu 106 4.7. Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm xác định hợp chất phenol trong nhựa, vỏ quả Mù u và thuốc từ Mù u 108 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMDIS Automated Mass spectral Deconvolution and Identification System br Đỉnh giãn rộng (broad) CDCl 3 Cloroform deuteri hóa CD 3 OD Methanol deuteri hóa 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 COSY COrrelation SpectroscopY d Đỉnh đôi (doublet) dd Đỉnh đôi kép (doublet of doublets) DAD Detector dãy diod quang (Diode Array Detector) DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO-d 6 Dimethyl sulfoxid deuteri hóa EI-MS Phổ khối lượng-ion hóa bắn phá electron (Electron Impact Mass Spectrometry) EMEA European Medicines Agency ESI-MS Phổ khối lượng-ion hóa phun mù electron (Electrospray Ionization-Mass Spectrometry) EtOAc Ethyl acetat EtOH Ethanol EU Liên minh châu Âu (European Union) FDA Cơ quan Thực Dược phẩm Hoa kỳ (Food and Drug Administration) FHH Forum for the Harmonization of Herbal Medicine FTIR Hồng ngoại chuyển đổi Fourier (Fourier Transform Infrared) GC-MS Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas Chromatography- Mass Spectrometry) HIV Human Immunodeficiency Virus HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HRESI-TOFMS Phổ khối lượng thời gian bay-ion hóa phun mù electron phân giải cao (High Resolution Electrospray Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry) ICH Hội nghị quốc tế về hòa hợp (International Conference on Harmonization) ICP-MS Khối phổ plasma cảm ứng (Inductively Coupled Plasma- Mass Spectrometry) IR Hồng ngoại (Infrared) LC-MS Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography- Mass Spectrometry) m Đỉnh đa (multiplet) MDL Giới hạn phát hiện nhỏ nhất (Minimum Detection Limit) MeCN Acetonitril MeOH Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration) MRSA Staphylococcus aureus đề kháng methicilin (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus) MS Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NIST Viện Công nghệ và Tiêu chuẩn Quốc gia Hoa kỳ (National Institute of Standards and Technology) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) Pđ. Phân đoạn PLE Chiết lỏng dưới áp suất (Pressurized Liquid Extraction) q Đỉnh bốn (quartet) R f Hệ số di chuyển (Relative to front) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) s Đỉnh đơn (singlet) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SIM Ion lựa chọn kiểm tra (Selected Ion Monitoring) t Đỉnh ba (triplet) TGA Phân tích nhiệt trọng lượng (Thermogravimetric Analysis) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) TMS Tetramethyl silan TT Thuốc thử tt/tt Thể tích/thể tích USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia) UV-Vis Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet-Visible) VLC Sắc ký lỏng chân không (Vacuum Liquid Chromatography) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization) max Bước sóng hấp thu cực đại max Số sóng hấp thu cực đại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1. Phân loại các hợp chất phenol theo Harborne 13 2.1. Tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn đối chiếu theo WHO 37 2.2. Các yếu tố và mức để chọn điều kiện xử lý mẫu 39 2.3. Thiết kế thí nghiệm chọn điều kiện xử lý mẫu 39 3.1. Kết quả chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng PLE và soxhlet 43 3.2. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44 3.3. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N 1 (CD 3 OD và DMSO-d 6 , máy 500 MHz) 49 3.4. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N 2 (CD 3 OD, máy 500 MHz) 51 3.5. Bảng dữ liệu phổ NMR của hợp chất N 3 (CDCl 3 , máy 500 MHz) 54 3.6. D ữ liệu độ d ài liên kết tiêu biểu của hợp chất N 3 56 3.7. D ữ liệu độ dài và góc liên kết hydrogen của hợp chất N 3 57 3.8. B ảng so sánh dữ liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR c ủa calophyllolid điều chế đư ợc với tài liệu tham khảo 64 3.9. K ết quả khảo sát % diện tích của các tạp chất hữu cơ tại một số bước sóng 66 3.10. Tính phù h ợp của hệ thống HPLC -DAD (n=6) 67 3.11. K ết quả khảo sát khoảng tuyến tính của tạp chất 1 (1); calophyllolid (2); t ạp ch ất 2 (3) 69 3.12. Kết quả khảo sát độ lặp lại và độ chính xác trung gian của phương pháp 70 3.13. Độ tinh khiết calophyllolid trong quá trình đóng l ọ 71 [...]... d u Mù u cũng như vỏ quả Mù u Vì vậy, đề tài: Nghiên c u xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm được thực hiện với các mục ti u nghiên c u cụ thể sau: - Nghiên c u xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u mọc ở Việt Nam bằng một số kỹ thuật sắc ký và phổ nghiệm để chọn chất điểm chỉ dùng trong kiểm nghiệm nguyên li u và chế phẩm từ dược li u Mù u - Nghiên. .. và xác định c u trúc một số hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u - Xây dựng bộ dữ li u nhận dạng chất chuẩn đối chi u, các chỉ ti u chất lượng và phương pháp phân tích để đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chi u - Xây dựng và thẩm định một số phương pháp xác định chất điểm chỉ để ứng dụng trong kiểm nghiệm nguyên li u và chế phẩm từ dược li u Mù u Việc nghiên c u xác định các hợp chất phenol và. .. vỏ quả Mù u bằng phương pháp 43 soxhlet 3.5 Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng phương pháp 44 ngấm kiệt 3.6 Sơ đồ phân lập các hợp chất phenol từ cao n-hexan nhựa Mù u 45 3.7 Sơ đồ phân lập các hợp chất phenol từ cao methanol nhựa Mù u 46 3.8 Sơ đồ phân lập các hợp chất phenol từ cao ethyl acetat vỏ quả Mù u 46 3.9 Sắc ký đồ TLC của các hợp chất phân lập từ nhựa và vỏ quả Mù u. .. Nghiên c u thiết lập 01 chất chuẩn đối chi u để định tính và 01 dùng cho định lượng trong số các hợp chất phenol phân lập được - Ứng dụng chất chuẩn đối chi u đã thi ết lập để kiểm nghiệm nguyên li u và chế phẩm từ dược li u Mù u Để đạt được các mục ti u trên, chúng tôi đã tiến hành các nội dung sau đây: - Xây dựng quy trình chiết xuất một số hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u - Phân lập, tinh chế và. .. giá chất chuẩn đối chi u dùng cho định lượng 25 2.1 Sơ đồ quá trình ép d u và tách loại nhựa Mù u 26 2.2 Đo đường kính vòng vô khuẩn 33 3.1 Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng n-hexan 41 3.2 Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng MeOH-nước 42 3.3 Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u bằng phương pháp 42 PLE 3.4 Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ. .. u dược dụng Nhựa loại ra khi tinh chế d u Mù u và vỏ quả Mù u Việt nam chưa được nghiên c u để sử dụng D u Mù u được dùng riêng hoặc phối hợp với các dược li u khác sử dụng rộng rãi để trị bỏng, viêm loét da, làm mau lành các vết thương… Về mặt ti u chuẩn hóa thì chỉ ti u định tính d u Mù u theo dược điển Việt Nam 4 chưa đủ đặc hi u và khôn g dễ thực hiện do chưa có d u Mù u chuẩn hoặc chất chuẩn đối... d u Mù u thô, d u Mù u tinh chế và thuốc mỡ BALSINO thì d u Mù u tinh chế tác dụng kém hơn d u Mù u thô Thuốc mỡ BALSINO chỉ chứa 61% d u mù u tinh chế phối hợp với 1,3% tersol vẫn cho tác dụng tương đương với d u Mù u tinh chế Tuy nhiên khi nghiên c u tác dụng làm lành sẹo và tác dụng kháng viêm trên mô hình gây bỏng thực nghịêm thì d u Mù u tinh chế tốt hơn d u Mù u thô Nồng độ ức chế tối thi u MIC... tăng áp suất gây ra sự tuần hoàn ly tâm của các dung dịch qua các lỗ [110] Phương pháp này thực hiện chiết trong khí quyển trơ tránh ánh sáng cho hi u suất cao vì các hợp chất phenol kém bền trong đi u kiện có oxy và ánh sáng 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U VỀ HỢP CHẤT PHENOL TỪ QUẢ MÙ U 1.3.1 Một số công trình nghiên c u xác định hợp chất phenol Ngoài nước Năm 2003, Shen và cộng sự chiết xuất hạt Mù u đã nghiền... hóa học và sắc ký lớp mỏng đối chi u với d u Mù u chuẩn [1] Các dược điển: Hoa kỳ 2012, ch u u 7.0, Nhật 2006, Quốc tế 4, Trung quốc 2010 đ u chưa thấy có chuyên luận về các bộ phận dùng cũng như thuốc từ dược li u Mù u Một số chế phẩm với nguyên li u là d u Mù u như: “D u Mù u của công ty cổ phần dược Minh Hải, thuốc mỡ “Trăn Mù u của công ty cổ phần dược phẩm Quang Minh, chế phẩm “D u Mù u Inopilo”... chuẩn đối chi u [1] Các dược điển: Hoa kỳ 2012, Anh 2013, ch u u 7.0, Nhật 2006, Quốc tế 4, Trung quốc 2010 đ u chưa thấy có chuyên luận về các bộ phận dùng cũng như các chế phẩm từ dược li u Mù u Ti u chuẩn cơ sở của d u Mù u cũng như các chế phẩm từ d u Mù u này tuy đã có nhưng chưa đáp ứng với các nguyên tắc, ti u chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc đối với cơ sở sản xuất thuốc từ dược li u của tổ chức . hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 41 3.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 44 3.3. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 45 3.4. Xác định c u trúc. BÀN LUẬN 96 4.1. Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 96 4.2. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u 97 4.3. Phân lập hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u 97 4.4. Xác. chất phenol từ nhựa và v ỏ quả Mù u đ ể ứng dụng trong ki ểm nghiệm đư ợc thực hiện với các mục ti u nghiên c u cụ thể sau: - Nghiên c u xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u mọc