Nghiên cứu biến tính cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit và kỹ thuật chiếu xạ để ứng dụng trong nông nghiệp NCS. Bùi Phước Phúc

1 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Chitosan (CTS) là một polysaccarit trong thiên nhiên rất phong phú và đa dạng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực vì an toàn cho con người và thân thiện với môi trường. -chitosan thường được chế tạo từ deaxetyl -chitin vỏ tôm, cua và -chitosan được chế tạo từ deaxetyl -chitin mai mực. Nhờ các tính năng ưu việt như không độc, tương hợp và phân hủy sinh học, kháng vi khuẩn và nấm bệnh, nên CTS được dùng nhiều trong công nông nghiệp, y học và dược phẩm. Do khối lượng phân tử (KLPT) của CTS thường khá cao đã hạn chế khả năng tan trong môi trường trung tính và kiềm nên các ứng dụng của CTS hầu như chỉ giới hạn ở môi trường axit. Nhằm mở rộng và nâng cao hiệu quả sử dụng, một trong những biện pháp thường dùng là cắt mạch chitosan để chế tạo CTS có KLPT thấp và oligochitosan. CTS có KLPT thấp và oligochitosan thể hiện hoạt tính sinh học cao hơn CTS có khối lượng phân tử cao như tính chống oxi hóa, tăng khả năng hệ miễn dịch đối với vật nuôi, cây trồng, do đó được sử dụng làm thực phẩm chức năng, dược phẩm (điều trị suy giảm miễn dịch, điều trị vết thương, hạn chế sự phát triển tế bào ung thư…) làm chất kháng bệnh trong nông nghiệp. Có 3 phương pháp chính thường dùng để làm giảm KLPT của CTS là cắt mạch bằng hóa học, enzym và chiếu xạ. Đa phần các nghiên cứu cắt mạch chitosan là chỉ dùng các phương pháp một cách riêng rẽ. Việc kết hợp các phương pháp với nhau để nghiên cứu cắt mạch chitosan là rất cần thiết. Đặc biệt là kết hợp kỹ thuật chiếu xạ gamma Co-60 với H 2 O 2 là vấn đề mới nhằm tạo ra bước đột phá gia tăng hiệu quả cắt mạch chitosan. 2 Mục tiêu, tính khoa học và thực tiễn của đề tài Dựa vào những cơ sở trên, mục tiêu của luận án đặt ra là nghiên cứu biến tính cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit và kỹ thuật chiếu xạ để ứng dụng trong nông nghiệp. Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: 1. Chế tạo các mẫu α-chitosan từ deaxetyl α-chitin vỏ tôm và β-chitosan từ deaxetyl β-chitin mai mực. 2. Cắt mạch α-chitosan và β-chitosan bằng H 2 O 2 . 3. Cắt mạch α-chitosan và β-chitosan bằng chiếu xạ gamma Co-60. 4. Cắt mạch chitosan bằng H 2 O 2 kết hợp với chiếu xạ gamma Co-60. ● Cắt mạch α-chitosan và β-chitosan với độ deaxetyl 70 - 94% bằng H 2 O 2 trước sau đó đem chiếu xạ (hiệu ứng cộng hợp). ● Chiếu xạ cắt mạch α-chitosan và β-chitosan có sự hiện diện của H 2 O 2 (hiệu ứng đồng vận). 5. Khảo nghiệm hiệu ứng kích thích tăng trưởng và kháng bệnh của oligochitosan đối với cây lúa và cây mía. Bố cục của luận án: Luận án gồm 184 trang có mở đầu, 4 phần, 9 chương, 33 bảng, 47 hình, 128 tài liệu tham khảo, 103 phụ lục. Trong đó, tổng quan 32 trang; thực nghiệm 15 trang; kết quả và thảo luận 60 trang; kết luận và kiến nghị 3 trang; các công trình công bố của tác giả, tài liệu tham khảo và phụ lục 74 trang. PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 1. Giới thiệu chung chitin/chitosan 1.1. Nguồn gốc chitin/chitosan Chitin trong thiên nhiên rất phổ biến và đa dạng, nhiều thứ hai sau celluloz, ước tính 100 tỉ tấn/năm. Chitin làm nhiệm vụ vỏ bảo vệ cơ thể cho các loài giáp xác. Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loại nấm đến vỏ tôm, vỏ cua, vỏ côn trùng, vỏ tế bào vi khuẩn, mai mực và cả da người. 3 Chitin tồn tại dưới ba dạng: -, -, và -chitin. Phổ biến nhất là -chitin vỏ tôm, cua và -chitin mai mực. 1.2. Cấu trúc của chitin/chitosan Hình 1.1. Cấu trúc của celluloz, chitin và chitosan 1.3. Tình hình nghiên cứu cắt mạch chitin/chitosan trên thế giới và trong nước 1.4. Tình hình sản xuất chitin/chitosan 1.5. Ứng dụng của chitin/chitosan 1.6. Ứng dụng của CTS có khối lượng phân tử thấp và oligochitosan Chương 2. Công nghệ bức xạ và hóa học bức xạ 2.1. Công nghệ bức xạ (CNBX) và ứng dụng 2.2. Hóa học bức xạ của nước và dung dịch nước Chương 3. Một số phương pháp biến tính cắt mạch chitosan 3.1. Cắt mạch bằng enzym Chitosan có thể bị cắt mạch bằng enzym tạo glucosamin hay oligoglucosamin. Các loại enzym khác nhau được sử dụng để cắt mạch như chitosanase, chitinase, cellulase, pectinase… 4 3.2. Cắt mạch bằng hóa học Trong số các tác nhân hóa học thì H 2 O 2 có nhiều ưu điểm khi cắt mạch CTS cho hiệu suất cắt mạch cao, không gây ô nhiễm môi trường do không cần phải loại bỏ tác nhân cắt mạch và không làm thay đổi độ deaxetyl. Cơ chế quá trình cắt mạch CTS bằng H 2 O 2 : H 2 O 2   H + + HOO - (3.1) HOO -  OH - + (O) (3.2) HOO - + H 2 O 2  HO . + O 2 + H 2 O (3.3) RH + HO .  R . + H 2 O (3.4) R .  R . 1 + R 2 (3.5) (RH: kí hiệu của CTS) 3.3. Cắt mạch bằng bức xạ Ershov và ccs (1987) đã đề nghị cơ chế cắt mạch của chitosan được chiếu xạ ở trạng thái vảy khô như sau: R-H  R . (C 4 -C 6 ) + H . (3.6) R-H + H .  R . (C 1 -C 6 ) + H 2 (3.7) R . (C 1 ,C 4 )  F 1 . + F 2 (cắt mạch) (3.8) Chiếu xạ phân ly nước chủ yếu sinh ra gốc OH . , e - aq và H . theo Ulan’ski. Trong môi trường axit cơ chế cắt mạch bức xạ có thể: H 2 O  H 2 O 2 , H 2 , OH . , H . , H + , OH - , e - aq , H 3 O + (3.9) e - aq + H +  H . (3.10) R-H + H .  R . (C 1 -C 6 ) + H 2 (3.11) R-H + OH .  R . (C 1 -C 6 ) + H 2 O (3.12) R . (C 1 ,C 4 )  F . 1 + F 2 (cắt mạch) (3.13) Trường hợp dung dịch chitosan có 1% H 2 O 2 , sẽ có thêm các phản ứng: H 2 O 2 h   2OH . (3.14) e - aq + H 2 O 2  OH . + OH - (3.15) H . + H 2 O 2  OH . + H 2 O (3.16) 5 PHẦN 2. THỰC NGHIỆM Chương 4. Thực nghiệm 4.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 4.1.1. Nguyên liệu, hóa chất - Nguyên liệu: Vỏ tôm, mai mực mềm, lúa giống OM1490, mía giống VN84-4137. - Hóa chất: Các hóa chất sử dụng đều ở dạng tinh khiết. 4.1.2. Thiết bị: SVST-Co-60/B, nhớt kế Otwald, sắc ký gel: HP-GPC 1100, phổ FT-IR được đo trên máy EQUINOX 55, phổ 1 H-NMR đo trên máy Bruker Avance 500mHz, giản đồ XRD đo trên máy XD-5A SHIMADZU, phổ UV-Vis được đo trên máy CARRY 50 CNC của hãng VARIAN, tủ sấy quạt gió, bình hút ẩm, máy li tâm. 4.2. Phương pháp thực nghiệm 4.2.1. Chế tạo các mẫu chitosan làm nguyên liệu đầu 4.2.1.6. Đo phổ FT-IR, 1 H-NMR, XRD và độ nhớt  M v được tính theo phương trình Mark-Houwink: [] = k  M v  (4.2) 4.2.1.7. Xác định độ deaxetyl (DD%)  Xác định DD% bằng phổ FT-IR DD% = 100 - (A 1320 /A 1420 - 0,3822)/0,03133 (4.3) Trong đó A 1320 và A 1420 lần lượt là mật độ quang tương ứng tại các đỉnh hấp thụ 1320 và 1420 cm -1 .  Xác định DD% bằng phổ 1 H-NMR DD% = [ I H1D /(I H1D + I HAc /3)] 100 (4.4) Trong đó I H1D và I HAc lần lượt là tích phân tương ứng tại các đỉnh proton H1D và 3 proton HAc. 4.2.2. Cắt mạch chitosan bằng dung dịch H 2 O 2 4.2.2.6. Tính toán các giá trị đánh giá cắt mạch từ các kết quả M v , M w , DD%  Hằng số tốc độ cắt mạch k (giờ -1 ) được tính theo phương trình: 6 (4.5) M o và M t : KLPT trung bình CTS đầu và sau t (giờ) oxi hoá hay chiếu xạ.  m: khối lượng trung bình một mắc xích CTS, tính từ phương trình: m = [(DD%161)+203(100-DD%)]/100 (4.6) 4.2.3. Chiếu xạ cắt mạch chitosan dạng vảy  Hiệu suất cắt mạch bức xạ (dạng vảy) G d (số liên kết bị đứt/100eV) được tính theo phương trình Charlesby và ccs (1960): 1/M v - 1/M v0 = G d  1,04  10 -7  D (4.7) M v0 và M v : KLPT trung bình nhớt CTS ban đầu và tại các liều xạ D (kGy). 4.2.4. Chế tạo oligochitosan  Hiệu suất cắt mạch bức xạ (dung dịch) G s được tính với đơn vị mol/J theo Wasikiewicz (2005) : 1/M w - 1/M w0 = G s  D  d  1000/2C (4.8) M w0 và M w : KLPT trung bình khối của CTS ban đầu và tại các liều xạ D (kGy), d- tỷ trọng dung dịch (g/cm 3 ), C- nồng độ dung dịch (g/lít). 4.2.4.8. Khảo sát hiệu ứng đồng vận.  Phần trăm suy giảm KLPT của CTS cắt mạch được xác định bằng công thức: %M = [(M w0 –M w )/M 0 ] 100 (4.9) 4.2.4.9. Xác định hàm lượng oligochitosan tan Oligochitosan tan (%) = (m 0 – m)  100/m 0 (4.10) m 0 và m: khối lượng CTS trong dung dịch chiếu xạ và CTS kết tủa tại pH 7. 4.2.5. Khảo nghiệm oligochitosan làm chất kích thích tăng trưởng và kháng bệnh trong nông nghiệp PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 5. Chế tạo các mẫu chitosan (CTS) làm nguyên liệu đầu 5.1. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình deaxetyl đến giá trị DD% và M v của các chitosan nguồn m kt MM t  0 11 (4.4) 7 Hình 5.1. Phổ FT-IR của CTS70 (a), CTS84 (b) và CTS94 (c) Kết quả xác định DD% từ FT-IR và M v của các CTS nguồn được trình bày ở bảng 5.1. Bảng 5.1. Ảnh hưởng quá trình deaxetyl đến DD% và M v của CTS nguồn STT Ký hiệu mẫu Quá trình deaxetyl DD% M v (Da) 1 2 3 4 5 CTS70 CTS84 CTS94 CTS70 CTS90 CT+NaOH 50%, t o phòng, 96giờ CT + NaOH 50%,110 o C, 2giờ CTS84 + NaOH 50%,110 o C, 2giờ CT + NaOH 30%, t o phòng, 48giờ CT + NaOH 50%, t o phòng, 6giờ 70,3 84,0 94,1 72,3 90,8 598.000 460.000 115.000 1.318.000 293.000 Bảng 5.1 cho thấy DD% của CTS tăng còn M v CTS giảm dần theo chiều tăng nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian deaxetyl. 5.2. Khảo sát cấu trúc của chitosan bằng phổ 1 H-NMR, FT-IR và XRD 8 Hình 5.2. Phổ 1 H-NMR của CTS84 Hình 5.3. Phổ 1 H-NMR của CTS90 9 DD% của CTS84, CTS90 tính từ phổ FT-IR, 1 H-NMR được trình bày ở bảng 5.2. Bảng 5.2. Kết quả tính giá trị DD% của CTS84 và CTS90 DD% của các CTS tính từ phổ FT-IR và 1 H-NMR với các giá trị thu được ở bảng 5.2 là 84,02% và 85,06% của CTS84; 90,81% và 91,16% của CTS90. Như vậy có thể sử dụng cả hai phương pháp để xác định DD%. Cấu trúc CTS70 được khảo sát bằng XRD thể hiện ở hình 5.4. 2 Theta (độ) Hình 5.4. Giản đồ XRD của CTS70 Kết quả khảo sát các giản đồ XRD của CTS70 (hình 5.4), CTS84 (phụ lục 66) và CTS94 (phụ lục 67) cho thấy ở các đỉnh tại 2 ~ 10 0 và 20 0 đều có cường độ mạnh chứng tỏ α-chitosan với DD 70 - 94% có cấu trúc tinh thể chiếm ưu thế. Chương 6. Cắt mạch chitosan (CTS) bằng dung dịch H 2 O 2 Ký hiệu mẫu FT-IR 1 H-NMR A 1320 /A 1420 DD% I H1D I HAc DD% CTS84 0,883 84,02 1,000 0,527 85,06 CTS90 0,670 90,81 1,000 0,291 91,16 10 6.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ H 2 O 2 đến cắt mạch chitosan Bảng 6.1. Ảnh hưởng nồng độ H 2 O 2 đến M v chitosan cắt mạch Nồng độ H 2 O 2 % M v (10 5 Da) CTS70 (6giờ) CTS84 ( 2giờ) CTS70 (16giờ) CTS90 ( 2giờ) 0 5,98 4,60 13,18 2,93 1,0 5,74 3,28 4,87 1,92 1,5 4,50 2,92 3,27 1,72 2,0 4,38 2,87 2,98 1,63 Bảng 6.1 khi nghiên cứu cắt mạch chitosan với H 2 O 2 từ 0- 2% trong môi trường dị thể đối với CTS70, CTS84, CTS70, CTS90 cho thấy khối lượng phân tử trung bình M v chitosan giảm dần theo chiều tăng nồng độ H 2 O 2 . Nồng độ H 2 O 2 1% và 1,5% là cắt mạch có hiệu quả tương ứng đối với CTS và CTS. 6.2. Cắt mạch CTS bằng H 2 O 2 trong môi trường dị thể 6.2.1. Khảo sát cấu trúc của các CTS cắt mạch bằng phổ FT-IR, 1 H-NMR và giản đồ XRD Bảng 6.2. Ảnh hưởng thời gian oxi hóa đến DD% của các CTS (Tính từ phổ FT-IR) Ký hiệu mẫu DD% theo thời gian t (giờ) 0 2 4 8 16 αCTS70 70,3 - 69,9 70,0 70,0 αCTS84 84,0 - - - 85,0 βCTS90 90,8 89,9 91,5 91,3 - Đối với cắt mạch CTS nguồn dạng  (DD 70 - 84%) cũng như dạng  (DD 90,8%) bằng H 2 O 2 , các sản phẩm cắt mạch theo thời gian oxi hóa thu được có DD% đều thay đổi rất ít so với CTS tương ứng ban đầu. [...]... suất cắt mạch bức xạ dạng vảy Gd: 0,38 và 1,36; 1,76 và 7,31 liên kết/100eV lần lượt của CTS70 và CTS70-OX; CTS90 và CTS90-OX  Hằng số tốc độ cắt mạch chiếu xạ kcx và hiệu suất cắt mạch Gd tăng khi DD% tăng, kcx và Gd của CTS-OX lớn hơn CTS ban đầu, chứng tỏ CTS 15 có DD% cao và CTS-OX dễ bị cắt mạch bằng bức xạ; kcx và Gd của CTS lớn hơn CTS Như vậy trong trường hợp cắt mạch bức xạ thì  -chitosan. .. Quốc Hiến (2006), Nghiên cứu giảm cấp chitosan bằng hydroperoxit kết hợp với bức xạ gamma Co-60”, Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, 52(4), tr 29-32 2 Bùi Phước Phúc, Nguyễn Triệu, Hà Thúc Huy, Nguyễn Ngọc Duy, Đặng Văn Phú, Nguyễn Quốc Hiến (2006), Nghiên cứu chế tạo oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan , Tạp chí Hóa học và Ứng dụng, 57(9), tr 38-41 3 Bùi Phước Phúc, Hà Thúc Huy,... hiệu ứng đồng vận khi cắt mạch kết hợp oxi hóa - chiếu xạ ở cả 2 dạng  và  -chitosan Đối với C70 hiệu ứng đồng vận là 6,62% ở 16 kGy (tương ứng với 12 giờ chiếu xạ) , còn C70 là 58,36% ở 4 kGy (tương ứng với 3 giờ chiếu xạ) Như vậy hiệu ứng đồng vận chính là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng cắt mạch kết hợp dung dịch oxi hóa -chiếu xạ để chế tạo oligochitosan Tuy nhiên khi tăng liều xạ. .. hiệu ứng cắt mạch chitosan dạng vảy có DD 70 - 94% với Mv0 tương ứng 1.318.000 - 293.000 Da bằng H2O2 đã chế tạo được các chitosan có KLPT thấp Đã xác định được hằng số tốc độ cắt mạch oxi hóa tăng theo chiều tăng của độ deaxetyl và theo chiều giảm của KLPT 2 Khảo sát hiệu ứng cắt mạch chitosan dạng vảy bằng bức xạ gamma-Co 60 cho thấy chitosan được cắt mạch bằng H2O2 trước có hằng số tốc độ và hiệu... Gs thu được từ chiếu xạ dung dịch CTS tương ứng C70 Kiểu cắt mạch C70 4kGy Gs (10-7 mol/J) 12kGy 16kGy 16kGy Chiếu xạ 0,760 1,477 1,889 0,519 Chiếu xạ + 26,003 22,899 22,465 4,963 1%H2O2 Bảng 8.2 cho thấy khi xử lý cắt mạch dung dịch CTS bằng chiếu xạ có sự hiện diện của H2O2 nhận được giá trị Gs cao hơn so với giá trị Gs chỉ xử lý bằng chiếu xạ 8.2 Khảo sát một số đặc tính của oligochitosan 18 Kết... 72,3 mẫu CTS70 CTS70-OX- 73,3 DD% 24kGy 72,4 Khi nghiên cứu cắt mạch  -chitosan cũng cho kết quả tương tự như trường hợp  -chitosan, DD% thay đổi rất nhỏ so với CTS ban đầu Như vậy cắt mạch bằng chiếu xạ và chiếu xạ kết hợp oxi hóa trước về cơ bản không làm thay đổi cấu trúc sườn của CTS Chương 8 Chế tạo oligochitosan 8.1 Khảo sát động học chiếu xạ cắt mạch CTS dạng dung dịch 140 αC70-0%H2O2 αC70-1%H2O2... cắt mạch kết hợp oxi hóa - chiếu xạ dung dịch đã tạo ra oligochitosan có cấu trúc vô định hình 8.3 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch dung dịch CTS có 1% H2O2 bằng chiếu xạ 19 Bảng 8.5 Phần trăm suy giảm Mw của CTS cắt mạch (%Mw) C70 Ký hiệu C70 4kGy 16kGy 16kGy (3giờ) (12giờ) (12giờ) a 10,38 23,50 33,83 b Chiếu xạ 21,75 73,44 50,12 c %Mw Oxi hóa Oxi hóa+ 90,49 97,05 90,57 58,36 0,11 6,62 Chiếu xạ %Hiệu ứng. .. CTS70 và CTS70OX; CTS84 và CTS84-OX; CTS94 và CTS94-OX  Các giá trị hiệu suất cắt mạch bức xạ dạng vảy Gd: 0,20 và 0,96; 1,03 và 5,73; 1,69 và 6,37 liên kết/100eV lần lượt của CTS70 và CTS70OX; CTS84 và CTS84-OX; CTS94 và CTS94-OX  kcx đối với CTS: 0,92  10-5 và 3,25  10-5; 4,02  10-5 và 16,69  10-5 giờ-1 lần lượt của CTS70 và CTS70-OX; CTS90 và CTS90-OX  Các giá trị hiệu suất cắt. .. diễn ra trong suốt quá trình cắt mạch DD% thay đổi không đáng kể (DD% của C70 và C70 oxi hóa tương ứng là 70,41 và 70,38%) Chương 7 Chiếu xạ cắt mạch chitosan dạng vảy Mv x 10 5 7.1 Khảo sát động học chiếu xạ cắt mạch CTS dạng vảy 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 CTS70 CTS84 CTS94 0 10 20 30 40 50 LiÒu x¹, kGy Hình 7.1 Sự phụ thuộc Mv của CTS theo liều xạ Hình 7.1 cho thấy khi không oxi hóa trước bằng H2O2,... suất cắt mạch cao hơn so với chitosan ban đầu khoảng 4,0 - 5,6 lần Độ deaxetyl càng cao thì hằng số tốc độ và hiệu suất cắt mạch bức xạ càng lớn 22 3 Khảo sát hiệu ứng đồng vận bức xạ gamma-Co 60/1% H2O2 cắt mạch dung dịch chitosan đã xác định được hiệu suất cắt mạch bức xạ dung dịch có sự hiện diện của H2O2 cao hơn so với khi không có H2O2 Đã giảm liều xạ xuống khoảng 5 lần (từ 48kGy xuống 16kGy) để . tiêu, tính khoa học và thực tiễn của đề tài Dựa vào những cơ sở trên, mục tiêu của luận án đặt ra là nghiên cứu biến tính cắt mạch chitosan bằng hydroperoxit và kỹ thuật chiếu xạ để ứng dụng trong. α -chitosan và β -chitosan bằng H 2 O 2 . 3. Cắt mạch α -chitosan và β -chitosan bằng chiếu xạ gamma Co-60. 4. Cắt mạch chitosan bằng H 2 O 2 kết hợp với chiếu xạ gamma Co-60. ● Cắt mạch α -chitosan. chitin và chitosan 1.3. Tình hình nghiên cứu cắt mạch chitin /chitosan trên thế giới và trong nước 1.4. Tình hình sản xuất chitin /chitosan 1.5. Ứng dụng của chitin /chitosan 1.6. Ứng dụng của