nghiên cứu bổ sung chitosan oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang cao sản nhật bản

Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm sau 40 ngày nuôi cấy ...64 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt thân cây khoai lan

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

TÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU BỔ SUNG CHITOSAN OLIGOMER TRONG NUÔI CẤY MÔ KHOAI

LANG CAO SẢN NHẬT BẢN

(IPOMOEA BATATAS L.)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN ANH DŨNG

Buôn Ma Thuột, năm 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan: ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các

số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực, ñược các ñồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng ñược công bố trong bất kỳ một công trình nào khác

HỌC VIÊN

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM ƠN!

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn:

Người thầy hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng ñã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

TS Phan Văn Tân ñã tạo ñiều kiện thuận lợi và chỉ bảo cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn tại bộ môn sinh học thực vật

ThS Nguyễn Đình Sỹ ñã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tất cả các thầy cô giáo Khoa Sau ñại học, Khoa KHKT&CN Trường Đại học Tây Nguyên

Ban Giám Hiệu, toàn thể các anh chị và các bạn ñồng nghiệp Trường THCS Đoàn Kết ñã luôn tạo ñiều kiện thuận lợi và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian công tác và học tập

Tất cả các anh, chị và các bạn trong lớp cao học Sinh học thực nghiệm khóa 1 ñã luôn ñộng viên và giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Chị Tuyến, em Ngọc, em Bình ở Bộ môn Sinh học thực vật ñã tạo ñiều kiện thuận lợi, ñộng viên và nhiệt tình giúp ñỡ cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài này

Cuối cùng xin gửi lòng biết ơn ñến tất cả những người thân trong gia ñình ñã luôn ở bên cạnh ñộng viên và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi nhất ñể tôi học tập và làm việc trong suốt thời gian qua

Xin chân thành cảm ơn!

NGUYỄN THỊ TRƯƠNG HUYỀN

MỤC LỤC

Trang

Các chữ viết tắt i

Danh mục ảnh ii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về cây khoai lang .3

1.1.1 Đặc ñiểm sinh học 3

1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang 7

1.1.3 Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang .8

1.1.4Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang .9

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô 14

1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .15

1.2.4 Các bước nhân giống invitro 15

1.2.5 Khử trùng mẫu nuôi cấy .15

1.2.6 Mẫu cấy .17

1.2.7 Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật .18

1.2.8 Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật 19

1.3 Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 25

1.4 Sự phát sinh hình thái .26

1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam .28

1.6 Tổng quan về Chitosan .29

1.6.1 Công thức cấu tạo 29

1.6.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chitosan 31

CHƯƠNG 2 : NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.1 Nội dung nghiên cứu 40

2.2 Phương pháp nghiên cứu 40

2.2.1 Vật liệu, hóa chất 40

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 41

2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của mô nuôi cấy 41

2.2.2.2 Nghiên cứu thành phần môi trường ñến sự hình thành protocorm 44

2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt thân khoai lang in vitro 46

2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ và loại chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật lên sự tạo rễ và tăng trưởng chồi cây khoai lang in vitro 48

2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô 50

2.2.2.6 Xử lý số liệu thống kê 52

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 Ảnh hưởng của các hóa chất khử trùng ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 53

3.1.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 53

3.1.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ

khoai lang 57

3.1.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang 69

3.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm .62

3.3 Ảnh hưởng của nồng ñộ, tỷ lệ chất kích thích sinh trưởng ñến hình thành chồi và rễ cây con trong in vitro 65

3.3.1 Ảnh hưởng của N6 - benzyladenine (BA) và Kinetin ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành chồi và tăng trưởng chồi cây khoai lang 65

3.3.2 Ảnh hưởng của NAA và IBA ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau ñến sự hình thành rễ cây khoai lang 69

3.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng và khả năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô 75

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81

KẾT LUẬN 81

ĐỀ NGHỊ 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82 PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 55 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 59 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm thu nhận từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 61 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường ñến hình thành protocorm sau 40 ngày nuôi cấy 64 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và Kinetin lên sự bật chồi và tăng trưởng chồi từ ñốt thân cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 67 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 72

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy 77

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin 19

Hình 1.2 Cấu trúc của auxin tự nhiên và auxin tổng hợp 19

Hình1 3 Cấu trúc của một số dạng cytokinin .20

Hình 1.4 Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển ñổi GA4 thành các GA khác 21

Hình 1.5 Cấu trúc của ABA .22

Hình 1.6 Cấu trúc của ethylen 22

Hình 1.7 Cấu trúc của TDZ 23

Hình 1.8 Chitin (có 4-10 nghìn gốc N-acetyl-glucosamine) 31

Hình 1.9 Chitosan (có 1-4 nghìn gốc glucosamine) 31

Hình 1.10 Olygoglucosamine (có 2- vài chục gốc glucosamine) 31

Hình 1.11 Cơ chế hoạt ñộng của Chitosan 39

Hình 3.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng HgCl2 ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy ở các nồng ñộ 0.1% (A), 0.3% (B), 0.5% (C) 56

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng Natri hypochloride ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 60

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chất khử trùng hydro peroxyde ở các nồng ñộ và thời gian khác nhau ñến sức sống của chồi mầm từ củ khoai lang sau 3 tuần nuôi cấy 62

Hình 3.4 Số lá của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68

Hình 3.5 Chiều cao chồi của cây khoai lang khi BA và Kinetin thay ñổi ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 68 Hình 3.6 Chiều cao chồi của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các nồng ñộ và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 72

Hình 3.7 Số rễ của cây khoai lang khi IBA và NAA thay ñổi ở các nồng ñộ

và tỷ lệ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 73 Hình 3.8 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên chiều cao chồi, số rễ và chiều dài

rễ từ chồi cây khoai lang in vitro sau 30 ngày nuôi cấy 73 Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến chiều cao chồi của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày 78 Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến khối lượng chồi tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày .78

MỞ ĐẦU

Khoai lang (Ipomoea batatas L (Lam) là cây lương thực quan trọng ñược

trồng ở nhiều nước Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ la tinh Khoai lang không

những chỉ có công dụng làm lương thực cho người, thức ăn cho gia súc mà

còn là sản phẩm của các mặt hàng công nghiệp thực phẩm Người ta có thể

chế biến rượu, cồn, xiro từ khoai lang Tinh bột khoai lang còn dùng trong

công nghiệp giấy và hồ sợi Một số nước trên thế giới dùng khoai lang chế

biến axit xitoric, dextrin, lấy tinh bột dùng trong y học Khoai lang chứa nhiều

men amilaza biến tinh bột thành ñường mạch nha nên là nguồn nguyên liệu

tốt cho công nghiệp sản xuất loại men này

Theo thống kê 2006 của Sở Nông Nghiệp – PTNT Đăk Nông và Đăk

Lăk, khoai lang cao sản xuất khẩu ñang phát triển mạnh với diện tích ở tỉnh

Đăk Nông là 4500 ha, Đăk Lăk là trên 3000 ha Trong thời kỳ ñầu, năng suất

khoai lang ñạt từ 20-25 tấn/ha, giá bán cho suất khẩu là 5 triệu ñồng /tấn, ñem

lại thu nhập cao cho nông dân Tuy nhiên, sau 5 năm phát triển năng suất

khoai lang suy giảm gần 40-50%, chỉ còn 12-15 tấn/ha, làm giảm thu nhập

của người nông dân và sản suất không bền vững cả về kinh tế và môi trường

Chitosan và chitosan oligomer là các chất hoạt hóa một số gen thực vật,

bằng cách tác ñộng trên promoter của trên 20 gen hệ thống ñề kháng của thực

vật ñể tăng cường tổng hợp enzyme chitanase, β- 1,3-glucanase, RNAse,

proteinase inhibitor, tăng cường tổng hợp lignin và kháng sinh thực vật

phytoalexin Chính vì vậy, Chitosan và chitosan oligomer làm tăng sức ñề

kháng của cây với các tác nhân gây bệnh như nấm, vi khuẩn và virus [41] Chitosan và chitosan oligomer làm tăng khả năng kháng bệnh rỉ sắt

(Phakopspora foiae) của ñậu tương (N.A Dung, 2002) [30] Suwalee (2002)

công bố phun chitosan cho ngô với nồng ñộ 100 ppm có khả năng hạn chế

70% bệnh bạc lá[64] Ngoài ra còn nhiều công bố khẳng ñịnh khả năng kháng

nấm bệnh của chitosan ñối với thực vật, như kháng nấm pythium, Sclerotium,

Fusarium (Hirano, 1996 ; N.A Dung, 2004, R.D Park, 2002)

Chitosan oligomer còn ñược coi là nhóm ñiều hòa sinh trưởng thực vật thế

hệ mới [68] Chitosan oligomer có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng hàm

lượng diệp lục, tăng số lượng nốt sần cố ñịnh ñạm và tăng năng suất của lạc

[33] Chitosan oligomer làm tăng cường ñộ quang hợp của lúa, lạc trong thủy

canh [42] Chitosan oligomer làm tăng chiều dài rễ, kích thước cây con trong

nuôi cấy mô [50]

Với mục ñích ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phát triển nông

nghiệp bền vững, vừa tăng năng suất cây trồng, giống không bị thoái hoá,

không sâu bệnh, giảm tỷ lệ nhiễm trong nuôi cấy mô Chúng tôi ñề suất

nghiên cứu ñề tài: ‘‘Nghiên cứu bổ sung Chitosan oligomer trong nuôi cấy

mô khoai lang cao sản Nhật Bản (Ipomoea batatas L.).’’

Mục tiêu của ñề tài :

• Xây dựng quy trình nhân giống khoai lang cao sản bằng công nghệ

nuôi cấy mô tế bào trong invitro

• Đánh giá hoạt tính kích thích tăng trưởng khi bổ sung chitosan

oligomer trong nuôi cấy mô khoai lang

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cây khoai lang

Chi (genu): Ipomoea

Loài (species): Ipomoea batatas L.

Khoai lang trên thế giới chủ yếu ñược phân bố ở các vùng nhiệt ñới,

á nhiệt ñới châu Á, châu Phi và châu Mỹ la tinh Có nguồn gốc từ khu vực nhiệt ñới Châu Mỹ, ñược con người trồng cách ñây khoảng 5000 năm Nó ñược phổ biến rất sớm trong khu vực này, bao gồm cả khu vực Cariber, ñã ñược biết tới trước khi có sự thám hiểm của người phương tây tới Polinesia Ngày nay khoai lang ñược trồng khắp trong các khu vực nhiệt ñới và ôn ñới

ẩm với lượng nước ñủ ñể hỗ trợ sự phát triển của cây Nước ta nằm trong khu vực nhiệt ñới gió mùa, nóng, ẩm, nhiệt ñộ cao, mưa nhiều, lượng mưa phân

bố tương ñối ñều nên rất thuận lợi cho cây khoai lang sinh trưởng và phát triển, do ñó có thể trồng quanh năm

Khoai lang (Ipomoea batatas) là một loài cây nông nghiệp với rễ củ

lớn, chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, ñược gọi là củ khoai lang và nó là một nguồn cung cấp rau củ quan trọng, ñược sử dụng trong vai trò của cả rau lẫn lương thực Các lá non và thân non ñược sử dụng như cũng ñược sử dụng như

một loại rau Khoai lang có họ hàng xa với khoai tây (Solanum tuberosum) có

nguồn gốc Nam Mỹ

Là cây thân thảo dạng dây leo sống lâu năm, có các lá mọc so le hình

trái tim hay lá xẻ thùy hình chân vịt, các hoa có tràng hợp và kích thước trung

bình Rễ củ ăn ñược, hình dạng thuôn dài và thon, lớp vỏ nhẵn nhụi có màu

ñỏ, tía, nâu hay trắng, bên trong củ có màu vàng, trắng, cam, hay tím Khoai lang có khối lượng ñường bột (cacbonhydrat), vitamin A và năng

lượng cao hơn so với lúa mì, lúa nước, sắn Khoai lang ñược sử dụng củ và lá

ñể làm thức ăn gia súc, chế biến bột, rượu cồn, bánh kẹo và gần ñây ñang

ñược nghiên cứu ñể làm màng phủ sinh học ( bioplastic)

Do ñặc ñiểm tính ña dạng của giống khoai lang, hơn nữa trong quá

trình trồng trọt do chọn lọc tự nhiên, chọn lọc nhân tạo nên ñã hình thành

nhiều loại hình, nhiều giống khác nhau

Khoai lang không chịu ñược sương giá, phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ

trung bình khoảng 24 °C (75 °F) Khoai lang ít khi ra hoa nếu khoảng thời

gian ban ngày vượt quá 11 giờ Chúng ñược nhân giống chủ yếu bằng các

ñoạn thân (dây khoai lang) hay rễ hoặc bằng các rễ bất ñịnh mọc ra từ các rễ

củ trong khi lưu giữ bảo quản Trong các ñiều kiện tối ưu với 85-90 % ñộ ẩm

tương ñối ở 13-16 °C (55-61 °F), củ khoai lang có thể giữ ñược trong vòng 6

tháng Nhiệt ñộ thấp hoặc cao hơn ñều nhanh chóng làm hỏng củ

Khoai lang phát triển tốt trong nhiều ñiều kiện về ñất, nước và phân bón

Nó cũng có rất ít kẻ thù tự nhiên nên thuốc trừ dịch hại là ít khi phải dùng tới

Do nó ñược nhân giống bằng các ñoạn thân nên khoai lang là tương ñối dễ

trồng Do thân phát triển nhanh che lấp và kìm hãm sự phát triển của cỏ dại

nên việc diệt trừ cỏ cũng tiêu tốn ít thời gian hơn Trong khu vực nhiệt ñới,

khoai lang có thể ñể ở ngoài ñồng và thu hoạch khi cần thiết còn tại khu vực

ôn ñới thì nó thường ñược thu hoạch trước khi sương giá bắt ñầu Khoai lang

có khả năng thích ứng với nhiều loại ñất khác nhau, nhưng sinh trưởng tốt nhất trên các loại ñất thoáng khí như ñất thịt nhẹ và ñất pha cát Thời gian sinh trưởng của cây khoai lang ngắn ngày nhưng lại cho năng suất cao, do ñó cần phải bón nhiều phân và ñủ dạng cần thiết Vì vậy, nói chung ñiều kiện khí hậu, thời tiết ở nước ta cho phép trồng khoai lang quanh năm, nhưng cũng cần lưu ý tới những ñặc ñiểm riêng của từng vùng khí hậu khác nhau ñể bố trí thời vụ cho thích hợp

Ảnh 1.1 Cánh ñồng trồng khoai lang

Ảnh 1.2 Củ khoai lang cao sản Nhật Bản (Benniazuma)

1.1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất cây khoai lang

+ Kỹ thuật nhân giống thông thường:

Khoai lang ñược nhân giống vô tính bằng chồi củ giống và hom giống

của dây sau khi thu hoạch củ từ vụ trước Ngoài các yếu tố về ñất ñai, thời vụ,

phân bón, kỹ thuật canh tác, ñặc ñiểm giống thì ñộ dài và chất lượng hom

giống và cách trồng ảnh hưởng rất lớn ñến năng suất củ

Ở Malaysia, người ta trồng hom 6 mắt với ñộ sâu 2 mắt

Ở Georgia thường trồng hom khoai lang dài 30 – 40cm với 2 – 3 mắt

dưới ñất cho năng suất cao hơn hom giống ngắn 20 – 25cm

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau Châu Á (AVRDC) khuyến cáo

trồng hom giống dài 30cm với 3 mắt dưới ñất

Ở Trung Quốc, hom giống 7 mắt ñược sử dụng phổ biến trong sản

xuất

Ở Việt Nam, phần lớn các qui trình hướng dẫn ñều cho rằng: hom

giống cắt dài 25 – 30cm ở ñoạn 1 và ñoạn 2 của những dây mập mạnh không

sâu bệnh Trồng nông nối liền theo chiều dọc luống, mỗi mét dài trồng 5 hom

với khoảng cách từ 18 – 22cm, lấp ñất sâu 5 – 6cm Công ty thực phẩm Đà Lạt – Nhật Bản (DJF), ñơn vị trực tiếp nhập

giống và thu mua khoai lang nhật ñã hướng dẫn cách trồng khoai lang nhật

như sau: trồng cây cách cây 25cm, hàng cách hàng 1m, mật ñộ 25000 cây/ha

Hom ñược cắt xong ñem về rãi nơi thoáng mát từ 1 ñến 2 ngày trước khi

trồng sẽ giúp hom nhanh ra rễ, nảy chồi hơn

Theo kinh nghiệm trồng khoai lang giống Nhật Bản ở xã Đăc Bup So,

huyện Tuy Đức, tỉnh ĐăkNông thì trước hết là cách ñặt giống, bao giờ cũng

lấp ñất phủ hết, chỉ ñể ngọn nhô lên 3 -5cm, nếu ñể ngọn nhô lên quá cao thì

hom dễ bị táp nắng và dễ bị sâu ñục thân dẫn ñến suy dinh dưỡng

Tuy nhiên, phương pháp này tốn công, vườn ươm lớn và phụ thuộc vào

ñiều kiện bảo quản, cây thiếu sức ñề kháng với virus gây bệnh Vì vậy ñể sản

xuất ra khối lượng lớn cây giống sạch bệnh có thể mong chờ ở nuôi cấy mô

Trên thế giới và trong nước ñã có những báo cáo về nghiên cứu tái sinh cây

khoai lang in vitro qua con ñường phát sinh phôi soma và con ñường phát

sinh cơ quan

1.1.3 Nghiên cứu ngoài nước về cây khoai lang

Để tạo giống cho năng suất cao, phẩm chất tốt, sạch bệnh, trên thế giới

ñã nghiên cứu nhân giống khoai lang bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Tuy nhiên

những nghiên cứu về nuôi cấy mô khoai lang trên thế giới còn rất hạn chế

Hwang, Robert (1983) nghiên cứu nuôi cấy mô khoai lang bằng kỹ

thuật nuôi cấy mô rễ sử dụng môi trường MS với nồng ñộ khoáng và inositol

cao Sử dụng chóp ngọn, chồi nách, mẩu lá hoặc mẩu cuống lá non Được

ñem khử trùng bề mặt bằng Clorox 10% (0,52% NaOCl), rửa nhẹ 2 lần với

nước cất [49] Kuo, Shen (1985) nghiên cứu nhân giống khoai lang sạch virus sử

dụng mô lá và ñỉnh sinh trưởng Mẫu mô nuôi cấy ñược kiểm tra virus bằng

kỹ thuật ELISA[24]

Daniel (1993) ñã xây dựng hệ thống nhân giống cho những loài có sinh

khối lớn như cây khoai lang bằng phương pháp tạo phôi soma từ ñỉnh ngọn

1-2 lá mầm trên môi trường có bổ sung 1-2,4D cho thấy sự hình thành phôi khi

cấy chuyền phôi calli hoặc khối tế bào sang môi trường có 2,4 D mới và phôi

có lá mầm có khả năng hình thành cây mới [28]

Makoto (1993) ñã nghiên cứu sự hình thành củ khoai lang in vitro từ

mô rễ cây khoai lang in vitro Sau 6-7 nuôi cấy ñường kính của rễ lớn nhất

lớn hơn 2mm dưới tác dụng của chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật JA trong

môi trường ñặc và BA trong môi trường lỏng, phần rễ phình to ra có màu ñỏ, màu tự nhiên của cây trồng này[53]

Podobo (1995) nghiên cứu nhân giống khoai lang từ lá theo quy trình gồm 2 bước: nuôi cấy mô lá trên môi trường MS và sau ñó chuyển sang môi trường MS bổ sung zeatin riboside Kết quả cho thấy rằng mô lá của các giống khoai lang ñược cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,2mg/l-1 2,4 D thì

có 19/27 giống có biểu hiện sự tái sinh chồi, 8 giống không có phản ứng Trong ñó, giống có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là PI 318846-3 (78,6%) và khi chuyển sang môi trường MS bổ sung 0.2mg/l-1 zeatin riboside thì giống này cũng có tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất (33,3%).[20]

Isabirye (2007) nghiên cứu sự thoái hóa của ñất trồng sắn và khoai lang

ở những khu vực nghèo, ñầu tư thấp ở Uganda Các tác giả ước tính lượng dinh dưỡng mất ñi cho 1 ha khoai lang là 45 kg N/ha/năm, 8 kg P/ha/năm và

55 kg K/ha/năm[51] Ankumah (2003) nghiên cứu hiệu quả của bón N ñến năng suất và hiệu quả sử dụng N của 4 giống khoai lang [37] Ở Việt Nam, Viện cây lương thực ñưa ra qui trình thâm canh các giống khoai lang cao sản

là 20 tấn phân hữu cơ, 120 kg N, 900 kg super lân, 450 kg Kali[58]

1.1.4 Nghiên cứu trong nước về cây khoai lang

Khoai lang là cây lương thực ngắn ngày quan trọng của Việt Nam,

là cây trồng lấy củ có thời gian sinh trưởng ngắn khoảng 90 – 110 ngày, chịu hạn, chịu ñất xấu, ñầu tư thấp, ít chăm sóc, ít sâu bệnh, nên ñược nông dân ưa trồng Với các giống cao sản, thâm canh chăm sóc tốt, khoai lang có thể cho năng suất cao 20 – 25 tấn/ha và tiềm năng năng suất của khoai lang có thể ñạt

40 – 50 tấn/ha Vì vậy cây khoai lang là cây xóa ñói giảm nghèo cho nhiều nông dân ở nhiều ñịa phương, trong ñó có Tây Nguyên trong những năm gần ñây

Theo thống kê của FAO (2007) của Việt Nam năm 2005 là 205.000 ha

với năng suất là 7,56 tấn/ha và sản lượng ñạt trên 1,5 tấn Theo ñánh giá của

FAO, năng suất trung bình khoai lang của nước ta khá thấp bởi nhiều nguyên

nhân [39]:

- Do chưa có cơ cấu giống khoai lang tốt, có năng suất cao, chịu thâm canh và

phù hợp với từng vùng

- Giống sau nhiều năm trồng bị thoái hóa

- Nông dân có tâm lý trồng khoai không ñầu tư thâm canh

Đăk Nông là tỉnh ñi ñầu trong trồng và xuất khẩu khoai lang cao sản

Nhật Bản Từ năm 2004, Sau khi giống khoai lang nhật bản (Benniazuma)

ñược du nhập vào ñịa bàn tỉnh Đăk Nông ñến nay, diện tích gieo trồng khoai

lang của tỉnh Đăk Nông ngày càng ñược mở rộng Tổng diện tích khoai lang

năm 2004 là 1,917 ha, sản lượng 9,251 tấn, năm 2005 là 2,333 ha, sản lượng

21,668 tấn (khoai lang Nhật Bản Benniazuma chiếm 80% diện tích và sản

lượng).

Năm 2006 ước thực hiện ñược 4.138 ha, sản lượng 42,795 tấn Trong

ñó tập trung chủ yếu ở các huyện (huyện Đăk Song diện tích: 2,933 ha, sản

lượng: 30,994 tấn; huyện Đăk R’Lấp diện tích: 706 ha, sản lượng: 7,296 tấn;

huyệnKrông Nô diện tích: 127 ha, sản lượng: 1,365 tấn) khoai lang nhật bản

Benniazuma chiếm 95% diện tích và sản lượng

Khác với cây khoai lang truyền thống, sản phẩm chỉ phục vụ nhu cầu

nội ñịa và làm thức ăn gia súc Cây khoai lang Nhật Bản (Benniazuma) là cây

hàng hóa ñem lại hiệu quả kinh tế cao Nếu ñầu tư thâm canh trên một ñơn vị

diện tích có thể ñạt ñược (vụ hè thu: 32.000.000ñ/ha; vụ thu ñông:

30.000.000ñ/ha và vụ ñông xuân có tưới nước: 45.000.000ñ/ha)

Định hướng phát triển diện tích, sản lượng cây khoai lang của Đak Nông

Sản lượng (tấn) 43.000 46.000 48.000 50.000

Trong những năm gần ñây, Viện Cây lương thực, Viện Khoa học Nông

nghiệp Việt Nam lai tạo một số giống khoai lang có năng suất cao như KB1,

KB4 và TV1, năng suất có thể ñạt từ 20 – 25 tấn/ha Tuy nhiên nông dân

thường tự ñể giống bằng dây hoặc củ trong nhiều năm liền, giống bị thoái hóa

và tích lũy nhiều bệnh cho vụ sau Do ñó, giống tốt, sạch bệnh là yếu tố quyết

ñịnh ñể cho năng suất cao, phẩm chất tốt và hiệu quả canh tác khoai lang Nguyễn Du Sanh, Nguyễn Thanh Dũng(2004) ñã nghiên cứu các thay ñổi

về cấu trúc và sinh lý trong quá trình tạo củ ở cây khoai lang từ các ñoạn thân

dài 30 – 40cm trên hai giống trồng Hưng Lộc (HL4) và giống ñịa phương

(Gạo) làm cơ sở cho việc tăng năng suất của các cây trồng lấy củ [13].

Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang Thạch

(2004) ñã xây dựng ñược qui trình tái sinh in vitro một số giống khoai lang

Việt Nam ( giống Chiêm Dâu, Nông nghiệp 31 và Lim)[2]

Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển (2005) ñã nghiên cứu tái sinh in

vitro các giống khoai lang Keganesengan, Kokei 14 và Satsuma Hikari từ

mô lá qua kiểu tái sinh chồi bất ñịnh và tái sinh theo con ñường sinh phôi

soma qua nuôi cấy tạo mô sẹo từ ñỉnh sinh trưởng Khoảng 1 tuần ñến 1 tháng

thấy một số chồi tái sinh từ mô sẹo, xuất hiện thường ở vùng gân chính vị trí

gốc lá Ngoài ra, tác giả còn nhận thấy hệ rễ trên môi trường MS không chất

sinh trưởng sau 3 ñến 4 tuần nuôi cấy ñã tái sinh chồi trên một số rễ to, ñôi

khi hình thành từ rễ nhỏ [5]

1.2 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Tế bào thực vật có tính toàn thế (totipotency), tế bào ñơn hoặc protoplast

thực vật ñều có khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là ñiều kiện quan trọng

ñể ứng dụng trong nuôi cấy mô thực vật Sự phát sinh hình thái

(morphogenesis) hoặc khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào, một

cụm tế bào (mô sẹo), một mảnh lá, ñã ñược thực hiện trên hàng trăm loài thực

vật, hầu hết tập trung vào các cây trồng quan trọng.

Ý tưởng nuôi cấy mô của sinh vật ra ngoài cơ thể, trong ống nghiệm (in

vitro) ñã ñược Haberlandt thử nghiệm từ năm 1902 nhưng do ông ñã sử dụng

các tế bào của cây một lá mầm nên ñã thất bại Năm 1919, A Carrel nuôi cấy

thành công mô ñộng vật, nhưng cho ñến năm 1934 mô thực vật mới ñược

nuôi cấy

Năm 1934, White ñã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn

của các tế bào rễ cà chua ñược nuôi cấy mô.

Năm 1941, Van Overbeck ñã chứng minh tác dụng tốt của nước dừa trong

nuôi cấy phôi cây họ cà Sau ñó Steward và Milles (1952) cũng xác nhận tầm

quan trọng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo và phát sinh phôi ở cà rốt

Năm 1951, Skoog và Miler phát hiện ra các hợp chất có khả năng ñiều

khiển sự nhân chồi.

Năm 1954, Skoog phát hiện chế phẩm thủy phân của tinh dịch cá bẹ có tác

dụng kích thích sinh trưởng rất rõ rệt trong nuôi cấy các mảnh mô thân cây

thuốc lá

Năm 1957, Skoog và Miller ñã chứng minh sự biệt hóa của rễ, chồi trong

nghiên cứu nuôi cấy mô tủy thuốc lá phụ thuộc vào nồng ñộ tương ñối của

auxin/cytokinin và từ ñó ñưa ra quan niệm ñiều khiển hoocmon trong quá

trình hình thành cơ quan ở thực vật.

Năm 1962, Murashige và Skoog ñã thành công trong việc cải tiến môi

trường nuôi cấy, ñánh dấu một bước tiến quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy

mô Môi trường của họ ñã ñược dùng làm môi trường cơ bản cho việc nuôi

cấy nhiều loại cây và cho ñến nay vẫn còn ñược sử dụng rộng rãi.

Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi

cấy ñỉnh sinh trưởng và lan là cây nuôi cấy mô ñầu tiên ñược thương mại hóa

Từ ñó ñến nay nhiều loại cây khác nhau ñã ñược nuôi cấy thành công và

ñưa vào thương mại hóa.

Năm 1964, Ball là người ñầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi

ngọn Ông ñã thành công trong việc chuyển mô nuôi cấy thành cây con ở cây

sen cạn và cây White lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu.

Năm 1966, Guha và cộng sự ñã tạo ñược cây ñơn bội từ nuôi cấy túi phấn

của cây cà ñộc dược (Datura inoxia).

Năm 1978, Melchers và cộng sự ñã lai tạo thành công protoplast của cà

chua với protoplast của khoai tây, mở ra một triển vọng mới trong lai xa ở

thực vật Tuy nhiên, việc nhân giống cây in vitro vẫn chưa hoàn thiện Sau ñó,

nhiều nhà nghiên cứu ñã khám phá ra những thành phần quan trọng, cần thiết

cho sự phát triển của tế bào ñược nuôi cấy [19].

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong

nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học, nông

nghiệp và y dược học

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật ñã hướng về những ứng

dụng thực tiễn, vì nó liên hệ mật thiết với cây trồng Nhờ tiến bộ của khoa học

kỹ thuật ở những ngành có liên quan, ngành nuôi cấy mô thực vật ñã ñược

trang bị hiện ñại và trở nên quan trọng trong nghiên cứu khoa học và thực tiễn

sản suất Các nhà thực vật học ñã áp dụng phương pháp này với mục ñích sau:

- Đối với lĩnh vực cải tiến cây trồng: Vi nhân giống; lập thư viện DNA;

bảo tồn in vitro; tạo các biến dị soma; lai tế bào soma; chọn giống

chống chịu sâu bệnh; lai xa…

- Đối với nghiên cứu di truyền học:

• Tạo ra một quần thể lớn và ñồng nhất trong một thời gian ngắn, vẫn

giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ

• Tạo các giống mới có năng suất và phẩm chất cao bằng phương

pháp chuyển gen

• Tạo ñược nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (thân, phiến lá,

hoa, hạt phấn,…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện ñược

• Làm sạch nguồn virus cho cây bằng cách lấy mô phân sinh ngọn

1.2.2 Ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô thực vật ñã ñược ứng dụng vào các mục ñích

sau:

• Tạo quần thể lớn và ñồng nhất về di truyền trong khoảng thời gian

ngắn, với diện tích và không gian nhỏ trong phòng thí nghiệm, có thể

kiểm soát ñược các ñiều kiện lý hóa ảnh hưởng ñến sinh trưởng của

cây

• Tạo ñược nhiều cây con từ các mô và cơ quan của cây (lóng, thân,

phiến lá, hoa, hạt phấn, noãn, chồi, phát hoa) mà ngoài tự nhiên không

1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Nuôi cấy mô sẹo

- Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng

- Nuôi cấy tế bào ñơn

- Nuôi cấy protoplast – chuyển gen

- Nuôi cấy hạt phân ñơn bội

- Nuôi cấy phôi

1.2.4 Các bước nhân giống invitro

Nhân giống vô tính thực vật trong in vitro thường trải qua các bước sau:

- Khử trùng mô cấy

- Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng

- Tạo thể nhân giống invitro

- Nhân giống invitro

- Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

- Chuyển cây in vitro ra vườn ươm

1.2.5 Khử trùng mẫu nuôi cấy

Một trong những bước quan trọng ñầu tiên quyết ñịnh ñến sự thành

công hay thất bại trong nhân giống in vitro cây ñầu dòng nói chung và cây

khoai lang nói riêng là việc khử trùng mẫu cấy ñể ñưa chúng vào nuôi cấy

trong ñiều kiện vô trùng Phương pháp phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện

nay là sử dụng các hóa chất có khả năng tiêu diệt vi sinh vật Hiệu quả diệt

nấm, khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian, nồng ñộ xử lý và khả

năng xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt mẫu cấy Để tăng

tính linh ñộng của hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các

chất làm giảm sức căng bề mặt như: Tween 20, Tween 80, Fotoflo, Teepol

hoặc có thể xử lý phối hợp với cồn 70% Một hóa chất ñược lựa chọn cho quá

trình vô trùng mẫu cấy phải bảo ñảm hai thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh

vật tốt và không hoặc có mức ñộ ñộc thấp ñối với mẫu thực vật Trong các

loại hóa chất trên, NaOCl, H2O2 và Ca(OCl)2 hay ñược dùng hơn vì chúng có

mức ñộ ñộc tính thấp ñối với mẫu và không có biểu hiện ức chế sinh

trưởng[19]

Theo Lê Thị Thu Về và cộng sự (1999), khi xử lý các củ hoa loa kèn

bằng HgCl2 ở nồng ñộ 0,1% cho thấy ở thời gian xử lý 10 phút, số mẫu ñưa

vào ñạt 100%[16]

Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh (2007), khi nhân giống cây Pơmu

nhận thấy khi khử trùng mẫu chồi ñỉnh và chồi bên bằng Natri hypochloride

10% trong 12 phút thu ñược tỷ lệ mẫu sống cao nhất (50,63%) [1] Tuy nhiên, ñối với một số loại cây cần phải xử lý kết hợp hai loại chất

khử trùng thì mới ñem lại hiệu quả khử trùng cao Huỳnh Thị Huế Trang và

cộng sự (2007), nuôi cấy phân sinh mô chồi hoa huệ trắng ñã khử trùng bằng

dung dịch sodium hypochloride (dưới dạng thương phẩm là Clorox) với tỷ lệ

1:1 trong 30 phút sau ñó rửa lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và khử trùng

lại bằng dung dịch thuỷ ngân clorua 0,1% trong 10 phút [15]

Dương Lan Oanh và cộng sự (2007), nghiên cứu về sự nhân chồi

và phát triển rễ của cây dứa cảnh ñã xử lý, mẫu bằng Clorox 10% trong 10

phút sau ñó rửa lại bằng nước cất vô trùng và khử trùng mẫu lại bằng thuỷ

ngân clorua 0,2% cho thấy ở thời gian xử lý 8 phút số mẫu sống ñạt tỷ lệ cao

nhất (85%)[12]

Khưu Hoàng Minh và cộng sự (2007), nghiên cứu vi nhân giống cây

Trai Nam bộ cho thấy khi sử dụng riêng rẽ canxi hypochloride ñể vô trùng

mẫu Trai thực sinh thì ở nồng ñộ 25% trong 30 phút cho tỷ lệ mẫu sống cao

nhất là 4,4% Nhưng khi sử dụng nồng canxi hypochloride 25% trong 30 phút

kết hợp với HgCl2 0,05% trong 15 phút thì tỷ lệ mẫu sống vô trùng tăng lên

6,2%[11]

Khoai lang là cây thân thảo dạng dây leo hoặc bò trên mặt ñất, củ nằm

trong ñất và ñược trồng trong vùng sinh thái rộng lớn, do ñó sự lựa chọn mẫu

ñể kiểm soát và xử lý mầm bệnh là hết sức khó khăn Hwang, Robert (1983)

ñã tiến hành khử trùng bằng Clorox 10% (0,52% NaOCl) với mẫu là chóp

ngọn, chồi nách, mẫu lá hoặc mẫu cuống lá non[49]

1.2.6 Mẫu cấy

Mẫu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các

cơ quan hay bộ phận của cây như chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá,

thân, các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ mầm), các cơ quan dự trữ (củ, căn

hành ) tùy theo sự tiếp xúc với môi trường mà các mẫu thực vật có chứa ít

hay nhiều mầm bệnh (vi khuẩn, nấm) Các cấu trúc thực vật ñược bao kín (lá

mầm, phôi, mô thịt trong quả ) thường không chứa hoặc có rất ít vi sinh vật,

ngược lại, các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc với ñất, nước như rể, củ, thân

thường có lượng vi sinh vật rất cao và khó loại bỏ hoàn toàn

Kuo, Shen (1985) nghiên cứu nhân giống khoai lang sạch virus sử dụng

mô lá và ñỉnh sinh trưởng[24]

Belarmino (1993), Nguyễn Hữu Hỗ, Nguyễn Văn Uyển (2005) nhận

thấy rằng trong môi trường MS có 2mg/l NAA và 0.1mg/l BA, mẫu cấy

từ lá hình thành mô sẹo rất nhanh (từ vài ngày ñến 1 tuần) ở vị trí vết cắt, sau

ñó mô sẹo này ñược cấy chuyền sang môi trường MS không chất sinh trưởng,

khoảng 1 tuần ñến 1 tháng thấy một số chồi tái sinh từ mô sẹo, xuất hiện

thường ở vùng gân chính vị trí gốc lá Ngoài ra, tác giả còn nhận thấy hệ rễ

trên môi trường MS không chất sinh trưởng sau 3 ñến 4 tuần nuôi cấy ñã tái

sinh chồi trên một số rễ to, ñôi khi hình thành từ rễ nhỏ[5],[22]

Các giống khác nhau, vị trí mẫu các loại mẫu cấy khác nhau

sẽ phản ứng và cho kết quả khác nhau trên cùng một ñiều kiện nuôi cấy

Podobo và cộng sự (1995) nhận thấy rằng mô lá của các giống khoai lang

ñược cấy trên môi trường MS có bổ sung 0.2mg/l-1 2,4 D thì có 19/27 giống

có biểu hiện sự tái sinh chồi, 8 giống không có phản ứng Trong ñó, giống có

tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là PI 318846-3 (78.6%) và khi chuyển sang môi

trường MS bổ sung 0.2mg/l-1 zeatin riboside thì giống này cũng có tỷ lệ tái

sinh chồi cao nhất (33.3%) Cũng theo Podobo và cộng sự (1995) mẫu từ các

vị trí lá khác nhau (lá thứ nhất ñến lá thứ 6 từ ngọn xuống), kết quả là mẫu lá

ở vị trí thứ 3 có khả năng tái sinh chồi cao nhất (91.67%) so với các vị trí

khác Các lá càng già thì tỷ lệ tái sinh càng thấp [20]

1.2.7 Môi trường nuôi cấy tế bào thực vật

Công thức môi trường của Murashige và Skoog (1962, MS) là thích hợp

cho phần lớn các trường hợp nuôi cấy in vitro Môi trương gồm các nhóm chất căn bản sau:

• Các chất vô cơ ña lượng: N (NO3 và NH4), P, K, S, Ca, và Mg

• Các nguyên tố vi lượng: Fe, Mn, Zn, Br, Cu, Co và Mo

• Các vitamin: nhiều loại (nicotinic acid, biotin, ) mà quan trọng nhất là

thiamine (vitamin B1) dưới dạng thiamine – HCL

• Nguồn carbon: sucrose hoặc glucose

• Các chất ñiều hòa tăng trưởng thực vật: các auxin và cytokinin, kích

thích sự phân bào, kiểm soát sự phân bào, kiểm soát sự biệt hóa tế bào

và phát sinh hình thái Các auxin thường dùng: 2,4-D (2,4

Dichlorophenoxyaceticacid), IAA (indole-aceticacid), IBA (indole

3-butyric acid) Các cytokinin có BAP (6-benzylaminopurine), zea

(zeatin), Ngoài ra còn có GA (gibberillic acid) và ABA (abscisic

acid)

• Agar sử dụng cho môi trường ñặc Hệ thống chiếu sáng hợp lý cần cho

sự phát triển của tế bào thực vật[7]

Thành phần môi trường nuôi cấy mô tế bào thay ñổi tùy theo loài thực vật,

loại tế bào, mô và cơ quan ñược nuôi cấy Nhiều yếu tố của môi trường ñã

ñược nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu như môi trường khoáng cơ

bản, nồng ñộ và các loại ñường, chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

Theo Belarmino (1993), môi trường MS + 2mg/l NAA + 0.1mg/l BA

tương ñối thích hợp ñối với nhiều giống khoai lang trong việc tạo mô sẹo lá

và tạo ñiều kiện cho việc tái sinh khi mô lá ñược chuyển sang môi trường

không có chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật [22]

Môi trường cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất ở giống khoai lang Chiêm dâu

là môi trường MS có bổ sung 1ppm/l BA + 0.5ppm/l NAA và giống khoai

lang NN31 là môi trường MS có bổ sung 1ppm/lBA + 0.1ppm/l IAA, chồi

ñược hình thành là chồi ñơn và tái sinh từ mô sẹo [2])

A Porobo Dessai và cs (1995) báo cáo rằng giống khoai lang PI 318846.3

có khả năng tái sinh cây luôn cao nhất (80%) khi nuôi cấy trên môi trường

MS + 2,4 - D (0,2mg/l) trong 3 ngày và sau ñó chuyển sang môi trường MS +

zeatin riboside (0,2mg/l)[20]

1.2.8 Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật

Hormon thực vật là những hợp chất hữu cơ do thực vật sản xuất di

chuyển từ nơi tổng hợp ñến nơi tác dụng, ñiều khiển sự sinh trưởng hay một

quá trình sinh lý của thực vật với một liều lượng rất nhỏ (Davies, 1995)[17]

Chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật bao gồm hormon thực vật và các hợp

chất hữu cơ do con người hoặc vi sinh vật tổng hợp có tác dụng ñiều hòa sự

sinh trưởng ở thực vật Các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật không phải là

chất dinh dưỡng, các vitamin hay những nguyên tố thiết yếu cho thực vật

[17]

Hiện nay các chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược chia thành 5 nhóm

chính: auxin, gibberillin, cytokinin, acid abscisic và ethylen

+ Auxin

Auxin là nhóm chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ñược khám phá ñầu

tiên (1880) bởi các thí nghiệm của Darwin và Francis, con trai của ông về

hiệu ứng ánh sáng trên sự cong của diệp tiêu cây yến mạch (Avena sativa) và

sự phát hiện của Went (1982) về vai trò kích thích sự kéo dài tế bào của auxin

(Bùi Trang Việt,2000) Mười năm sau, cấu trúc của auxin ñược xác ñịnh ñó là

indoleacetic acid (IAA) [63]

Auxin có vai trò quan trọng trong sự phân chia, mở rộng và kéo dài tế

bào, ñiều này liên quan tới sự giãn nở của vách tế bào, tính ưu tính ngọn,

hướng ñộng, lão suy, rụng, ñậu và tăng trưởng, tính cái của hoa, ñiều khiển sự

hình thành rễ, tăng hô hấp tế bào và mô nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong

sự hình thành phôi (bao gồm cả phôi hợp tử và phôi sooma) Auxin còn làm

tăng hoạt tính của các enzim, ảnh hưởng mạnh ñến trao ñổi chất của nitrogen,

tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng ñường trong môi trường [17] Auxin ñược hình thành chủ yếu ở ngọn thân, lá non, hột ñang phát

triển Sau ñó auxin di chuyển xuống rễ kích thích hình thành rễ bất ñịnh

Trong thực vật bậc cao, auxin di chuyễn hữu cực từ tế bào này qua tế bào

khác, từ ñỉnh chồi xuống dưới gốc thân (hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế di chuyển hữu cực của auxin

Sự di chuyễn hữu cực này ñóng vai trò quan trọng trong sự sinh phôi (bao gồm cả phôi hợp tử và phôi soma) [25]

Trong rễ, sự di chuyển của auxin phức tạp hơn Khi sử dụng ñồng

vị phóng xạ, Mitchell và cs, (1975) và Tsurumi và cs, (1978) nhận thấy rằng

sự di chuyển của auxin là có tính hướng ngọn trong mạch chính của rễ (di

chuyển từ gốc rễ ñến ngọn rễ) tuy nhiên cũng có bằng chứng cho thấy auxin

có thể di chuyển hướng gốc ở gần ngọn rễ và vùng kéo dài rễ [54] Cấu trúc của một số dạng auxin: IAA, NAA, 2,4-D (hình 1.2)

Hình 1.2: Cấu trúc của auxin tự nhiên (IAA) và auxin tổng hợp (NAA, 2,4-D)

(Smith,1997)

Sự hình thành và phát triển rễ bất ñịnh phụ thuộc vào sự di chuyển

và nồng ñộ của auxin Sử dụng auxin trong nuôi cấy in vitro như là một nghệ thuật, ở nồng ñộ thấp, auxin kích thích sự tạo rễ bất ñịnh nhưng ở nồng ñộ cao lại kích thích hình thành mô sẹo

+ Cytokinin

Cytokinin có vai trò tác ñộng ñến tất cả các giai ñoạn sinh trưởng và phát triển của thực vật, từ sự kích thích phân chia tế bào, sự phát sinh cũng như tăng trưởng chồi, thúc ñẩy sự hình thành các chồi nách bằng cách ức chế

ưu tính ngọn, ức chế sự hình thành rễ ñến sự hình thành hoa và trái Cytokinin

là chậm sự phân hủy diệp lục tố, do ñó làm chậm sự lão hóa của lá, làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein, ñiều chỉnh nồng ñộ Ca2+ trong tế

bào (Smith, 1997; Bùi trang Vệt, 2000) Cytokinin ñược tổng hợp chủ yếu ở ngọn rễ, hột ñang phát triển

Một số dạng cytokinin thường gặp: zeatin, BA, kinetin (hình 1.3)

Các gibberellin khác nhau là Ax hay GAx ñược ñánh số theo thứ tự khám phá

Cấu trúc của một số gibberellin thường gặp (hình1 4)

Hình 1.4 Cấu trúc của khung gibbane và sự chuyển ñổi GA 4 thành các

GA khác (Smith, 1997)

+ Acid abscisic

Acid abscisic (ABA) là chất ñược ly trích ñầu tiên trên cây bông Tính

chất của ABA là cản sự nảy mầm, kéo dài sự ngủ của chồi và hột, làm chậm

sự kéo dài lóng, liên quan tới sự sinh phôi và trưởng thành của hột, kích thích

sự lão suy và rụng của nhiều loại trái và lá ABA có vai trò quan trọng trong

sự ñóng mở của khí khẩu Khi nồng ñộ ABA cao, khí khẩu trong lá ñóng lại

Thông qua cơ chế này, ABA giúp cho cây tự bảo vệ khi gặp ñiều kiện khô

hạn của môi trường Acid abscisic là một sesquiterpen (hình 1.5), ñược tổng

hợp ở rễ, lá non, hột ABA ñược vận chuyển cả trong mạch mộc và libe tùy vị

+ Ethylen

Ethylen là một chất khí có cấu trúc ñơn giản (CH2=CH2) (hình1.6), có

vai trò trong sự gỡ miên trạng của hột, tăng trưởng và phân hóa (chồi và rễ),

tạo rễ bất ñịnh, rụng lá và trái, tính cái của hoa, lão suy (hoa, trái), chín trái

Ethylen ñược tổng hợp ở trong trái chín, mô lão suy và ở những mô

chịu “stress”, do ñó, ethylen ñược xem như là một hormon vết thương, giúp

cho cây giảm bớt sự nhiểm trùng

Thidiazuron (N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea) là một chất hóa

học ñược tổng hợp, tan nhiều trong ethanol, là một ứng cử viên ñể trở thành

một trong những chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật TDZ ñã ñược sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô thực vật bởi nó thể

hiện ñồng thời tính chất mạnh của auxin và cytokinin (Murthy và cs, 1998) dù

cấu trúc của nó khác hẳn với cấu trúc của auxin và cytokinin [56](hình 1.7)

Trong ñiều kiện in vitro, nhiều công trình nghiên cứu ñã ñược công bố

về vai trò của TDZ trong sự phát sinh hình thái bao gồm sự tạo mô sẹo, sự

phát sinh chồi, sự tạo phôi soma

- Tạo mô sẹo: thông thường, khi cảm ứng tế bào tạo mô sẹo, chúng ta

thường sử dụng auxin như NAA hay 2,4-D TDZ với hàm lượng thấp cũng có

khả năng tạo ñược mô sẹo (Capelle và cs, 1983) và khối mô sẹo thường có

những nốt nhỏ màu xanh [56]

- Tạo chồi: TDZ ñã ñược sử dụng ñể nghiên cứu sự tạo chồi trên nhiều

ñối tượng khác nhau, từ những cây ăn trái nhiệt ñới cho tới những cây tạo củ

Kerns và cs (1986), Fellman và cs (1987), Fiola và cs (1990) và Malik và cs

(1992a, 1992b) ñã kết luận rằng sự tạo chồi trên môi trường có bổ sung DTZ

với hàm lượng thấp thì hiệu quả hơn so với các cytokinin khác Đặc biệt, sự

tác ñộng của chúng trên sự tạo chồi ở những loài thân gỗ là hiệu quả nhất

(Briggs và cs, 1988; Baker và cs, 1993)

- Tạo phôi soma: cảm ứng sự tạo phôi soma thường sử dụng phối hợp

ñồng thời hai loại chất ñiều hòa là auxin và cytokinin với tỉ lệ khác nhau,

trong khi TDZ với một mình nó có thể tạo ñược phôi soma (Saxena và cs,

1992; Visser và cs, 1992; Gill và cs, 1993) Trên nhiều loại cây khác nhau,

nhiều tác giả ñã sử dụng TDZ trong môi trường ñể cảm ứng sự tạo phôi soma

như thuốc lá (Gill và cs, 1993), ñậu xanh (Murthy và cs, 1995), cây phong lữ

(Visser và cs, 1992), neem (Murthy và cs, 1998), cacao (Li và cs, 1998)

1.3 Ý nghĩa của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa quan trọng trong

công nghệ sinh học Khi tiến hành các kỹ thuật chuyển gen ñể tạo các giống

cây trồng mới, chúng ta ñều cần ñến kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vì

phương pháp này có những ưu ñiểm ñáng kể:

- Nhân giống với hệ số nhân cao trong thời gian ngắn

- Tạo ra các dòng cây con hoàn toàn ñồng nhất về mặt di truyền

- Có thể thực hiện bất kỳ ñịa ñiểm nào

- Không phụ thuộc vào thời vụ, thời tiết và không ñòi hỏi phải có một

diện tích lớn mà vẫn có hiệu suất cao

- Có thể phục tráng và nhân giống một số cây trồng quý bằng phương

pháp nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng tạo cây sạch bệnh

- Dễ dàng học hỏi và trao ñổi công nghệ với các nước tiên tiến trên thế

Phát sinh hình thái ở thực vật là thuật ngữ dùng ñể chỉ những thay ñổi

của cơ quan, mô hay ở mức tế bào thực vật (Bùi Trang Việt, 2000), bao gồm

sự phát sinh chồi bất ñịnh, phát sinh rễ bất ñịnh, tạo phôi soma, v.v Phát sinh hình thái là một trong những vấn ñề căn bản và phức tạp nhất

của sinh học Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình

thái và cấu trúc thực vật mà cần tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố

liên quan trong các biến ñổi hình thái và cấu trúc ñó Do ñó, không có một kỹ

thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh ñược tất cả mọi khía

cạnh của nó Những kỹ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải

phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học ñều có thể giúp ta tìm hiểu

hiện tượng phát sinh hình thái Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai

phương pháp thường ñược dùng nhất là:

- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến ñổi

phát triển sau ñó

- Nuôi cấy in vitro trong ñiều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần

tách rời của một cơ thể thực vật Trong phương pháp này, nên áp dụng các

chất ñiều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh vì mẫu cấy có kích thước nhỏ,

rất khó tiến hành nghiên cứu sinh lý học Trong phát sinh cơ quan, chồi thường ñược cảm ứng và tăng trưởng

trước, rễ ñược tạo ra sau Cũng có thí nghiệm tạo rễ trước, sau ñó mới hình

thành chồi như trên cây Malus pumila, sự tạo rễ và chồi ñược cảm ứng bởi

Agrobacterium rhizogenes (James và cs, 1988).Với những cây thân gỗ cứng,

chồi thường ñược cảm ứng trực tiếp từ bộ lá

+ Sự phát sinh chồi bất ñịnh

Bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, nghiên cứu sự tạo chồi nhằm nhân

nhanh ñể tạo một số lượng chồi lớn với những ñặc tính ñồng nhất và giống

với cây mẹ Sự tạo chồi in vitro có thể từ nuôi cấy cơ quan, mô hay tế bào trên

môi trường có hàm lượng cytokinin kết hợp với auxin Tỉ lệ về hàm lượng của

hai loại hormon này là rất quan trọng Nồng ñộ cytokinin cao hơn auxin thì

mẫu có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại, nếu nồng ñộ auxin cao hơn

cytokinin thì mẫu có khuynh hướng tạo rễ

Trong sự tạo chồi, hoặc là chồi ñược tạo trực tiếp hoặc thông qua mô

sẹo Các tế bào của mô cấy ñược cảm ứng bởi môi trường ñể phản biệt hóa trở

về trạng thái sinh mô Những tế bào sinh mô ñược cảm ứng ñể có khả năng

biệt hóa trở lại tạo một cơ quan chồi mới ñược gọi là chồi bất ñịnh

Chồi thường ñược cảm ứng và tạo thành ở vùng ngoại vi (vùng nhu

mô vỏ) nên thường ñược xem là có nguồn gốc ngoại sinh

+ Sự phát sinh rễ bất ñịnh

Sự tạo rễ trên nhánh cây hoặc chồi in vitro gọi là sự tạo rễ bất ñịnh,

gồm ít nhất là hai giai ñoạn có thể phân biệt ñược dưới kính hiển vi (Mai Trần

Ngọc tiếng và cs, 1980):

- Giai ñoạn tạo sơ khởi rễ từ vài tế bào của tầng phát sinh libe-mộc

hoặc chu luân, giai ñoạn này ñược khởi phát bởi auxin ở nồng ñộ cao Auxin

kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng, ñồng thời giúp sự phân

hóa của các mô dẫn

- Giai ñoạn kéo dài sơ khởi rễ ñược kích thích bởi auxin ở nồng

ñộ thấp

Điều quan trọng là nồng ñộ của auxin kích thích giai ñoạn tạo sơ khởi

rễ nhưng có thể ức chế giai ñoạn kéo dài rễ và ngược lại [17]

Auxin tự nhiên không bền (bị oxi hóa trong vài ngày dưới ánh sáng),

nên trong thực tế người ta thường dùng các auxin tổng hợp ít bị phân hủy

như: indole-3-butyric acid (IBA), anpha–naphtalenacetic acid (NAA),

2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4 – D) Tùy vào mục ñích và ñối tượng nghiên

cứu mà chúng ta sử dụng các loại auxin với nồng ñộ khác nhau

1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu nuôi cấy mô ở Việt Nam

Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960

ở miền Nam và ñầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ

năm 1980 Lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng Nhiều tỉnh thành

trong cả nước ñã xây dựng nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ

cao ñể phát triển lĩnh vực nuôi cây mô này và ñã mang lại nhiều thành tựu

nổi bậc:

Người ta có thể sản xuất giống trong phòng thí nghiệm ñể ñưa ra sản

xuất nhanh chóng hơn nhiều phương pháp cổ ñiển, nhờ vậy mà một người có

thể sản xuất ra 130.000 cây Hồng/năm từ một gốc Hồng

Ở miền Bắc, nhân bản vô tính ở thực vật ñược ứng dụng hầu hết các

nông, lâm sản, bảo tồn thành công các loại gỗ quý như: Vù hương – loại gỗ

tiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, Chè Vang – một

loại chè rất khó trồng Kỹ thuật này giúp lai tạo thành công giống lúa chịu

hạn DR1, nhân bản nhiều loại khoai tây, mía

Từ năm 2001 ñến nay, Sở Khoa Học – Công nghệ Lạng Sơn, hàng

năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla

Trung tâm ứng dụng và chuyễn giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh

phúc ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ñể nhân

giống cây Lô hội, một loài dược liệu quý ở ñịa phương

Việt Nam có thể trở thành quốc gia sản xuất phong lan lớn trong khu

vực Chỉ với 3 người, phòng nuôi cấy mô – trung tâm giống và kỹ thuật cây

trồng Phú Yên có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu của khách

hàng Hiện nay 100% nông dân Đà Lạt sử sụng cây giống từ nuôi cấy mô

Năm 2002, ThS Lê Thị Kim Đào và cs tại Trung tâm ứng dụng khoa

học kỹ thuật Bình Định ñã nhân giống thành công 4 loại cây Trầm Hương,

bạch ñàn Urophylla, cây Hông, Giổi xanh bằng phương pháp nuôi cấy mô

cho chất lượng cây giống tốt và hiệu quả kinh tế cao

Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô ñã có những bước ñột phá mới:

nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, từ một số tế bào gốc

của sâm Ngọc Linh bằng công nghệ sinh khối tế bào, nhóm nghiên cứu học

viện Quân y ñã thành công trong việc nuôi cấy thành số lượng lớn, toàn bộ

quy trình chỉ mất 10 ñến 20 ngày, trong khi bình thường phải mất khoảng 6

năm sâm mới cho thu hoạch Đã khôi phục nhiều loài lan rừng quý hiếm khỏi

nguy cơ tuyệt chủng, ñặc biệt là loài lan Hài Hồng – loài lan duy nhất có

hương thơm trên thế giới

1.6 Tổng quan về Chitosan

1.6.1 Công thức cấu tạo

Chitin là một polymer sinh học có trong thành phần cấu tạo nên vỏ của

các loài giáp xác như : tôm, cua vỏ các loài côn trùng, thành tế bào sợi nấm

Chitin là một polymer ñược cấu tạo từ gốc N-acetyl – Glucosamine Chitin là

một polymer bền, khó tan, khó tương tác hóa học Khi deacetyl hóa chitin