năng kháng bệnh của khoai lang nuôi cấy mô
Các ñốt thân thu nhận từ cây khoai lang in vitro 30 ngày tuổi ñược chọn làm mẫu cấy. Sự phản ứng của chúng là khác nhau khi ñược nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung BA 2mg/l và Kinetin 1mg/l và chitosan oligomer ở các nồng ñộ khác nhau. Kết quả thống kê ở ngày thứ 30 cho thấy sự khác biệt rất có ý nghĩa trên tất cả các chỉ tiêu theo dõi.
Sau 10 ngày nuôi cấy tất cả các mẫu ñều bật chồi nhưng mẫu cấy có sự phản ứng rõ rệt với sự thay ñổi của nồng ñộ chitosan oligomer và so với ñối chứng thể hiện qua các chỉ tiêu theo dõi mà ñặc biệt nổi bật là số lá, chiều cao chồi, khối lượng chồi, số rễ, chiều dài rễ.
Theo kết quả phân hạng thì ở nghiệm thức C20 có số lá là 5,9 lá/cây, cao hơn so với ñối chứng (3,2 lá/cây). Chiều cao chồi và khối lượng chồi tỷ lệ thuận với nồng ñộ chitosan oligomer. Nồng ñộ chitosan oligomer càng cao thì chiều cao chồi và khối lượng chồi càng lớn, ở nghiệm thức C50 có chiều cao chồi 40,7mm và khối lượng chồi tươi 0,311g (bảng 3.7; hình 3.9;3.10). Kết quả thử nghiệm khi ñưa cây ra ngoài vườn ươm cũng cho thấy những cây ñược nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chitosan oligomer có sức sống cao và khả năng kháng bệnh tốt hơn so với những cây ñược nuôi cấy trong môi trường không có bổ sung chitosan oligomer.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến sinh trưởng của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày nuôi cấy
Nghiệm thức Chồi Rễ Số lá Chiều cao chồi (mm) Khối lượng chồi tươi (g) Khối lượng chồi khô (g) Số rễ Chiều dài rễ (mm) Khối lưởng rễ tươi (g) Khối lượng rễ khô (g) C0 C10 C20 C30 C50 3,2b 4,5a 5,9a 5,1a 5,3a 20,0b 24,0b 37,0a 38,1a 40,7a 0,122c 0,158bc 0,237abc 0,287ab 0,311a 0,011b 0,013bc 0,022a 0,024a 0,021a 2,7d 2,9cd 3,7b 4,5a 3,1c 77,5d 86,8c 108,5a 98,3b 40,5e 0,017 0,028 0,037 0,052 0,020 0,002 0,004 0,004 0.005 0,002 ANOVAz CV (%) ** 17.1 * 28,9 ** 30,3 * 29,8 * 21,7 * 35,8 NS 42,6 NS 34,1 z
**, *, NS: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; 0,05 hoặc không có sự khác biệt. a, b, c : các trị số trên cùng một cột có sự khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 C0 C10 C20 C30 C50 Nồng ñộ chitos an (ppm ) m m
Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến chiều cao chồi của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 C0 C10 C20 C30 C50 Nồng ñộ chitos an (ppm ) g
khối lượng chồi tươi(g) khối lượng chồi khô(g)
Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer ñến khối lượng chồi tươi và khối lượng chồi khô của khoai lang nuôi cấy mô sau 30 ngày
Ảnh 3.11 Cây khoai lang trong môi trường MS + BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l
sau 30 ngày nuôi cấy
Ảnh 3.12 Cây khoai lang trong môi trường MS + BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l + chitosan oligomer 50ppm sau 30 ngày nuôi cấy
Thí nghiệm sử dụng môi trường tối ưu ñể nghiên cứu sự bật chồi và tăng trưởng chồi làm ñối chứng khi bổ sung chitosan oligomer từ vỏ tôm có khối lượng phân tử là 10.000 Da với các nồng ñộ khác nhau.
Sau 30 ngày nuôi cấy nhận thấy ở tất cả các nghiệm thức ñều có sự hình thành chồi từ các ñoạn thân mang chồi nách và có sự phản ứng rõ rệt với sự thay ñổi của nồng ñộ chitosan oligomer so với ñối chứng. Ở môi trường C0 (BA 2mg/l + Kinetin 1mg/l) có chiều cao chồi thấp nhất (20mm) so với các nghiệm thức còn lại có bổ sung chitosan oligomer và nồng ñộ chitosan oligomer càng cao thì chiều cao chồi càng lớn. Ở nghiệm thức C50 có chiều cao chồi cao nhất là 40,7mm, kết quả này chứng minh thêm một ñiều rằng chitosan oligomer ñược coi là một chất ñiều hòa sinh trưởng thế hệ mới (Zubay, 1989).
Kết quả nghiên cứu nuôi cấy mô ở hoa lan của Khin Lay Nge (2006) cũng cho thấy khi bổ sung chitosan oligomer ở nồng ñộ 15ppm thì mô sẹo phát triển rõ rệt so với môi trường không bổ sung chitosan oligomer khi nuôi cấy trong môi trường lỏng và 20ppm trong môi trường ñặc ñể tạo cây con với chitosan oligomer 1kDa. Tương tự với tác dụng của chitosan có khối lượng phân tử thấp trong nghiên cứu tái sinh phôi xoma từ mô sẹo của cà rốt và tái sinh rễ, chồi ở cây dâu tây [46]. Về chỉ tiêu số rễ, ở nồng ñộ chitosan oligomer 30ppm có số rễ cao nhất là 4,5 rễ/cây, khi tăng nồng ñộ lên 50ppm thì số rễ giảm xuống chỉ còn 3,1 rễ/cây. Đối với chiều dài rễ ở nồng ñộ chitosan oligomer 20ppm có chiều dài rễ dài nhất là 108.5mm, khi tăng nồng ñộ lên 50ppm thì chiều dài rễ chỉ còn 40.5mm. Như vậy có thể nói chitosan oligomer ở nồng ñộ cao có tác dụng ñối với sự tăng trưởng chồi nhưng lại ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của rễ.
QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY KHOAI LANG CAO SẢN NHẬT BẢN (IPOMOEA BATATAS L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN-
VITRO
Chồi vô trùng
Cây con Môi trường tạo rễ
MS + IAA 1mg/l
½ MS + NAA 5mg/l
+ Kinetin 15 mg/l Tạo thành cụm chồi gồm nhiều thể chồi (Thể protocorm)
Xử lý thuỷ ngân clorua 0,1% trong 10 phút Chồi mầm từ
củ khoai lang
Ra vườn ươm
Cây con cao 5-7 cm, 4-5 lá MS + BA 2mg/l
+ Kinetin 1mg/l + Chitosan 50ppm
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN:
1. Chất khử trùng thích hợp nhất cho khoai lang là thuỷ ngân clorua, ở nồng ñộ 0,1% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sống và bật chồi 100%. 2. Trên các môi trường ½ MS; 2/3 MS; MS + 200mg/l KH2PO4; MS +
100ml/l nước dừa có bổ sung 5mg/l NAA và 15mg/l Kinetin có hình thành protocorm nhưng tỷ lệ rất thấp (17%) và chồi không phát triển. 3. Môi trường tốt nhất cho sự bật chồi và tăng trưởng chồi là môi trường
MS có bổ sung 30g/l saccharose + 7,5g/l agar + 2mg/l BA + 1mg/l Kinetin cho chiều cao chồi cao nhất là 56mm, sinh khối tươi 0,5g, sinh khối khô 0,037g.
4. Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo rễ là môi trường MS có bổ sung 30g/l saccharose + 7,5g/l agar + 1mg/l IBA cho số rễ/cây là 20 rễ, chiều dài rễ là 50mm và chiều cao chồi là 56,4mm
5. Chitosan oligomer có ảnh hưởng rõ rệt ñến sự sinh trưởng của chồi cây khoai lang. Trên môi trường tối ưu cho sự bật chồi và tăng trưởng chồi (2mg/l BA + 1mg/l Kinetin) có bổ sung 50ppm Chitosan oligomer cho số lá 5,3 lá/cây, chiều cao chồi cao nhất là 40,7mm, khối lượng chồi tươi 0,311g, khối lượng chồi khô 0,021g cao hơn nhiều so với ñối chứng.
ĐỀ NGHỊ:
Đề nghị các nghiên cứu tiếp theo nên tiếp tục nghiên cứu ñể hoàn thiện qui trình:
1. Tiếp tục nghiên cứu về môi trường tạo protocorm.
2. Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan oligomer trên 50 ppm lên khả năng sinh trưởng của cây khoai lang cao sản Nhật Bản.
3. Tiếp tục nghiên cứu các ñiều kiện ánh sáng, giá thể ñể ñưa cây con ra vườn ươm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Nguyễn Thế Anh, Trần Văn Minh(2007), “Nhân giống cây Pơmu (Fokienia hodginsii)”, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 647-649.
2. Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Quang Thạch(2005), “Nghiên cứu tái sinh in vitro một số giống khoai lang Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp số ,http://www.hua.edu.vn.
3. Nguyễn Anh Dũng(2004), Nghiên cứu cố ñịnh Bacillus subtilis trong hạt chitosan, Kỷ yếu nghiên cứu khoa học Đại học Tây Nguyên, NXB Nông nghiệp, trang 173-178.
4. Nguyễn Quốc Hiến, Lê Hải, Lê Quan Luân(2000), Chế tạo chitosan oligomer bằng kỹ thuật bức xạ, Tạp chí hoá học, tập 28, số 2, trang 22-
24.
5. Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển(2005), “Nghiên cứu hai kiểu tái sinh in vitro cây khoai lang Ipomoea batatas L.” Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 1242- 1245.
6. Dương Công Kiên(2002), Nuôi cấy mô thực vật, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
7. Dương Công Kiên(2003), Nuôi cấy mô thực vật (II), Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
8. Dương Công Kiên(2006), Nuôi cấy mô thực vật (III), Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
9. Đinh Thế Lộc(1995). Cây khoai lang, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
Chí Minh.
11. Khưu Hoàng Minh, Trần Văn Minh(2007, “Vi nhân giống cây trai Nam Bộ (Fagarea cochinchinensis A. Chev.)”, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 763-765.
12. Dương Lan Oanh, Đỗ Khắc Thịnh, Ngô Thị Bích(2007), “Nghiên cứu ảnh
hưởng của môi trường nuôi cấy, chất ñiều hòa sinh trưởng (BA, NAA) ñến
sự nhân chồi và phát triển rễ của cây dứa cảnh”, Hội nghi khoa học, Công
nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa, Nhà XB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, 323-331.
13. Nguyễn Du Sanh, Nguyễn Thanh Dũng(2004), “Sự tạo củ ở khoai lang (Ipomoea batatas)”, Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 591-594.
14. Nguyễn Trung Thành, Lê Văn Cần, Peak Kee Youep(2007), “Nuôi cấy rễ bất ñịnh của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”,
Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 828-831.
15. Huỳnh Thị Huế Trang, Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn(2007),“Phục hồi giống hoa Huệ trắng (Polianthes Tuberosa linn.) nhiễm bệnh chai bông bằng nuôi cấy phân sinh mô chồi”, Hội nghi khoa học, Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa,
Nhà XB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, 141-152.
16. Lê Thị Thu Về, Đỗ Năng Vịnh, Lê Huy Hàm(1999), “Nhân nhanh các giống hoa loa kèn mới”, Báo cáo khoa học, Nhà XB Khoa học Kỹ thuật, 889-895.
17. Bùi Trang Việt(2000), Sinh lý thực vật ñại cương, Phát triển, Nhà XB ñại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.
18. Vũ Văn Vụ(1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục. 19. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp(2006), Công nghệ sinh
học, (2), Nhà XB Giáo Dục.
Tiếng anh
20. A. Porobo Dessai, R. M Gosukonda, E. Blay., “Plant regeneration of
sweet potato (Ipomoea batatas L.) from leaf explant in vitro using a two stage proocol”, Scientia Horticulture, 62,217-224.
21. Baker, B.S. and Bhatia, S. K.(1993), “Factors effecting adventious shoot regeneration from leaf explants quince (Cydonia oblonga)” Plant Cell Tissue Organ Cult., 35, pp. 273-277.
22. Belarmino MM. (1993). In vitro culture of sweet potato (Ipomoea batatas Lam.) and yam (Dioscorea spp.) for pathogen elimination and micropropagation. Proceedings of the Southeast Asian Regional Workshop on Adapted Propagation Techniques for Commercial Crops of the Tropics, Feb. 7-12, Ho Chi Minh City, Vietnam, IFS (Sweden) / BRC – NCSR VN (Vietnam), pp. 231-239.
23. Briggs, B.A., McCulloch, S.M. and Edick,L.A.(1998),
“Micropropagation of azaleas using thidiazuron”, Acta Hortic, 226, pp. 205-208.
24. C. G. Kuo, B.J. Shen, 1985, Virus free sweet potato storage roots devived from meristem-tips and leaf-cuttings, Scientia Horticulture, 26, 231-240. 25. Cooke, T.J., Racusen, RH. And Cohen, J.D.(1993), “The role of auxin in plant embryogenesis”. Plant Cell 5, pp. 1494 -1495.
cytokinin autonomy and the metabolism of N6-(DELTA2-isopentenyl)[8- 14C] adenosine in callus tissuses of Phaseolus lunatus L.” Plant Physiol, 73, pp. 796-802.
27. Chibu, H., Shibayama, H. (2001), Effects of chitosan application on the growth of several crops, Chitin chitosan in Life science, 235-239
28. Daniel J. Cantliffe(1993), “Advanced propagation systems for biomass species: a model system based on sweet potato”,Biomass and Bioenergy,
pp.63-69.
29. Dzung, N.A., Thang, N.T., 2001, Preparation of chitosan and
oligoglucosamine from sea by product and applications for agriculture,
Proceedings of Scientific Conference of Tropical Biological Institute, Agriculture Publisher, 162-169.
20. Dzung, N.A., Thang, N.T., 2002, Effects of oligoglucosamine prepared
enzyme degradation on the growth of soy bean, Advances in Chitin
Science, Vol. V, 463-467.
31. Dzung, N.A; Khanh, V.T.P, 2003, Effects of oligoglucosamine and
modified oligoglucosamine on growth inhibition of E.coli, Advances in
Chitin, Vol. VII, pp.240-243.1.
32. Dzung,N.A; Khanh, V.T.P.(2004), Proceedings of 6th Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symposium, Singapore. (in printing).
33. Dzung, N. A., Thang, N. T. 2004. Effect of oligoglucosamine on the gowtrh and development of peanut (Arachis hypogea L.).In Proceedings of The 6th Asia-Pacific on Chitin, Chitosan Symposium. Ed. E. Khor, D. Hutmacher and L. L. Yong. Singapore, ISBN: 981-05-0904-9.
for agriculture in Vietnam. J. Chitin Chitosan 10(3): 109-113.
35. Dzung, N. A., Thuoc, V. 2006. Study on effects of chitosan oligomer on the growth development and disease resistance of rice. In Advances in Chitin Science and Technology. Ed. S. W. Kim, H. K. No and R. D. Park. Hanrimwon Seoul. ISBN: 89-5708-110-0, 381-383.
36. Dzung, N. A. 2007. Chitosan and their derivatives as prospective biosubstances for developing sustainable eco-agriculture. in Advances in Chitin Science X. Ed. S. Senel, K. M. Varum, M. M. Sumnu, A. A. Hincal. 453-459.
37. Fellman, C.D., Read, P.E. and Hosier, M.A.(1987), “Effects or
thidiazuron and CPPU on meristem formation and shoot proliferation”, Hort. Sci., 22, pp. 1197-1201.
38. Fiola, J.A., Hassan, M.A., Swartz, H.J., Bors, R.H. and McNicols, R. (1990), “Effects or thidiazuron, light fluence rates and kanamicin on in vitro shoot organogenesis from excised Rubus cotyledons and leaves, Plant Cell Tiss. Org. Cult., 20 pp. 223-228.
39. Food Crops at the FAO and FAOSTAT: http://wwwfao.org
40. Gill, R., Saxena, P.K. (1993),” Somatic embryogenesis in Nicotiana tabacum L. induction by DTZ of direct embryo differentiation from cultured leaf discs”, Plant Cell Rep, 12, pp. 154 – 159.
41. Hadwiger, Klosterman, S.J and Choi, J,J, 2002, Advances in Chitin Science, Vol. V, pp. 452-457.
42. Hien, N.Q., Nagasawa, N, 2000, Radiation Physics and Chemistry, 59,
97-101.
43. Hirano, S. 1996. Chitin biotechnology applications. Biotechnol. Annual
44. Hirano, S., 1996, Biotechnology Annual Review, 2, 237-258.
45. Kerns, H.R. and Meyer, M.M. Jr.(1986), “Tissue culture propagation of Acer freemanni using thidiazuron to stimulate shoot tip proliferation”. HortScience, 21, pp. 1209-1210.
46. Khin lay nge, Nitar New, Suwalee Chandrachang, Willem F. Stevens(2006), “Chitosa as a growth stimulator in orchid tisse culture” Plant Science 170, pp.1185-1190.
47. Li, Z., Traore, A., Maximova, S. and Guiltinan, M.J. (1998), “Somatic embryogenesis and plant regeneration from floral explants of cacao (Theobroma cacao L.) using thidiazuron”, In Vitro Cell. Dev. Biol. – Plant, 34, pp. 293 – 299.
48. Limpanavech, P., Chaiyasuta, S., Vongpromek, R. et al. 2008. Effect of chitosan on floral production, gene expression and anatomical changes in the Dendrobium orchid, Scientia Horticulturae 116: 65-72.
49. L. S. Hwang, R. M. Skirvin., 1983, Adventitous shoot formation from sections of sweet potato grow in vitro, Scientia Horticulture, 20, 119-129. 50. Luan, L.Q., Nawasawa, N. 2002, Advances in Chitin Science, Vol. V, 468-474.
51. M. Isabirye , G. Ruysschaert, L. Van linden, J. Poesen, M.K. Magunda, J. Deckers (2007), Soil losses due to cassava and sweet potato harvesting: A case study from low input traditional agriculture. Soil & Tillage Research, 92, pp. 96-103.
52. Malik,K.A. and Saxena, P.K.(1992), “Thidiazuron induceshighfrequency shoot regeneration in intact deedlings of pea (Isum sativum L.),
chickpea(Cicer arietium L.) and Lentil (Lens culinaris Medik)”, Aust. J. Plant Physiol, 19,pp. 731-740.
potato”, Jpn. J. Crop Sci. 63(1). 158-159.
54. Mitchell, E.K., Davies, P.J. (1975), “Evidence for three different systems of movement of indoleacetic acid in intact root of Phaseolus cossineus”, Physiol Plant, 33, pp.290-294.
55. Murthy, B.N.S., Murch, S.J. and Saxena, P.K.(1995), “TDZ induced somatic embryogenesis in intact seedlings of peanut (Arachis hypogaea): endogenus growth regulator levels nd significance of cotyledons”,
Physiol. Plant, 94, 99. 268 – 276.
56. Murthy, B.N.S., Murch, S.J. and Saxena, P.K.(1998), “Thidiazuron: a potent regulator of in vitro plant morphogenesis”, In Vitro Cell. Dev. Biol - plant, 34, pp. 267 – 275.
57. Nitar, N., Chandrkrachang, S. and Stevens, W.F. 2004. Application of chitosan in Myanmar’s agricultural sector. in Proceedings of 6th Asia- Pacific Chitin and Chitosan Symposium. Ed. E. Khor, D. Hutmacher and L. L.Yong. Singapore, ISBN:981-05-0904-9.
58. R.O. Ankumah, V. Khan, K. Mwamba, K. Kpomblekou-A (2003), The influence of source and timing of nitrogen fertilizers on yield and nitrogen use efficiency of four sweet potato cultivars. Agriculture,