0796 nghiên cứu thành phần hóa học và các sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài củ gấu ( cyperus rotundus l) và củ gấu biển ( cyperus

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO TRƯỜNGĐẠIHỌCBÁCHKHOAHÀNỘI NGUYỄN MINHCHÂU NGHIÊN CỨUTHÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀSẮCKÝDẤUVÂNTAYCỦATHÂNRỄHAILỒI : CỦGẤU(CYPERUSROTUNDUSL.)VÀ CỦGẤUBIỂN(CYPERUSSTOLONIFERUSRETZ.) Chunngành: HóaHữucơ Mãsố: 62440114 TĨMTẮT LUẬNÁNTIẾNSĨHĨAHỌC HàNội-2016 Cơngtrìnhđượchồnthànhtại: TrườngĐạihọcBáchkhoaHàNội Ngườihướngdẫnkhoahọc: TS.TrầnThượng Quảng TS.NguyễnTiến Đạt Phản biện 1: GS TS Phạm Quốc LongPhản biện 2: GS.TS Nguyễn Hải NamPhảnbiện3:GS.TSKH.PhanTốngSơ n Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận ántiếnsĩcấpTrườnghọptạiTrườngĐạihọcBáchkhoaHàNội Vàohồi …… giờ,ngày… tháng… năm……… Cóthểtìm hiểuluậnántạithưviện: ThưviệnTạQuangBửu -TrườngĐHBKHàNội ThưviệnQuốcgiaViệtNam I GIỚI THIỆU LUẬNÁN Mởđầu ViệtNamlàmộttrongnhữngquốcgiacónềnyhọccổtruyềnlâuđờivớiviệcsửdụ ngcác loạithảodượctrongphịngchữabệnh,tăngcườngsứckhoẻ.Mộttrongnhữngd ượcliệuđượcsửdụngrộngrãilàvịthuốcHươngphụ.DượcliệuHươngphụđư ợcchếbiếntừthânrễcủalồicủgấu(Cyperus rotundusL.) Nhưng nay, để phục vụ cho nhu cầusửdụngtrongnướcvàxuấtkhẩu,vịthuốccótênlà“hươngphụ”ởViệt Nam, chủ yếu khai thác từ loài củ gấu biển (CyperusstoloniferusRetz.) Tổ chức Y tế Thế giới Bộ Y tế nước ta có quy định việcnhận dạngdược liệu cổtruyền từ nguyênliệul t h ự c v ậ t v i v i ệ c xây dựng tiêu chuẩn từ nhận dạng cây, phận sử dụng đếnviệc đảm bảo chất lượng trình chuẩn bị nguyên liệu haysản phẩm cuối Nếukhông xác định đượch o t c h ấ t t h ì c ầ n phảicó dấuvântaysắckýđểxácđịnh chấthoặchỗnhợp cácchất Chính tác giả lựa chọn lồi thực vật làm đối tượngnghiêncứu củaluận án: Nhiệmvụcủaluậnán - Nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập hợp chất từ hailoài củ gấu củ gấu biển phương pháp sắc ký, xác địnhcấu trúc hóa học chất tách phương pháp phổ kếthợp - Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng liệu vân tay sắc kýcủa củ gấu, củ gấu biển sở thị hóa học, xác định hàmlượng số hoạt chất mẫu củ gấu, củ gấu biển vàdượcliệuHươngphụthuthậpởnhữngđịađiểmkhácnhau Ýnghĩakhoahọcvànhữngđónggópcủaluậnán 3.1 Ýnghĩakhoa học Luận án đóng góp hiểu biết thành phần hóa học vàsắc ký dấu vân tay loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển ViệtNam Ứng dụng phương pháp vật lý đại nghiên cứu cấutrúchóahọccủacáchợpchấthữu 3.2 Nhữngđónggóp mớicủaluậnán Hai loài củ gấu củ gấu biển Việt Nam lần đầu nghiên cứumộtcáchcóhệthốngvềthànhphầnhóahọcvàdấuvântaysắcký 3.2.1 Vềthànhphần hóahọc ● Từ củ gấu (Cyperus rotundusL.) phân lậpv x c đ ị n h đ ợ c cấutrúchóahọccủa15hợpchấtlà(±)-3,5,6,7,8,4hexahydroxyflavane(CR1),(+)Catechin( C R ) ,E r i o d i c t y o l (CR3),Luteolin(CR4),7,4dihydroxy-5,3-dimethoxyflavone(CR5), HovetrichosideC(CR6), Piceatannol(CR7),Resveratrol(CR8),trans-ScirpusinA(CR9),transScirpusinB(CR10),Cassigarol E(CR11), Cyperusol C (1β,4αdihydroxyeudesman-11-ene)(CR12),1β,4β-dihydroxyeudesman-11ene(CR13),5,7-dihydroxychromone(CR14), (+)-lyoniresinol 3a-Oβ-D-glucoside(CR15).Trongđó,hợpchất(±)-3,5,6,7,8,4′hexahydroxyflavane(CR1)là hợpchất ● Từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferusRetz.) phân lập xácđịnhđượccấutrúchóahọccủa12hợpchất,đólà(S)-5,5,7-trihydroxy2,4-dimethoxy-6-methylflavanone(CS1),Rengasin(CS2),Mangostin(CS3),(±)-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane(CS4),(+)Catechin(CS5),Eriodictyol(CS6),Luteolin(CS7),Piceatannol (CS8), Resveratrol (CS9),trans-Scirpusin A (CS10),trans-Scirpusin B (CS10), Cyperusol C (1β,4α-dihydroxyeudesman-11-ene) (CS12) Trong số 12 hợp chất hợp chấtCS1 ((S)-5,5′,7-trihydroxy2′,4′-dimethoxy-6-methylflavanone)làhợpchấtmới  Trong số 12 chất phân lập từ củ gấu biển có hợp chất trùngvớicácchấtphânlập đượctừcủ gấu 3.2.2 Vềsắckýdấuvântay: - Sosánhthànhphầnhốhọccủa2lồiC.rotundusvàC.stoloniferusdựa theo kết phân lập xác định cấu trúc hợpchất kết hợp với phân tích hệ thống sắc ký HPTLC vàHPLC - ThiếtlậpđượccácđiềukiệnphântíchdấuvântaysắckýbằngHPLC.Đánhgi áđộtươngđồnggiữacácmẫunghiêncứutrênkỹthuậtHPLC.Kếtquảchothấ ycóđộtươngđồngcaocủacácmẫuthânrễcủgấubiểnlấy từ địa phương khác (từ 0,9424 đến 0,9903) Xác địnhvùngtrênsắckýđồ(từphút thứ8đếnphútthứ 20)choviệcnhậndạngdấuvântaysắckýđểcóthểphânbiệthailồi - Xâydựngđượcđiềukiệnđịnhlượng7thànhphầnhoạtchấttrongđốitượngn ghiêncứutrênhệthốngHPLCbằngviệcsửdụngcácchấtsạchđãphânlậpđược làmchấtđốichứng Bốcụccủaluậnán Luận án dày 146 trang với 34 bảng số liệu, 101 hình 174 tài liệuthamkhảođượctrìnhbàynhưsau: Mục lục, Danh mục kí hiệu chữ viết tắt, Danh mục bảng,Danh mục hình ảnh, đồ thị Mở đầu (2 trang) Chương 1: Tổngquan(33trang).Chương2:Đốitượng vàphươngphápnghiêncứu(4trang).Chương3:ThựcnghiệmvàKếtquả(17trang) Chương4:KếtquảvàBànluận(72trang).Kếtluậnvàkiếnnghị(2trang).Danh mụccác cơng trình liên quan đến luận án (1 trang) phần tài liệu thamkhảo(15trang),ngồiraluậnáncịncóphầnphụlụcgồmcácphổcủacáchợ pchấtphânlậpđược,kếtquảphântíchsắckýdấuvântay II NỘI DUNGLUẬN ÁNMỞĐẦU Phầnmởđầuđềcậpđếnýnghĩakhoahọc,tínhthựctiễn,đốitượngvànhiệmvụnghi êncứucủaluậnán CHƯƠNG1.TỔNGQUAN GiớithiệusơlượcvềthựcvậthọCói(Cyperaceae) Giớithiệu vềchiCyperusL., nghiên cứu cơng dụng, hoạt tính sinh học, thànhphầnhóahọcvàsắckýdấuvântaycủachiCyperusL Giới thiệu sơ lược củ gấu củ gấu biển Các nghiên cứu cơngdụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học sắc ký dấu vân taytạiViệtNamvàtrênthếgiớicủacủ gấuvàcủ gấu biển CHƯƠNG2.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Mẫuthựcvật Củ gấu (Cyperus rotundusL.) thu hái Đông Anh, Hà Nội vàcủ gấubiển(Cyperus stoloniferusRetz.) thu hái Tiền Hải,TháiBình Cácmẫu đượcgiámđịnhbởiPGS.TS.TrầnHuyThái Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký bao gồm 06 mẫu củ gấu, 06 mẫucủ gấu biển 04 mẫu dược liệu Hương phụ thu thậpv o tháng3năm2015 từcácđịađiểmkhácnhau 2.2 Phươngphápphânlậpcáchợpchất Mẫu thân rễ củ gấu củ gấu biển sơ chế, phơi khơ bóngrâm,xaynhỏ,chiếtsiêmvớimethanol.Dịchchiếtcơcạndướiápsuất giảm thu cặn chiết methanol Hòa cặn chiếtvớin c , chiết phân bố cặn chiết thân rễ củ gấu bằngn-hexane, cặn chiết thânrễcủgấubiểnbằngchloroformsauđólàethylacetatethuđượccác cặn chiếtn-hexane, chloroform tương ứng, cặn chiết ethyl acetate vàcặnnước Sắc ký cột tiến hành với pha tĩnh Silica gel 60 pha đảoRP-18, nhựatraođổiionDiaionHP-20, Sephadex LH-20 2.3 Phươngpháp xácđịnhcấutrúchóahọccáchợp chất Sử dụng phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổkhối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều ( 1H-NMR,13CNMR,DEPT),vàhaichiều (HSQC, HMBC,NOESY) 2.4 Phươngpháp xâydựngdấuvântaysắcký Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng phân tích sắc kýlỏnghiệunăng cao CHƯƠNG3.THỰCNGHIỆMVÀKẾTQUẢ 3.1 Chiếtvàphânlập chấttừ thânrễcủgấu Hình3.1 Sơđồchiết phânbốmẫuthânrễcủgấu Hình3.2.Sơđồphânlậpcặnchiếtn-hexanecủathânrễcủgấu Hình3.3.Sơđồphânlậpcặnchiếtethylacetatecủathânrễcủgấu Hình3.4.Sơđồphânlậpcặnnướccủathânrễcủgấu Thơngsốvậtlývàdữkiệnphổcủacáchợpchấtđượcphânlậptừcủgấu HợpchấtCR1:(±)-3,5,6,7,8,4′-hexahydroxyflavane(Hợpchất mới) Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45(chloroform:methanol5:1v/v),hiệnvết 25 bằngthuốcthửH 2SO410%.[] =0,0 (c0,1, MeOH) D IRmax(KBr):3400,1620,1530,1470,1150 cm-1 H-NMR( 00 M H z , C D 3OD):7,23( H , d, J = , H z , H - ' , ' ) , 6,80(2H,d,J=8,0Hz,H-3',5'),4,60(1H,d,J=8,0Hz,H-2),3,99 (1H,m,H-3),2,89(1H,dd,J=5,5,16,5Hz,H b-4),2,52(1H,dd,J =8,0,16,5 Hz,Ha-4) 13 C-NMR(125MHz,CD3OD):82,8(C-2),68,8(C-3),28,8(C-4), 158,3( C - ) , , ( C - ) , , ( C - ) , , ( C 8),156,9(C-9), 100,9(C-10),131,5(C-1'),129,6(C-2'),1 , (C-3'),156,9(C-4'), 116,0(C-5'),129,6(C-6') HR-ESI-MSm/z:307,0810[M+H]+ (calcd.307,0818choC15H15O7) HợpchấtCR2:(+)-catechin Tinh thể màu trắng, mp 173-175 oC SKLM pha thường: Rf= 0,35(chloroform:methanol:nước 5:1:0,01 v/v), vết UV 254 nmvàthuốcthử H2SO410% []25D=+17 (c0,1, CH3COCH3) H-NMR (500 MHz,DMSO-d6):6,72(1H,brs , H - ' ) , 6,68 (1H, d, J=8,0Hz,H-5'),6,59(1H,d,J=8,0Hz,H-6'),5,89(1H,brs,H6),5,70(1H,brs,H-8),4,48(1H,d,J=7,5Hz,H-2),3,83(1H,m, H-3),2 ,6 (1 H , dd , J =5,0, 16 ,0 Hz,H a-4),2,35( H, dd , J =8 ,0 , 16,0 Hz,Hb-4) 13 C-NMR(125MHz,DMSO-d6):81,1(C-2),66,5(C-3),27,9(C4),1 , ( C - ) , , ( C - ) , , ( C - ) , , ( C 8),155,5(C-9), 99,3( C - ) , , ( C - ' ) , 1 , ( C - ' ) , , ( C 3'),145,0(C-4'), 115,3(C-5'),118,6(C-6') ESI-MS(positive)m/z291[M+H]+ HợpchấtCR3:eriodictyol Chấtbộtmàu vàng nhạt SKLM phathường:R f= 0,45(chloroform:methanol4:1v/v),hiệnvếtbằngthuốcthửH2SO410% H-NMR(500MHz,CD3OD):6,93(1H,s,H-2'),6,80(2H,m,H5',H-6'),5,85(1H,d,J=2,0Hz,H-8),5,83(1H,d,J=2,0Hz,H6),5,28(1H,dd,J=3,0,12,5Hz,H-2),3,05(1H,dd,J=13,0,17,0 Hz,Hb-3),2,69(1H,dd,J= 3,0,17,0Hz,Ha-3) 13 C-NMR (125MHz,CD3OD):80,4(C-2), 44,0(C-3), 197,6(C-4), 165,3(C-5),97,0(C-6),168,6(C-7),96,2(C-8),164,7(C-9),103,2 (C-10),131,7(C-1'),114,7(C-2'),1 , (C-3'),146,8(C-4'),116,2 (C-5'),119,2(C-6') ESI-MS(positive)m/z289[M+H]+ HợpchấtCR4:luteolin Chấtbộtmàuvàng.SKLMphathường:Rf=0,45(chloroform:methanol:nư ớc 10:1:0,01 v/v), vết UV 254nmvàthuốcthử H2SO410% H-NMR( 00 M H z , D M S O - d6):7 , ( H , d , J = ,5 H z , H - ' ) , 7,24(1H,brs , H-2'),6,65(1H,d,J=8,5Hz,H-5'),6,38(1H,brs, H-6), 6,19 (1H, brs, H-8), 5,93(1H, s, H-3) 13 C-NMR(125MHz,DMSO-d6):166,4(C-2),102,1(C-3),181,2 (C-4),161,3(C-5),99,3(C-6),163,7(C-7),94,1(C-8),157,4(C-9), 102,7(C-10),120,4(C-1'),112,8(C-2'),146,2 (C-3'),151,2(C-4'), 116,0(C-5'),118,8(C-6') ESI-MS(positive)m/z287[M+H]+ HợpchấtCR5:7,4′-dihydroxy-5,3′-dimethoxyflavone Chấtbộtmàuvàng.SKLMphathường:Rf=0,45(chloroform:methanol:nư ớc 10:1,5:0,01 v/v), vết UV 254,366nmvàthuốcthử H2SO410% H-NMR( 00 MHz,CD 3OD):7,48 ( H, d d , J=2,0,8 , H z , H6'),7,45(1H,d,J=2,0,H-2'),6,94(1H,d,J=8,0Hz,H-5'),6,58 (1H, d,J= 2,0, H-8), 6,57 (1H, s, H-3), 6,43 (1H, d,J= 2,0, H-6),3,97 (3H, s,OCH3), 3,91 (3H,s, OCH3) ESI-MS(positive)m/z315[M+H]+ HợpchấtCR6:hovetrichosideC Chấtbộtmàuvàng.SKLMphathường:Rf=0,35(chloroform:methanol:nư ớc 3,5:1:0,01 v/v), vết thuốc thửH 2SO410% []25D=-18,0 (c0,1,MeOH) H-NMR (500MHz,DMSO-d6):6,92(2H, d,J=8,0Hz,H - ' , H6'),6,54(2H,d,J=8,0Hz,H-3',H-5'),5,99(1H,s,H-5),5,91(1H, s,H - ) , , ( H , d , J = , H z , H - ' ' ) , , - , ( H , m , H 6''), 3,25( H , m , H - ' ' ) , , ( H , m , H - ' ' ) , , ( H , m , H ' ' ) , , (1H,m, H-4''), 2,90 (2H, m, H-b) 13 C-NMR(125MHz,DMSO-d6):105,5(C-2),192,3(C-3),101,3 (C-3a),156,7 ( C - ) , 95,1 (C-5),169,0 ( C - ) , 91,5 ( C - 7) , 171,8 ( C 7a),40,4(C-b),124,1(C-1'),131,2(C-2',C-6'),1 , (C-3',C5'), 155,8( C - ' ) , 9 , ( C - ),7 , ( C - ),7 , ( C ),6 , ( C - ), 77,1(C-5),60,3(C-6) ESI-MS(positive)m/z451[M+H]+ HợpchấtCR7:piceatannol Chấtbộtmàutrắng.SKLMphathường:R f=0,3(chloroform:methanol 4:1 v/v), vết UV 254, 366 nm vàthuốcthử H2SO410% H-NMR (500 MHz, CD3OD):6,99 (1H, d,J= 2,0 Hz, H-2), 6,92(1H,d,J=16,0Hz,H-β),6,85(1H,dd,J=2,0,8,0Hz, H-6),6,77 (1H,d,J=16,0Hz,H-α),6,76(1H,d,J=8,0Hz,H-5),6,45(2H, d,J=2,5Hz,H-2,H-6), 6,17(1H, t,J=2,5Hz, H-4) Hình3.8.Sơđồphânlậpcặnnướccủathân rễcủgấubiển Thơngsốvậtlývàdữ kiệnphổc ủ a cáchợp chấtphânlậptừcủ gấubiển HợpchấtCS1:(S)-5,5′,7-trihydroxy-2′,4′-dimethoxy-6methylflavanone(Hợpchất mới) Chấtbộtmàuvàng.SKLMphathường:Rf=0,5(chloroform-methanolnước 5:1:0,05 v/v), vết UV 254 nm thuốc thửH2SO410% []25D=– 88,0 (c0,1, MeOH) CD(c1,4×10–3M,MeOH):λmax(∆ε)nm295(–13,7),345(+2,1) IRmax(KBr):3393,1637,1516,1303,1158cm-1 H-NMR(500MHz,CD3OD):7,00(1H,s,H-6'),6,69(1H,s,H-3'), 5,97(1H,s,H-8),5,60(1H,dd,J=3,0,13,0Hz,H-2),3,90(3H,s, OCH3),3,83(3H,s,OCH 3),2,95(1H,dd,J=13,0,17,0Hz,H b-4), 2,68(1H,dd,J=3,5,17,5Hz,Ha-4),1,97(3H,s,CH3) 13 C-NMR(125MHz,CD 3OD):75,2(C-2),43,4(C-3),198,0(C4),1 , ( C - ) , , ( C - ) , 66 ,1 ( C - ) , 5, ( C - ) , , ( C 9), 103,0( C- 10) , 20 ,5 ( C- 1' ), 51 ,2 ( C- 2' ), , ( C ' ) , 149,5 ( C - 4' ) , 141,4 (C-5'), 114,5 (C-6'), 6,9(6-CH3), 56,9 (2'-OMe), 56,6 (4'-OMe) HR-ESI-MSm/z:347,1109[M+H]+(calcd.347,1130choC18H19O7) HợpchấtCS2:3′,4′,6-trihydroxy-4-methoxyaurone Chấtbột màuvàng SKLM pha thường: R f= 0,45 (chloroformmethanol-nước 10:1:0,01 v/v), vết UV 254, 366 nm vàthuốcthử H2SO410% H-NMR(500MHz,acetone- d6):δ7,52 (1H,d,J=2,0Hz,H-2’), 7,27(1H,dd,J =2,0, 8,5Hz, H-6’), 6,90(1H,d,J=8,5Hz,H-5’), 6,51(1H,s,H-10),6,40(1H,d,J=2,0Hz,H-7),6,24(1H,d,J= 2,0 Hz,H-5), 3,89(3H,s, 4-OCH3) 13 C-NMR(125MHz,acetone-d6):δ147,3(C-2),179,8(C-3),160,7 (C-4),95,2(C-5),168,1(C-6),92,2(C-7),169,3(C-8),104,9(C-9), 110,7(C-10),1 , (C-1'),118,4(C-2'),146,1(C-3'),147,9( C - ' ) , 116,4(C-5'), 125,1(C-6'), 56,3(4-OCH3) ESI-MS(positive)m/z301[M+H]+ HợpchấtCS3:α-mangostin Chấtbộtmàuvàngnhạt.SKLMphathường:Rf=0,35(chloroformmethanol15:1v/v), vếtbằng thuốcthử H2SO410% H-NMR( 0 M H z , a c e t o n e - d6): , ( H , s , C - O H ) , , 5 (2H,b r s , C - - O H , C - - O H ) , , ( H , s , H 1),6,38(1H, s,H-8), 5,27(1H,m,H-2,H-2),4 , 1 (2H,d,J=6,5,H - ),3,79(3H,s, 3-OCH3), 3,33 (2H, d,J=7,0, H-1), 1,82 (3H,s, H-4), 1,78 (3H, s, H-4),1,65 (3H,s, H-5), 1,64(3H,s, H-5) 13 C-NMR( M H z , a c e t o n e - d6): 102,6 (C-1),1 , ( C 1a), 156,1( C - ) , 4 , ( C - ) , , ( C - ) , 1 , ( C 4a),161,6(C-5), 103,6( C - a ) , 1 , ( C - ) , , ( C - ) , 93,1( C - ) , 5 , ( C 8a), 182,8( C - ) , , ( C - ),1 , ( C - ),1 , ( C ),1 , ( C - ), 25,8( C - ),2 , ( C - ),1 , ( C - ),1 , ( C - ),1 , ( C ), 25,8 (C-5), 61,3 (3-OCH3) ESI-MS(positive)m/z411[M+H]+ Hợp chất CS4 (trùng với CR1): (±)-3,5,6,7,8,4′hexahydroxyflavane Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45(chloroform:methanol5:1v/v),hiệnvếtbằngthuốcthửH2SO410% ESI-MSm/z:307[M +H]+