Tuyển chọn chủng pseudomonas syringae có khả năng sinh syringomycin e

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học -Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch hướng dẫn ThS Nguyễn Ngọc Huyền Với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS Nguyễn Ngọc Huyền, người định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, bảo tận tình ln đồng hành giúp đỡ tơi q trình hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn tới tồn thể cán nhân viên làm việc Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ sau thu hoạch, người giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thời gian thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội, giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học tập phấn đấu trường Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè giúp đỡ ủng hộ suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2015 Người thực Vũ Thị Nhàn SV: Vũ Thị Nhàn i Lớp: KSCNSH - 1103 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU v DANH MỤC HÌNH VẼ vi MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 2.2 Nội dung nghiên cứu PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan SRE 1.3 Cơ chế tác động Syringomycin E tới vi sinh vật gây bệnh 1.4 Cơ chế sinh tổng hợp SRE 1.5 Đặc điểm chủng vi sinh vật sinh Syringomycin E 1.5.1 Đặc điểm hình thái 1.5.2 Đặc điểm nuôi cấy 1.5.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa 1.6 Nguồn phân lập P syringae 1.7 Sản xuất SRE từ vi sinh vật 10 1.8 Ứng dụng SRE 13 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.4 Thiết bị dụng cụ 16 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phân lập Pseudomonas sp từ 17 2.2.2 Phân lập Pseudomonas sp từ mận mơ 17 2.2.3 Giữ giống cấy truyền 17 2.2.4 Khảo sát tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả sinh syringomycin E 17 2.2.4.1 Phương pháp cấy trực tiếp 18 SV: Vũ Thị Nhàn ii Lớp: KSCNSH - 1103 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.2.4.2 Phương pháp khuyếch tán thạch 18 2.2.4.3 xây dựng đường chuẩn cho xác định hoạt tính SRE 19 2.2.5 Định loại vi khuẩn Pseudomonas syringae theo khóa phân loại Bergey 20 2.2.5.1 Đặc điểm hình thái 20 2.2.5.2 Đặc điểm sinh lý , sinh hóa 21 2.2.6 Xác minh SRE dịch lên men phương pháp HPLC 24 2.2.7 Định loại vi khuẩn Pseudomonas sp.theo phương pháp sinh học phân tử 25 2.2.7.1 Tách chiết ADN tổng số 25 2.2.7.2 Khuyếch đại đoạn ADN phản ứng PCR 26 2.2.7.3 Điện di gel agarose 26 2.2.7.4 Đọc trình tự đoạn gen chứa vùng gen đặc hiệu 27 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Phân lập chủng Pseudomonas sp từ 28 3.2 Xác định chọn lọc chủng Pseudomonas sp có khả sinh syringomycin E cao 29 3.2.1.Sàng lọc chủng Pseudomonas sp có khả sinh SRE 29 3.2.2 Tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả sinh SRE 33 3.3 Đặc điểm chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 34 3.4 Xác minh SRE từ dịch lên men chủng PS 120 PS 52 HPLC 39 3.5 Xác định chủng Pseudomonas tuyển chọn phương pháp sinh học phân tử 42 3.5.1 Tách chiết DNA tổng số từ chủng PS 120 42 3.5.2 Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN chủng P.syringae PS120 kỹ thuật PCR 43 3.5.3 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa vùng 16S-rARN chủng P syringae PS 120 43 PHẦN IV: KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 SV: Vũ Thị Nhàn iii Lớp: KSCNSH - 1103 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp CHỮ VIẾT TẮT g/l : gam/lít L/m : litter/minute U/ml : Unit/milliliter Da : Dalton µl : microliter FAO : Food and Agriculture organization (Tổ chức Nông lương giới ) kDa : kilodalton SV: Vũ Thị Nhàn iv Lớp: KSCNSH - 1103 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.3.Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR 26 Bảng 3.1.Kết phân lập chủng Pseudomonas sp từ 28 Bảng 3.2.Khả sinh tổng hợp syringomycin chủng Pseudomonas sp phân lập 29 Bảng 3.3 Xác định hoạt tính SRE chủng Pseudomonas sp tuyển chọn 33 Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái chủng Pseudomonas sp phân lập 35 Bảng 3.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Pseudomonas sp 38 Bảng 3.6 Định lượng DNA tổng số 42 Bảng 3.7 Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự gen mã hóa 16S rADN chủng P.syringae PS 120 với loài vi khuẩn GenBank 46 SV: Vũ Thị Nhàn v Lớp: KSCNSH - 1103 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1.Cơng thức cấu tạo Syringomycin E Hình 1.2 Cấu trúc SRE Hình 1.3 Khuẩn lạc P.syringae môi trường King B phát quang ánh sáng tia cực tím bước sóng 365 nm Hình 1.4 P.syringae kính hiển vi điện tử Hình 2.1 Đường chuẩn biểu thị mối tương quan đường kính vịng kháng nấm G.Candidum đơn vị SRE khác 20 Hình 3.1 Tỷ lệ chủng Pseudomonas sp phân lập có khả sinh syringomycin 31 Hình 3.2 Khả sinh tổng hợ SRE chủng Pseudomonas sp Phân lập 32 Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc tế bào chủng Pseudomonas PS 120, Pseudomonas PS 52 P.syringae ATCC 55389 36 Hình 3.4 Chủng Pseudomonas PS 120 (A), Pseudomonas PS 52 (B) P.syringae ATCC 55389 (C) phát quang môi trường King B ánh sáng tia cực tím bước sóng 365 nm 37 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu SRE chuẩn (hãng Sigma) 40 Hình 3.6 Sắc ký đồ dịch lên men chủng PS 120 40 Hình 3.7 Sắc ký đồ dịch lên men chủng PS 52 41 Hình 3.8 Hình ảnh ADN tổng số chủng vi khuẩn P.syringae PS 120 gel agarose 1% 42 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rARN 43 chủngP syringae PS 120 43 Hình 3.10 Trình từ gen 16S rADN chủng P.syringaePS 120 44 Hình 3.11 Sơ đồ phát sinh lồi chủng P.syringae PS 120 sử dụng cơng cụ BLAST NCBI 45 SV: Vũ Thị Nhàn vi Lớp: KSCNSH - 1103 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Nơng sản q trình bảo quản thường bị số vi sinh vật gây hại, chủ yếu vi sinh vật côn trùng Hoạt động mạnh mẽ vi sinh vật gây tổn thất lớn cho nông sản giai đoạn sau thu hoạch, tổn thất nấm mốc chiếm phần đáng kể Theo công bố FAO, 25% đến 50% nông sản toàn giới nhiễm độc tố Qua nghiên cứu cho thấy, ngô, lạc cà phê thường nhiễm loại nấm mốc Aspergillus spp; Fusarium spp, Penicillium spp, Rhizopus spp, A niger….Ngoài việc gây tổn thất lượng cho nơng sản, cịn sinh độc tố đặc biệt nguy hiểm với người động vật kinh tế Trong A flavus A Parasiticus lồi có khả sinh độc tố aflatoxin mạnh nhất, độc tố tích tụ gan người, động vật không bị phân hủy nhiệt độ cao A ochraceus, A niger P viridicatum có khả sinh độc tố A ochatoxin Ngoài ra, số loại nấm Fusanium có khả sinh độc tố trichothecen fumonisin Hàm lượng aflatoxin nhiễm nhiều mẫu ngô, lạc cà phê vượt ngưỡng giới hạn cho phép tiêu chuẩn Việt Nam quốc tế Ở nước ta sử dụng khoảng 200 loại thuốc trừ sâu, 83 loại thuốc trừ nấm, 52 loại thuốc trừ cỏ…Những hóa chất nằm danh mục cho phép sử dụng bảo quản nông sản nhóm pyvethroit, malathion, sumithion, DDVP, acetelic 2D, cacbon dioxit, monocrotophos, cypermethrin Tuy nhiễn, theo kiểm tra quan chức hóa chất thường sử dụng vượt lượng cho phép nhiều lần (http:// www Hoahocngaynay.com) Việc sử dụng thuốc hóa học khơng hợp lý, sử dụng lâu dài kéo theo vấn đề như: ảnh hưởng tới sức khỏe người động vật, tăng khả hình thành tính kháng thuốc sâu bệnh, tiêu diệt hệ thiên địch, phá vỡ cân sinh học, gây hậu xấu tới môi trường Các nhà khoa học giới nỗ lực nghiên cứu để tạo giống chuyển gen để kháng bệnh, việc tìm kiếm cơng nghệ sản xuất chất sinh học khơng độc hại để phịng trừ nấm sinh độc tố trồng hạt nông sản phương pháp kiểm soát hàng đầu SRE hợp chất sinh học có phổ diệt nấm rộng ứng dụng loại thuốc bảo quản nơng sản trái SRE có khả diệt đến 95% SV: Vũ Thị Nhàn Lớp: KSCNSH - 1103 việc phòng chống số loại nấm bệnh nấm sinh độc tố Aspergillus spp, Fusarium spp, Penicillium spp, điển hình A.flavus, A.niger, F moniliforme Ngồi có khả tiêu diệt số chủng vi sinh vật gây bệnh B.cinerea, G.venevia…ở nước ta việc nghiên cứu sản xuất SRE để bào quản cịn vấn đề mẻ Viện điện nơng nghiệp công nghệ sau thu hoạch đơn vị tiến hành đề tài nghiên cứu cấp nhà nước “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học syringomycin E (SRE) Rhamnolipid (RL) diệt nấm để bảo quản số trái hạt nông sản.” Trong khuôn khổ luận văn tốt nghiệp, tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Tuyển chọn chủng Pseudomonas syringae có khả sinh syringomycin E” MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Tìm 1-2 chủng Pseudomonas syringae có khả sinh tổng hợp SRE cao - Xác định tên lồi chủng Pseudomonas PS 120 phân tích trình tự gen 16S rRNA 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập chủng Pseudomonas sp từ mẫu - Khảo sát tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả sinh syringomycin E từ chủng phân lập - Nghiên cứu đặc điểm chủng tuyển chọn dựa theo khóa phân loại Bergey - Định danh chủng Pseudomonas tuyển chọn phương pháp sinh học phân tử + Tách DNA tổng số Pseudomonas PS 120 + Khuếch đại gen mã hóa 16S rRNA kĩ thuật PCR + Đọc trình tự đoạn gen chứa vùng gen đặc hiệu + So sánh trình tự đoạn DNA chủng nghiên cứu chương trình Nucleotide Blast SV: Vũ Thị Nhàn Lớp: KSCNSH - 1103 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan SRE Syringomycin E (SRE) chất nghiên cứu nhiều họ lipodepsipeptide sinh tổng hợp số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas đặc biệt chủng Pseudomonas syringae pv.syringae Cấu trúc phân tử SRE peptit vòng, tạo thành amino axit hydroxy axit béo chứa 12 nguyên tử C dạng amide (A Segre et al., 1989; N Fukuchi, 1992) Công thức phân tử SRE: C53H85ClN14O17 , khối lượng phân tử M= 1225,78 thể hình 1.1 Hình 1.1.Cơng thức cấu tạo Syringomycin E Syringomycin E chứng minh đóng vai trị quan trọng tương tác vi khuẩn- thực vật khả làm tăng tính độc vi khuẩn thử nghiệm in vitro (N.S Iacobellis et al, 1992) Bên cạnh đó, SRE có đặc điểm bật khả diệt nấm, đặc tính phụ thuộc vào có mặt Cl đầu C cấu trúc protein SRE (I Grgurina et al, 1994) Tính chất sử dụng phương pháp diệt nấm biện pháp sinh học với chủng nấm Geotrichum candidum, SV: Vũ Thị Nhàn Lớp: KSCNSH - 1103 Rhodotorula pilimance, Botrytis cinerea, Fusarium, Pythium ultimum, Rhizoctonia, Trichophyton Greeneria sp., uvicola Curvularia ,Aspergillus brachyspora, japonicus, Nigrospora Mucor sp., sphaerica, Penicillium thomii Penicillium sclerotiorum Là loài thường gây thối hỏng sau thu hoạch Độc tính SRE tế bào HeLa (dòng tế bào nghiên cứu người) thường gấp 20 lần nồng độ SRE để diệt 95% nấm gây bệnh SRE có khả diệt bào tử nấm nảy mầm Aspergillus sp.và Fusarium sp hiệu peptide khác cecropin A, cecropin B dermaseptin Kết thử độc tính chuột độc tính với tế bào SRE có tiềm phát triển thành sản phẩm thương mại Do SRE sinh tổng hợp vi khuẩn Pseudomonas tiết dịch ni Vì để tách chiết thu nhận kháng sinh SRE từ dịch lên men, nguyên tắc quan trọng dựa vào tính chất chất kháng sinh tạo thành sau lên men gồm có: i) tính chất hóa học chất kháng sinh dạng chất bazơ yếu, axit yếu, chất trung hòa điện tích, dạng phân cực khơng phân cực; ii) tính chất vật lý kháng sinh gồm: tính tan kháng sinh, độ bền pH, độ bền nhiệt, độ bền loại dung mơi khác Từ tính chất kháng sinh để khảo sát áp dụng phương pháp thích hợp thu nhận kháng sinh với hiệu suất cao (Richard cộng 1998) 1.2 Cấu tạo tính chất SRE SRE có khối lượng phân tử 1240Kda Cấu trúc SRE gồm axit béo mạch dài, không phân nhánh chín axit amin khép vịng, ưa nước, tích điện dương Trình tự axit amin SRE là: Ser-Ser-Dab-Dab-Arg-Phe-Dhb-4(Cl)Thr3(OH)Asp, khép vịng nhóm β-carboxy đầu C nhóm OH đầu N nhờ q trình acetyl hóa xúc tác axit 3- hydroxydecanoic Syringomycin A1 G khác với SRE axit tương ứng 3- hydroxydecanoic 3hydroxytetradecanoic SV: Vũ Thị Nhàn Lớp: KSCNSH - 1103 A B C Hình 3.4 Chủng Pseudomonas PS 120 (A), Pseudomonas PS 52 (B) P.syringae ATCC 55389 (C) phát quang môi trường King B ánh sáng tia cực tím bước sóng 365 nm SV: Vũ Thị Nhàn 37 Lớp: KSCNSH - 1103 Bảng 3.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn Pseudomonas sp Khả Tên chủng Catalase Oxidase sinh Thủy phân gelatine levan Khả O/F Arginine Khử dihydrolase nitrat Sắc tố phát quang Gây thối khoai tây Khả di động PS 120 - - + + O - - + - + PS 89 - - + + O - - + - + PS 52 - - + + O - - + - + PS 32 - - + + O - - + - + PS 25 - - + + O - - + - + syringae - - + + O - - + - + P ATCC 55389 (+): Phản ứng dương tính (-) : Phản ứng âm tính (O): Oxy hóa SV: Vũ Thị Nhàn 38 Lớp: KSCNSH - 1103 Viện Đại Học Mở Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Sau quan sát hình thái phản ứng sinh lý, sinh hóa, chúng tơi thấy chủng vi khuẩn PS 120, PS 52, PS 89, PS 32, PS 25 có đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa giống với đặc điểm lồi P.syringae miêu tả khóa phân loại Bergey giống với chủng chuẩn P.syringae VTCC 55389: Gram âm, khuẩn lạc có màu trắng kem, trịn nhẵn, kích thước tế bào 0,41 x 1,4-2,1 µm, khơng tạo bào tử, có khả di động, có khả sinh levan, thủy phân gelatin, catalase (+), oxidase (-), khả trao đổi carbonhydrate theo phương thức oxy hóa, arginine dihydrolase (-), khơng khử nitrat, phát quang ánh sáng cực tím 365 nm, khơng gây thối khoai tây Kết phù hợp với kết nghiên cứu Mohammadi cộng (2001) Tác giả phân lập 27 chủng vi khuẩn từ mơ, xuân đào, đào, mận, mô thối mục cherry chua cherry tỉnh Tehran Các chủng vi khuẩn phân lập có khả hóa lỏng gelatin, thủy phân aesculin, oxidase catalase âm tính, khơng có khả gây thối khoai tây Tất chủng sinh chất màu huỳnh quang môi trường King B, âm tính với arginine dihydrolase, sinh levan, có khuẩn lạc hình vịm, màu trắng kem mơi trường NA sinh syringomycin Các chủng sau phân tích 16S rRNA xác định P.syringae pv syringae Do để khẳng định chắn chủng vi khuẩn P.syringae, cần tiếp tục định loại vi khuẩn phương pháp phân tích trình tự gen 16S rRNA Sau kết hợp với đặc điểm phân loại Bergey để đưa tên xác chủng vi khuẩn cần cho nghiên cứu Chủng PS 120 PS 52 lựa chọn để phân tích HPLC nhằm xác minh hoạt chất sản sinh từ chủng SRE 3.4 Xác minh SRE từ dịch lên men chủng PS 120 PS 52 HPLC Chúng tiến hành chạy sắc ký đồ dịch lên men so sánh với SRE chuẩn (hãng Sigma- Mỹ), kết phân tích thể hình 3.6, 3.7 3.8 SV: Vũ Thị Nhàn 39 Lớp: KSCNSH - 1103 Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu SRE chuẩn (hãng Sigma) Hình 3.6 Sắc ký đồ dịch lên men chủng PS 120 SV: Vũ Thị Nhàn 40 Lớp: KSCNSH - 1103 Hình 3.7 Sắc ký đồ dịch lên men chủng PS 52 Sắc ký đồ hình 3.5 cho pic SRE chuẩn thời gian lưu 4,283 phút pic phụ sát pic Với sắc ký đồ hình 3.7 3.8 tương ứng với dịch lên men chủng PS 120 PS 52 cho nhiều pic tạp có pic trùng với thời gian lưu 4,281 4,278 phút SRE chuẩn Như phương pháp HPLC khẳng định chủng PS 120 PS 52 có sinh SRE *Phân tich hàm lượng SRE HPLC Dựa vào kết sắc ký đồ, phân tích dịch lên men cho trình tách chiết từ chủng P.syringae PS 120 thu số liệu sau: -Cc = 100 mg/l; -Sc=19440 mAU.s -Skn = 5870 mAU.s Áp dụng công thức phương pháp 2.2.5 tính dịch lên men chủng PS 120 có chứa SRE với hàm lượng Ckn = 30,2 mg/l Kết sắc ký đồ chủng P.syringae PS 52 thu số liệu sau: - Cc = 100 mg/l - Sc=19440 mAU.s - Skn = 5700 mAU.s Áp dụng công thức phương pháp 2.2.5 tính dịch lên men chủng PS 52 có chứa SRE với hàm lượng Ckn = 29,3 mg/l SV: Vũ Thị Nhàn 41 Lớp: KSCNSH - 1103 3.5 Xác định chủng Pseudomonas tuyển chọn phương pháp sinh học phân tử 3.5.1 Tách chiết DNA tổng số từ chủng PS 120 Chủng Pseudomonas PS 120 tiến hành nuôi cấy môi trường NB tách chiết ADN tổng số sử dụng Kit Tách chiết ADN: KIT Pure Link Genomic ADN mini Kit (Invitrogen), sau định lượng ADN thu cách đo quang phổ máy Biophotometer plus chương trình đo ADN Kết bảng 3.7 Bảng 3.6 Định lượng DNA tổng số Tỉ lệ A260/A280 Tỉ lệ A260/A230 Mẫu Chủng Pseudomonas PS 120 1,96 1,89 Nồng độ ADN (ng/µL) 1,99 Từ bảng 3.6 nhận thấy ADN chủng đem tách chiết ADN tổng số cho số A260/A280 khoảng 1,8 - 2,0 A260/A230 lớn 1,5 chứng tỏ quy trình tách chiết đảm bảo độ tinh cần thiết Để phân lập gen mã hóa vùng 16S- rARN từ chủng P.syringae PS 120, bước quan trọng phải thực tách chiết DNA hệ gen Độ tinh khiết cao, không bị đứt gãy DNA hệ gen điều kiện quan trọng để phản ứng PCR thu kết tốt Kết thực nghiệm điện di gel agarose 1%, ADN tách chiết nhuộm thuốc nhuộm SYBR Green (Hình 3.8) cho thấy chủng sau lần chạy có băng ADN sáng không bị đứt gẫy, chất lượng ADN đảm bảo độ tinh lượng phù hợp cho phân tích PCR 2 Hình 3.8 Hình ảnh ADN tổng số chủng vi khuẩnP.syringae PS 120 gel agarose 1% (chạy lặp lại lần) SV: Vũ Thị Nhàn 42 Lớp: KSCNSH - 1103 3.5.2 Khuếch đại đoạn gen 16S-rARN chủng P.syringae PS120 kỹ thuật PCR Sau có ADN genome từ chủng P.syringae PS 120, tiến hành phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu 16S rARN với cặp mồi B27F U1492R với chu trình nhiệt nêu phần phương pháp Kết điện di đồ sản phẩm PCR thể hình 3.9 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rARN chủng P syringae PS 120 Ghi chú: - Chứng âm - Chủng P.syringae PS 120 - Thang chuẩn ADN (Intron) Từ hình 3.2 cho thấy sản phẩm PCR băng có trọng lượng phân tử khoảng 1465 bp, điều chứng tỏ khuếch đại gen 16S rARN 3.5.3 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa vùng 16S-rARN chủng P syringae PS 120 Sản phẩm sau trình PCR giải trình tự máy đọc trình tự gen tự động ABI 3100 PRISM (Perkin- Elmer) Kết phân tích trình tự cho thấy đoạn gen thu chủng P.syringae PS 120 có kích thước 1421 bp (hình 3.10) SV: Vũ Thị Nhàn 43 Lớp: KSCNSH - 1103 Hình 3.10 Trình từ gen 16S rADN chủng P.syringae PS 120 Trình tự chủng P.syringae PS 120 đưa lên ngân hàng gen sử dụng cơng cụ BLAST NCBI để phân tích Cây phát sinh lồi xây dựng dựa trình tự 16S rADN từ 1421 chủng nghiên cứu với loài gần gũi Quan sát phát sinh loài cho thấy chủng nghiên cứu nằm vị trí với lồi nhóm Pseudomonas syringae (hình 3.11) SV: Vũ Thị Nhàn 44 Lớp: KSCNSH - 1103 Hình 3.11 Sơ đồ phát sinh loài chủng P.syringae PS 120 sử dụng công cụ BLAST NCBI SV: Vũ Thị Nhàn 45 Lớp: KSCNSH - 1103 Bảng 3.7 Kết so sánh mức độ tương đồng trình tự gen mã hóa 16S rADN chủng P.syringae PS 120 với loài vi khuẩn GenBank Mã số truy cập Độ tương Tỉ lệ nucleotide GenBank đồng (%) tương đồng P syringae NBRC 14076 AB680548.1 99 P syringae RM29 AY574914.1 99 P syringae SQYB-1 JX876901.1 99 P syringae NBRC 14081 AB680553.1 99 P syringae ISF FR1 AM495723.1 99 P syringae pv syringae XJLX-2-2 KC816630.1 99 P syringae pv syringae XJLX-3-8 16SKC816629.1 99 P syringae pv syringae XJLX-3-7 KC816628.1 99 P syringae pv syringae XJLX-4-2 KC816626.1 99 Các loài vi khuẩn từ GenBank Từ kết thu kết luận: Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen 16S rARN chủng P.syringae PS 120 sau nhân lên đọc giải trình tự có tên lồi Pseudomonas syringae với độ tương đồng 99% Như vậy, kết định danh phương pháp sinh học phân tử hoàn toàn phù hợp với kết phân loại dựa đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa Sau kết hợp hai phương pháp phân loại theo khóa phân loại Bergey xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S r-ARN, chúng tơi khẳng định chủng PS 120 xác lồi Pseudomonas syringae ký hiệu P syringae PS 120 SV: Vũ Thị Nhàn 46 Lớp: KSCNSH - 1103 PHẦN IV: KẾT LUẬN - Từ 74 mẫu thu thập gồm 10 mẫu mận, 10 mẫu đào, 10 mẫu mơ, 20 mẫu cà chua, 12 mẫu mơ 12 mẫu mận, phân lập 31 chủng Pseudomonas sp phương pháp cấy trực tiếp sàng lọc 13 chủng Pseudomonas sp có hoạt tính kháng nấm trung bình (7-15 mm) kháng nấm mạnh (> 15 mm) - Đã xác định hoạt tính sinh syringomycin E sinh tổng hợp từ 13 chủng Pseudomonas sp lựa chọn, số có chủng PS 120, PS 25, PS 89, PS 32 PS 25 cho hoạt tính SRE cao chủng khác Hoạt tính SRE từ chủng PS 120, PS 52, PS 89, PS 32, PS 25 tương ứng 36 U/ml, 34 U/ml, 27 U/ml, 26 U/ml, 25 U/ml Các chủng cịn lại có hoạt tính syringomycin dao động từ 10-20 U/ml - Năm chủng PS 120, PS 52, PS 89, PS 32, PS 25 định danh quan sát đặc điểm hình thái phân tích đặc điểm sinh lý, sinh hóa theo khóa phân loại Bergey Kết định danh cho thấy chủng thuộc loài P syringae -Bằng phương pháp phân tích HPLC xác định chủng P syringae PS 120 P syringae PS 52 sinh syringomycin E với liều lượng 30,2 mg/l 29,3 mg/l - Bằng kĩ thuật PCR, đoạn gen 16S rDNA chủng P syringae PS 120 sau nhân lên có chiều dài 1421 bp trình tự nucleotide có độ tương đồng cao đạt tới 99% so sánh với trình tự đoạn gen chủng P syringae công bố Ngân hàng liệu gen Quốc tế - Kết định danh kĩ thuật sinh học phân tử phù hợp với kết định danh phương pháp sinh hóa truyền thống làm tăng tính khẳng định tên lồi cho chủng vi khuẩn nghiên cứu Đồng thời, chứng tỏ trình cấy chuyển trì ổn định đặc tính lồi, đảm bảo nguồn chủng tin cậy cho nghiên cứu SV: Vũ Thị Nhàn 47 Lớp: KSCNSH - 1103 TÀI LIỆU THAM KHẢO Anzai, Y., Kim, H., Park, J.Y and Wakabayashi, H (2000) Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50:1563-89 Burkholder, W.H (1930) The bacterial diseases of bean Cornell University of Agricultural Station Mem 127 P 88 Palleroni, N.J (1984) Genus I Pseudomonas migula Bergey’s manual of systematic bacteriology Pp 964 Young, J.M (1991) Pathogenicity and identification of the lilac pathogen, Pseudomonas syringae pv syringae van Hall 1902 Annual Applied Biology 118:283-298 Doudoroff, M and Palleroni, N.J (1974) Genus I Pseudomonas migula In: Buchanan, R E and Gibbons, N E (ed) Bergey’s manual of determinative bacteriology Pp 217-243 Baltimore, London: Williams and Wilkins 8th edition Pp 1268 Kaiser, W.J and Ramos, A.H (1980) Occurrence of Pseudomonas syringae on bean and soybean in Kenya Plant Disease 64:593-595 Palleroni, N.J (1984) Genus I Pseudomonas migula In: Krieg, N.R and Holt, J.G (ed) Bergey’s manual of systematic bacteriology Baltimore, London: Williams and Wilkins Pp 964 M.M López1, M Rosellóand A Palacio-Bielsa, (2010) Diagnosis and detection of the main bacterial pathogens of stone fruit and almond.Journal of Plant Pathology (2010), 92(1, Supplement), S1.57-S1.66 O Schmidt, U Moreth, D Dujesiefken, H StobbeandO Gaiser, (2009) Fast molecular detection ofPseudomonas syringaepv.aesculiindiseased horse chestnut trees.For Path 39 (2009) 343–348 10 Sambrook, J and Rusell, W D (2001) Molecular Cloning A Laboratory Manual Volume 3rd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York SV: Vũ Thị Nhàn 48 Lớp: KSCNSH - 1103 11 Segre, A., Bachmann, R.C., Ballio, A., Bossa, F., Grgurina, I., Iacobellis N S , Marino, G., Pucci, P., Simmaco, M and Takemoto, J Y (1989) The structure of syringomycins A1, E and G FEBS 07568 255 (1): 27-31 12 De-Lucca, A J., Jacks, T J., Takemoto, J., Vinyard, B., Petter, J., Navarro, E., Walsh, T J (1999) Fungal Lethality, Binding, and Cytotoxicity of Syringomycin-E Antimicrobial agents and chemotherapy 43(2): 371–373 13 Takemoto, J Y., Bensaci, M.,De Lucca, A J., Cleveland, T E.,Gandhi, N R.,andSkebba V P (2010) Inhibition of Fungi from Diseased Grape by Syringomycin E-Rhamnolipid Mixture.Am J Enol Vitic 61:1 14 Gross, D C., Devay, J E (1976) Population Dynamics and Pathogenesis of Pseudomonas syringae in Maize and Cowpea in Relation to the In Vitro Production of Syringomycin Journal of Physiology and Biochemistry, 475483 15 Neil, B Q and Dennis, C G (1994) Syringomycin Production among Strains of Pseudomonas syringae pv syringae: conservation of the syrB and syrC genes and Activation of Phytotoxin Production by Plant Signal Moleculas The American Phytopathological Society 7(1): 78-90 16 Sinden, S L., Devay, J E and Backmanp, A (1971) Properties of syringomycin, a wide spectrum antibiotic and phytotoxin produced by Pseudomonassyringae, and its role in bacterial canker-disease of peach trees Physiological Plant Pathology 1, 199-214 17 Mekki, F B (2009) The bioactive properties of syringomycin E Rhamnolipid mixtures and syringopeptins Degree of doctor of philosophy in Biology, 2009 18 Iacobellis, N.S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M and Ballio, A.(1992) Phytotoxic properties of Pseudomonas syringaepv syringaetoxins.Physiological and Molecular Plant Pathology 40:107-116 19 Bull, C T., Stack, J P., and Smilanick, J L (1997).Pseudomonas syringaestrains ESC-10 and ESC-11 survive in wounds on citrus and control green mold of citrus.Biol Control8,81–88 SV: Vũ Thị Nhàn 49 Lớp: KSCNSH - 1103 20 Anzai, Y., Kim, H., Park, J.Y and Wakabayashi, H (2000) Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50:1563-89 21 Burkholder, W.H (1930) The bacterial diseases of bean Cornell University of Agricultural Station Mem 127 P 88 22 Palleroni, N.J (1984) Genus I Pseudomonas migula Bergey’s manual of systematic bacteriology Pp 964 23 Young, J.M (1991) Pathogenicity and identification of the lilac pathogen, Pseudomonas syringae pv syringae van Hall 1902 Annual Applied Biology 118:283-298 24 Doudoroff, M and Palleroni, N.J (1974) Genus I Pseudomonas migula In: Buchanan, R E and Gibbons, N E (ed) Bergey’s manual of determinative bacteriology Pp 217-243 Baltimore, London: Williams and Wilkins 8th edition Pp 1268 25 DeVay, J.E., Lukezie, F.L., Sinden, S.L., English, H and Copling, D.L (1968) A biocide produced by pathogenic isolates of Pseudomonas syringae and its possible role in the bacterial canker disease of peach trees Phytopathology 58:95-10 26 Goszczynska, T and Serfontein, J.J (1998) Milk–Tween agar, a semiselective medium for isolation and differentiation of Pseudomonas syringae pv syringae,Pseudomonas pv syringae phaseolicola andXanthomonas axonopodis pv phaseoli Journal of Microbiological Methods 32:65-72 27 Kaiser, W.J and Ramos, A.H (1980) Occurrence of Pseudomonas syringae on bean and soybean in Kenya Plant Disease 64:593-595 28 Palleroni, N.J (1984) Genus I Pseudomonas migula In: Krieg, N.R and Holt, J.G (ed) Bergey’s manual of systematic bacteriology Baltimore, London: Williams and Wilkins Pp 964 29 Otta, J D., and English, H (1991) Serology and pathology ofPseudomonas syringae Phytopathology 61: 443-452 SV: Vũ Thị Nhàn 50 Lớp: KSCNSH - 1103 30 Mohammadi, M., Ghasemi, A and Rahimian, H (2001) Phenotypic Characterization of Iranian Strains of Pseudomonas syringaepv syringae van Hall, the Causal Agent of BacterialCanker Disease of Stone Fruit Trees J Agric Sci Technol Vol 3: 51-65 31 Katarina Gašić, Anđelka Prokić, Milan Ivanović, Nemanja Kuzmanović and Aleksa Obradović (2012) Differentiation of Pseudomonas syringaePathovars Originating from Stone Fruits Pestic Phytomed (Belgrade), 27(3), 2012, 219–229 32 Sinden, S L., DeVay, J E., and Backman, P A (1971) Properties ofsyringomycin, a wide spectrum antibiotic and phytotoxin producedby Pseudomonas syringae, and its role in the bacterial cankerdisease of peach trees.Physiol Pl Path.1,199–213 33 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology The Proteobacteria, Part B , The Gammaproteobacteria Second Edition, volume two, pp 327-374 34 Lelliott, R.A., and Stead, D.E (1987) Methodsfor the diagnosis of bacterial diseases ofplants In: Methods in Plant Pathology,Vol T.F Preece Series, British Societyof Plant Pathology, Blackwell ScientificPublications, Oxford 216 pp 35 Bradbury, J.F (1970) Isolation andpreliminary study of bacteria fromplants Rev of Plant Pathology49:213-218 SV: Vũ Thị Nhàn 51 Lớp: KSCNSH - 1103